專利名稱：一種雙重載藥的復(fù)合微球及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雙重載藥的復(fù)合微球及 其制備方法。
背景技術(shù)：
近年來，高分子微球材料的研究和應(yīng)用發(fā)展非常迅速。這類材料具有其特 殊的尺寸和形貌，具備其它形態(tài)材料所不具備的特殊功能?？偟恼f來，高分子 微球的應(yīng)用分為如下幾個領(lǐng)域納米技術(shù)、功能材料、分析領(lǐng)域、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng) 域等。高分子微球除具有固相載體特有的易于分離和提純的優(yōu)點外，還具有廉 價、比表面積大、單分散性好、易于制備及功能化等優(yōu)點。微球用于藥物載體 的研究開始于20世紀(jì)70年代中期，由于其對器官和組織的靶向性及藥物釋放
的緩釋性，已經(jīng)成為緩控釋給藥的研究熱點。微球可以供注射(靜脈注射、肌肉 注射)、口服、滴鼻、皮下埋植或是關(guān)節(jié)腔給藥使用。將藥物與微球載體連接制 備成藥物一一載體結(jié)合物，以改善和控制藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運和代謝，實現(xiàn)緩釋 給藥和定向給藥，從而提高藥物的生物利用度和治療指數(shù)，這是現(xiàn)代藥物研究 領(lǐng)域的一個新分支。
在人工合成高分子中，聚乳酸(PLA)及乳酸一羥基乙酸共聚物(PLGA)具有 良好生物相容性和生物降解性，它們的降解產(chǎn)物乳酸能參與人體的新陳代謝。 由于它們是人工合成的高分子，可通過控制分子量和單體共聚的比例來控制降 解時間，這使它們已成為當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最受重視的材料之一，并己被美國藥品食品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于人體。聚乳酸及其共聚物主要用于藥物控 制釋放體系、骨內(nèi)固定物、組織修復(fù)及細胞培養(yǎng)材料及醫(yī)用手術(shù)縫合線等。聚 乳酸微球作為緩控釋給藥體系，具有十分廣泛的應(yīng)用前景，主要用于制備小分 子藥物、多肽及蛋白質(zhì)藥物等的載體。然而聚乳酸微球存在如下的缺點，限制 了它的實際應(yīng)用(l)聚乳酸中有大量的酯鍵，為疏水性物質(zhì)，降低了它的生物 相容性；(2)在藥物釋放初期出現(xiàn)藥物的大量突釋。(3)微球的降解產(chǎn)物引起的酸 性環(huán)境。
在PLGA微球的研究中，減緩早期的突釋是一個難點問題?？偨Y(jié)目前解決 突釋問題的方法主要有兩類 一是通過改進載體的成分，以提高藥物和微球基 體的親和力；二是改進制備的過程防止藥物溶出，比如，加快溶劑的揮發(fā)，在 外包裹隔離層等。這些都主要著力于減緩或消除突釋，以致于延長藥物有效傳 遞的時間。
売聚糖(chitosan， CS)是天然聚合物甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物，是天然多糖 中唯一的堿性陽離子多糖，成粒性好，具有許多獨特的物理化學(xué)特性和生物功 能。殼聚糖及其分解產(chǎn)物無毒，具有好的生物相容性、生物可降解性及可被吸 收利用等特點，具有抗酸、抗菌消炎、抗?jié)儯龠M傷口愈合的能力，可阻止 或減弱藥物在胃中的刺激作用，因此是一種良好的藥物釋放載體。殼聚糖是一 種陽離子多糖，它有豐富的-OH、 -NHR功能基團，可用具有雙官能團的醛或酸 酐等交聯(lián)，有制備微球的優(yōu)良特性。殼聚糖微球作為藥物載體較其他材料的微 球具有如下的優(yōu)勢:(l)殼聚糖微球表面有豐富的功能基團，可吸附或包裹不同
特性的藥物；(2)売聚糖微球粘附性好，用于口、鼻、胃腸等粘膜給藥，特別 是投遞抗原、佐劑，有其獨特的優(yōu)勢；(3)殼聚糖微球表面有豐富的多糖鏈， 能被特異性細胞(或組織)所識別，可以靶向投遞藥物至病灶部位貯存釋放；(4)殼聚糖分子能影響細胞間F —肌動蛋白功能，打開細胞通道，有利于提高藥物 在細胞間瞬間滲透的能力。但天然的殼聚糖微球的不足在于由于每批次的來 源不同，原料存在差異；降解過快導(dǎo)致的藥物釋放過快和力學(xué)的過早喪失；以 及不適宜作為親脂性藥物的載體；質(zhì)量難以控制等。
綜上可見，既能實現(xiàn)藥物從微球的長期有效的釋放，又能克服PLGA引起
的酸性問題，是一個具有挑戰(zhàn)的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種雙重載藥的復(fù)合微球，該復(fù)合微球具有可載兩 種藥物、減少藥物的早期突釋、延長給藥時間和分階段控制給藥的特征。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述復(fù)合微球的制備方法。
一種雙重載藥的復(fù)合微球，所述復(fù)合微球具有球中球結(jié)構(gòu)，基體由位于內(nèi) 部的乳酸-羥基乙酸共聚物微球和位于外層的殼聚糖外殼構(gòu)成，藥物分別被包埋
在上述內(nèi)部微球和外殼中，其中，總載藥率為1-10%，內(nèi)部微球的平均粒徑為 100-1000nm，且球面光滑而沒有孔洞結(jié)構(gòu)，復(fù)合微球的平均粒徑為10-100pn， 且球面粗糙多皺褶，無孔洞。
所述乳酸-羥基乙酸共聚物的相對分子質(zhì)量為5-100KDa。 所述乳酸-羥基乙酸共聚物中乳酸乙醇酸的摩爾百分比為50:50-75:25。 所述殼聚糖的相對分子質(zhì)量為10-50KDa。
所述藥物為水溶性蛋白、多肽或生長因子，且內(nèi)部包埋的藥物和外殼中包 埋的藥物相同或不同。水溶性蛋白如牛血清白蛋白,卵清蛋白，溶菌酶等，多肽如 Peptide-24或Peptide-17，生長因子如BMP-2 。
所述內(nèi)部微球和殼聚糖外殼的質(zhì)量比為1: (5-10)。一種雙重載藥的復(fù)合微球的制備方法，按照如下操作步驟進行
(1) 采用乳化一溶劑揮發(fā)法制備乳酸-羥基乙酸共聚物內(nèi)部微球懸液，其中，藥 物用量是乳酸-羥基乙酸共聚物用量的l-10wt%; PLGA的溶劑采用二氯甲烷 (DCM)，內(nèi)水相藥物的溶劑采用水，外水相的表面活性劑選用Tween 80或者 Montanox70。乳化時采用不同超聲強度和超聲時間作為控制內(nèi)球粒徑的因素。
(2) 將上述內(nèi)部微球懸液置于質(zhì)量百分比濃度為0.5-5%的殼聚糖溶液中，其中， 殼聚糖溶液的溶劑為0.5-3%醋酸，攪拌至分散均勻；然后加入藥物水溶液，繼 續(xù)攪拌至分散均勻，得復(fù)合懸液，其中，藥物用量是殼聚糖用量的l-10wt%;
(3) 將步驟(2)的復(fù)合懸液加入到含山梨醇酯類乳化劑的油相中，油相為液體 石蠟或植物油，以500-3000rpm的速度攪拌乳化30-60分鐘，得到乳液，其中， 乳化劑與油相的體積比為1/60-1/15;
(4) 然后在上述攪拌狀態(tài)下，將交聯(lián)劑水溶液滴加至步驟(3)所制備的乳液中， 滴加完后繼續(xù)以500-3000rpm的速度攪拌2-4小時，靜置過夜，得微球懸液， 其中，交聯(lián)劑的用量為殼聚糖質(zhì)量的1.5-3倍；
(5) 依次以石油醚和異丙醇洗滌步驟(4)所得微球懸液l-5次，再以去離子水 洗l-5次后，得到雙重載藥的復(fù)合微球，冷凍干燥后得到干燥的復(fù)合微球。
所述山梨醇酯類乳化劑為Span 80、 Sorbon S-60和Sorgen 50中的一種或 多種。
所述交聯(lián)劑水溶液為5%或10%三聚磷酸鈉水溶液?？刂芓PP的量和交聯(lián) 時間，可以制備不同釋藥特性和不同降解特性的微球。
使用上述方法制備的本發(fā)明復(fù)合微球總的藥物包埋率可高達70-80%。
本發(fā)明所說的復(fù)合微球的制備過程中，藥物的投放，分為兩次投放，即制備PLGA內(nèi)球時和制備CS外層時分別投藥。可根據(jù)應(yīng)用的需要控制兩次藥物
投放的量或藥物的濃度或藥物的種類，以達到最佳給藥曲線。
本發(fā)明所說的復(fù)合微球的釋藥特性，主要通過以下參數(shù)得到控制(1)
PLGA內(nèi)部微球基體的分子量；(2)PLGA內(nèi)球的固化時間；(3)內(nèi)球中藥物的投 放比例；(4)外層基體CS的分子量；(5)外層CS的交聯(lián)度；(6)外層CS中藥 物的投放比例；(7)內(nèi)球、外層的質(zhì)量比例；(8)藥物的配制濃度。(9)內(nèi)外藥物 種類的選擇。
本發(fā)明所制備的PLGA/CS雙重載藥復(fù)合微球材料具有十分顯著的優(yōu)點
(1) 良好的生物相容性和可降解性。該復(fù)合微球所用的基材(PLGA和CS)， 均具有良好的生物相容性，和可調(diào)的降解性。在PLGA中有大量的酯鍵，為疏 水性物質(zhì)，把它和CS聯(lián)合使用，可以增強材料的親水性，有利于水溶性藥物 的附載和增加微球的相容性。
(2) 根據(jù)應(yīng)用的需要，進行分階段給藥。該復(fù)合微球的投藥是分兩次投入， 第一次投入的藥物主要分布于內(nèi)部PLGA微球，第二次投入的藥物分布于外層 CS，內(nèi)外藥物因擴散路徑的長短不同或因基體降解的時間表不同，使它們釋放 的峰值顯現(xiàn)出先后順序。可以通過調(diào)節(jié)兩次給藥的種類、藥量和濃度、內(nèi)層 PLGA和CS的質(zhì)量比以及它們的分子量，以達到整體控制藥物的釋放動力學(xué) 的目的。
(3) 減少突釋。對于內(nèi)外載同種藥的本復(fù)合微球，可以通過減小外層藥量、 增大內(nèi)層藥量或增加外層CS比例的方式，在達到相同的載藥量的同時，減少 早期藥物的突釋行為。
(4) 緩解PLGA降解引起的酸性問題。CS含有豐富的-OH、 -NHR功能基團，大量的CS包覆在這可以PLGA微球外面，當(dāng)PLGA降解產(chǎn)生酸性產(chǎn)物時， 這些基團能有效的緩沖。實驗證明，能維持pH值在人體正常pH值左右。


圖1是載BMP-2的PLGA/CS復(fù)合微球的表面形貌圖2是載BSA的PLGA內(nèi)球形貌圖； 圖3是載BMP-2的PLGA/CS復(fù)合微球的斷面形貌圖； 圖4是PLGA/CS復(fù)合微球和CS微球在PBS浸泡過程中BSA的釋放曲線； 圖5是PLGA內(nèi)球和PLGA/CS復(fù)合微球在PBS浸泡液中pH值的變化曲線。
具體實施例方式
下面將結(jié)合實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但這些實施例并不限制本發(fā) 明的保護范圍。
以下實施例中使用的BCA蛋白試劑盒，購自北京賽馳生物科技有限公司；
微球的平均粒徑測定方法將微球分散于去離子水中，用激光粒度分析儀 (Mastersizer2000,英國)測定其平均粒徑；
本發(fā)明復(fù)合微球的內(nèi)外球的質(zhì)量比、復(fù)合微球的總包埋率和總的載藥率的 測定方法
將已知質(zhì)量W ,e、的干燥復(fù)合微球溶于2%的醋酸中，離心后取上清液，沉 淀物干燥后稱重為W rt，再用含2.5% (w/v)十二垸基硫酸鈉的0.2mol/LNaOH 溶液溶解沉淀物，完全溶解后用1 mol/L的HC1將溶液調(diào)至呈中性，以BCA蛋 白試劑盒分別測定兩次蛋白上清液的濃度，計算出總的蛋白量P,，然后根據(jù)下 面公式計算內(nèi)外球的質(zhì)量比、復(fù)合微球的總包埋率和總的載藥率。
內(nèi)外球的質(zhì)量比W內(nèi)/(W總-W內(nèi))；微球的總包埋率二P i/制備復(fù)合微球過程中加入的總的蛋白量； 總的載藥率-P!/W總。 實施例l:本發(fā)明復(fù)合微球的制備I
1) 制備PLGA內(nèi)部微球 取0.4mL的5。/。(w/v)的牛血清白蛋白(BSA)水溶液 置于2mL的含10% (w/v) PLGA(分子量50KDa, LA:GA摩爾百分比為75:25) 的DCM溶液中，以60w的強度超聲乳化10秒，間隔10秒，再重復(fù)5次"超聲 一間隔"過程，制得內(nèi)乳液(w/o);在30mL去離子水中，加入0.3mLTween80， 機械攪拌至分散均勻，制得外水相；將內(nèi)乳液加入外水相，超聲乳化，以400w 的超聲強度乳化10秒，間隔10秒，重復(fù)5次，制得復(fù)乳液(w/o/w);將該液中 速攪拌2小時待DCM揮發(fā)，靜置過夜。離心后，水洗三次，得到PLGA內(nèi)球 懸液。
2) 取2mLPLGA上述內(nèi)球懸液置于10 mL 3% (w/v) CS (分子量10KDa，溶于2% 的醋酸溶液)溶液中，機械攪拌至分散均勻；再加入0.12mL5y。的BSA水溶液， 繼續(xù)攪拌分散均勻，得w相；取1.8mLSpan80至60mL液體石蠟中，機械攪拌 混合均勻得o相；將所制備的w相加入o相，以3000rpm的速度乳化30分鐘， 得到乳液；在攪拌狀態(tài)下，將16mL的5% (w/v) TPP溶液緩慢勻速(0.2ml/min) 滴加至所制備的乳液中；滴加完后繼續(xù)以3000rpm攪拌2小時，靜置過夜，得 微球懸液；所得微球懸液以異丙醇和石油醚分別洗滌3次，再以去離子水洗3 次后，得到雙重載藥的PLGA/CS復(fù)合微球懸液。在-4(TC冷凍干燥24小時得到 干燥的復(fù)合微球。
所得復(fù)合微球的平均粒徑為53.8(im,內(nèi)部微球的平均粒徑790nm，外部CS 質(zhì)量與內(nèi)部PLGA質(zhì)量比為5.21/1，總包埋率為76%,總載藥率為3.21%。實施例2本發(fā)明復(fù)合微球的制備II
1) 制備PLGA內(nèi)部微球
取0.2mL的5。/。的牛血清白蛋白(BSA)水溶液置于2mL的含5% (w/v) PLGA(分子量5KDa，LA:GA摩爾百分比為75:25)的DCM溶液中，以100w的強 度超聲乳化10秒，間隔10秒，再重復(fù)5次"超聲—間隔"過程，制得內(nèi)乳液(w/o); 在30mL去離子水中，加入0.3mLTween 80，機械攪拌至分散均勻，制得外水 相；將內(nèi)乳液加入外水相，超聲乳化，以800w的超聲強度乳化10秒，間隔IO 秒，重復(fù)3次，制得復(fù)乳液(w/o/w);將該液中速攪拌2小時待DCM揮發(fā)，靜 置過夜。離心后，水洗三次，得到PLGA內(nèi)球懸液，PLGA內(nèi)球形貌圖見圖2。
2) 取2mLPLGA內(nèi)球懸液置于10mL2%(w/v) CS(50KDa，溶于0.5%的醋酸溶液) 溶液中，機械攪拌至分散均勻；再加入0.12mL5。/。的BSA水溶液，繼續(xù)攪拌分 散均勻，得w相；取1.2mLSpan80至40mL液體石蠟中，機械攪拌混合均勻 得o相；將所制備的w相加入o相，以2000rpm的速度乳化50分鐘，得乳液； 在攪拌狀態(tài)下，將12mL的5% (w/v) TPP溶液緩慢勻速(0.2ml/min)滴加至所制 備的乳液中；滴加完成后繼續(xù)攪拌2小時，靜置過夜，得微球懸液；所得微球 懸液以異丙醇和石油醚分別洗漆4次，再以去離子水洗2次后，得到雙重載藥 的PLGA/CS復(fù)合微球懸液。在-4(TC冷凍干燥24小時得到干燥的復(fù)合微球。
所得復(fù)合微球的平均粒徑為63.0)Lim，內(nèi)部微球的平均粒徑108nm，外部CS 質(zhì)量與內(nèi)部PLGA質(zhì)量比為7.15/1，總包埋率為72%，總載藥率為2.26%。
實施例3本發(fā)明復(fù)合微球的制備III
1)制備PLGA內(nèi)部微球
取0.2mL的5%的慶大霉素水溶液置于2mL的含5% (w/v) PLGA(分子量100KDa, LA:GA摩爾百分比為50:50)的DCM溶液中，以40w的強度超聲乳化 10秒，間隔10秒，再重復(fù)5次"超聲一間隔"過程，制得內(nèi)乳液(w/o);在30mL 去離子水中，加入0.3mLTween 80，機械攪拌至分散均勻，制得外水相；將內(nèi) 乳液加入外水相，超聲乳化，以400w的超聲強度乳化10秒，間隔10秒，重 復(fù)3次，制得復(fù)乳液(w/o/w);將該液中速攪拌2小時待DCM揮發(fā)，靜置過夜。 離心后，水洗三次，得到PLGA內(nèi)球懸液。
2)取2mLPLGA內(nèi)球懸液置于6mL5% (w/v) CS(分子量25KDa,溶于3%的 醋酸溶液)溶液中，機械攪拌至分散均勻；再加入0.6mL5。/。的慶大霉素水溶液， 繼續(xù)攪拌分散均勻，得w相；取lmL Sorbon S-60至60mL液體石蠟中，機械 攪拌混合均勻得o相；將所制備的w相加入o相，以3000rpm的速度乳化30 分鐘，得乳液；在攪拌狀態(tài)下，將12mL的5% (w/v) TPP溶液緩慢勻速(0.2ml/min) 滴加至所制備的乳液中；滴加完后繼續(xù)攪拌2小時，靜置過夜；所得微球懸液 以石油醚和異丙醇分別洗滌2次，再以去離子水洗4次后，得到雙重載藥的 PLGA/CS復(fù)合微球懸液。在-40'C冷凍干燥24小時得到千燥的復(fù)合微球。
所得復(fù)合微球的平均粒徑為53.8pm，內(nèi)部微球的平均粒徑957nm，外部CS 質(zhì)量與內(nèi)部PLGA質(zhì)量比為8.09/1，總包埋率為69.8%,總載藥率為3.67%。
實施例4本發(fā)明復(fù)合微球的制備IV
1 )制備PLGA內(nèi)部微球取0.04mL的5。/。(w/v)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白一2(BMP-2) 水溶液置于2mL的含2.5。/。PLGA(分子量50KDa, LA:GA的摩爾百分比為75:25) 的DCM溶液中，以60w的強度超聲乳化10秒，間隔10秒，再重復(fù)5次"超聲 一間隔"過程，制得內(nèi)乳液(w/o);在30mL去離子水中，加入0.3mLTween80， 機械攪拌至分散均勻，制得外水相；將內(nèi)乳液加入外水相，超聲乳化，以600w
12的超聲強度乳化10秒，間隔10秒，重復(fù)5次，制得復(fù)乳液(w/o/w);將該液中 速攪拌2小時待DCM揮發(fā)，靜置過夜。離心后，水洗三次，得到PLGA內(nèi)球懸液。
2)取2mLPLGA內(nèi)球懸液置于20mL 0.5% (w/v) CS(分子量25KDa,溶于2% 的醋酸溶液)溶液中，機械攪拌至分散均勻；再加入0.2mL5。/。的BMP-2水溶液， 繼續(xù)攪拌分散均勻，得w相；取4mLSorgen 50至60mL液體石蠟中，機械攪 拌混合均勻得o相；將所制備的w相加入o相，以1000rpm的速度乳化30分 鐘，得乳液；在攪拌狀態(tài)下，將4mL的5% (w/v) TPP溶液緩慢勻速(0.2ml/min) 滴加至所制備的乳液中；滴加完后繼續(xù)攪拌2小時，靜置過夜，得微球懸液；所 得微球懸液以異丙醇和石油醚分別洗滌1次，再以去離子水洗4次后，得到雙 重載藥的PLGA/CS復(fù)合微球懸液。在-4(TC冷凍干燥24小時得到干燥的復(fù)合微 球。
所得復(fù)合微球的表面形貌圖見圖1，斷面形貌圖見圖3，復(fù)合微球的平均粒 徑為89.1pm ，內(nèi)部微球的平均粒徑782nm，外部CS質(zhì)量與內(nèi)部PLGA質(zhì)量比 為7.23/1，總包埋率為70.4%,總載藥率為3.03%。
實施例5本發(fā)明復(fù)合微球的制備V
l)制備PLGA內(nèi)部微球 取0.05mL的5%的骨形態(tài)發(fā)生蛋白_2(BMP-2) 水溶液置于4mL的含5% (w/v) PLGA(分子量20KDa,LA:GA的摩爾百分比為 60:40)的DCM溶液中，以60w的強度超聲乳化10秒，間隔10秒，再重復(fù)5 次"超聲一間隔"過程，制得內(nèi)乳液(w/o);在30mL去離子水中，加入0.3mLTween 80，機械攪拌至分散均勻，制得外水相；將內(nèi)乳液加入外水相，超聲乳化，以 400w的超聲強度乳化10秒，間隔10秒，重復(fù)5次，制得復(fù)乳液(w/o/w);將該液中速攪拌2小時待DCM揮發(fā)，靜置過夜。離心后，水洗三次，得到PLGA 內(nèi)球懸液。
2)取2mL步驟1)的PLGA內(nèi)部微球懸液至12mL 3% (w/v) CS(分子量 25KDa,溶于2。/。的醋酸溶液)溶液中，機械攪拌至分散均勻；再加入0.1mL5o/。的 Peptide-24水溶液，繼續(xù)攪拌分散均勻，得w相；取1.2mLSpan 80至40mL植 物油中，機械攪拌混合均勻得o相；將所制備的w相加入o相，以1000rpm的 速度乳化60分鐘，得到乳液；在攪拌狀態(tài)下，將6mL的5% (w/v) TPP溶液緩 慢勻速(0.2ml/min)滴加至所制備的乳液中；滴加完后繼續(xù)攪拌2小時，靜置過 夜，得微球懸液；所得微球懸液以異丙醇和石油醚分別洗滌5次，再以去離子 水洗2次后，得到雙重載藥的PLGA/CS復(fù)合微球懸液。在-4(TC冷凍干燥24 小時得到干燥的復(fù)合微球。
所得復(fù)合微球的平均粒徑為91.5pm ,內(nèi)部微球的平均粒徑467nm，外部 CS質(zhì)量與內(nèi)部PLGA質(zhì)量比為6.80/1;內(nèi)部微球中BMP-2的包埋率為76.4%， 外殼CS中的Peptide-24的包埋率為78.2%,總載藥率1.2%。
實施例6藥物釋放實驗
1)按照實施例2的方法分別制備內(nèi)球PLGA理論載藥率為10%，外殼理論
載藥率為2%的復(fù)合微球，即P10/C2;內(nèi)球PLGA理論載藥率為5%，外殼理
論載藥率為2%的復(fù)合微球，即P5/C2;
再按照如下方法制備理論載藥率為2%的CS微球，即C2，具體方法如下 取0.1mL5。/。的BSA水溶液置于12mL 3% (w/v) CS(分子量25KDa,溶于2%的
醋酸溶液)溶液中，機械攪拌至分散均勻，得到w相，取1.2mLSpan 80至40mL
植物油中，機械攪拌混合均勻得o相；將所制備的w相加入o相， 1000rpm的速度乳化60分鐘，得到乳液；在攪拌狀態(tài)下，將12mL的5% (w/v) TPP溶 液緩慢勻速(0.2ml/min)滴加至所制備的乳液中；滴加完后繼續(xù)攪拌2小時，靜 置過夜，得微球懸液；所得微球懸液以異丙醇和石油醚分別洗滌5次，再以去 離子水洗2次后，得到載BSA的CS微球懸液。在-40。C冷凍干燥24小時得到 干燥的CS微球。所得CS微球的平均粒徑為85.3jmi ,微球中BSA的包埋率為 87.4%,載藥率2.70%
以上微球所載藥物均為BSA。 所述理論載藥率是指制備過程中實際加入的藥物量與加入的基體(PLGA和 CS)質(zhì)量和藥物量之和的百分比。
2)將上述三種微球10mg分別浸泡于lml的PBS溶液中,定時取出1/2的上清 液用BCA蛋白試劑盒測定釋放的BSA的量,操作方法參照說明書，再累計每 個時間點的釋放總量。每次測定完成后向溶液中加入1/2體積的新鮮的PBS溶 液繼續(xù)浸泡至下一個時間點，每個樣品做平行的三個樣，結(jié)果為平均值+標(biāo)準(zhǔn) 偏差。以每個取樣時間點為橫坐標(biāo)，每個取樣時間點上累計的BSA的釋放總量 為縱坐標(biāo)，繪制圖4。
結(jié)果見圖4， P10/C2和P5/C2兩種復(fù)合微球釋放BSA的特征與CS微球(C2) 相比，突釋明顯減少且釋放時間增長。
實施例7本發(fā)明復(fù)合微球緩解PLGA降解引起的酸性證明實驗
1)按照實施例2的方法制備內(nèi)球PLGA理論載藥率為10%，外殼理論載藥率 為5%的復(fù)合微球，即P10/C5;按照實施例2中步驟l)的方法分別制備理論載 藥率為5%和10。/o的PLGA微球，艮卩P5禾nP10; P10/C2， P5/C2， C2取自實施 例6。以上微球所載藥物均為BSA。
2)將上述6種微球15mg分別浸泡于1.5ml的PBS溶液中，于15天，30天,60 天,90天，120天時取出上清液，用pH計測定浸泡液的pH變化。結(jié)果見圖5.
由圖5可見，復(fù)合微球(P10/C2,P10/C5和P5/C2)與PLGA微球(P5和P10) 相比，復(fù)合微球能夠緩解PLGA降解引起的酸性。
權(quán)利要求
1、一種雙重載藥的復(fù)合微球，其特征在于，所述復(fù)合微球具有球中球結(jié)構(gòu)，基體由位于內(nèi)部的乳酸-羥基乙酸共聚物微球和位于外層的殼聚糖外殼構(gòu)成，藥物分別被包埋在上述內(nèi)部微球和殼聚糖外殼中，其中，總載藥率為1-10％，內(nèi)部微球的平均粒徑為100-1000nm，且球面光滑而沒有孔洞結(jié)構(gòu)，復(fù)合微球的平均粒徑為10-100μm，且球面粗糙多皺褶，無孔洞。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述雙重載藥的復(fù)合微球，其特征在于，所述乳酸-羥基乙 酸共聚物的相對分子質(zhì)量為5-100KDa。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述雙重載藥的復(fù)合微球，其特征在于，所述乳酸-羥基乙 酸共聚物中乳酸乙醇酸的摩爾百分比為50:50-75:25。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述雙重載藥的復(fù)合微球，其特征在于，所述殼聚糖的相對 分子質(zhì)量為10-50KDa。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述雙重載藥的復(fù)合微球，其特征在于，所述藥物為水溶性 蛋白、多肽或生長因子，且內(nèi)部包埋的藥物和外殼中包埋的藥物相同或不同。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述雙重載藥的復(fù)合微球，其特征在于，所述內(nèi)部微球和殼 聚糖外殼的質(zhì)量比為1: (5-10)。
7、 一種雙重載藥的復(fù)合微球的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1) 采用乳化一溶劑揮發(fā)法制備乳酸-羥基乙酸共聚物內(nèi)部微球懸液，其中，藥 物用量是乳酸-羥基乙酸共聚物用量的l-10wt%;(2) 將上述內(nèi)部微球懸液置于質(zhì)量百分比濃度為0.5-5%的殼聚糖溶液中，其中， 殼聚糖溶液的溶劑為0.5-3%醋酸，攪拌至分散均勻；然后加入藥物水溶液，繼 續(xù)攪拌至分散均勻，得復(fù)合懸液，其中，藥物用量是殼聚糖用量的l-10wt%;(3) 將步驟(2)的復(fù)合懸液加入到含山梨醇酯類乳化劑的油相中，油相為液體石蠟或植物油，以500-3000rpm的速度攪拌乳化30-60分鐘，得到乳液，其中， 乳化劑與油相的體積比為1/60-1/15;(4) 然后在上述攪拌狀態(tài)下，將交聯(lián)劑水溶液滴加至步驟(3)所制備的乳液中， 滴加完后繼續(xù)以500-3000rpm的速度攪拌2-4小時，靜置過夜，得微球懸液， 其中，交聯(lián)劑的用量為殼聚糖質(zhì)量的1.5-3倍；(5) 依次以石油醚和異丙醇洗滌步驟(4)所得微球懸液l-5次，再以去離子水 洗l-5次后，得到雙重載藥的復(fù)合微球，冷凍干燥后得到干燥的復(fù)合微球。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述山梨醇酯類乳化劑為 Span 80、 Sorbon S-60禾B Sorgen 50中的一種或多種。
9、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述交聯(lián)劑水溶液為5% 或10%三聚磷酸鈉水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域的一種雙重載藥的復(fù)合微球及其制備方法。所述復(fù)合微球具有球中球結(jié)構(gòu)，基體由位于內(nèi)部的乳酸-羥基乙酸共聚物微球和位于外層的殼聚糖外殼構(gòu)成，藥物分別被包埋在上述內(nèi)部微球和外殼中，其中，總載藥率為1-10％，內(nèi)部微球的平均粒徑為100-1000nm，復(fù)合微球的平均粒徑為10-100μm。本發(fā)明還公開了該復(fù)合微球的制備方法。本發(fā)明的復(fù)合微球具有良好的生物相容性和可降解性，能夠根據(jù)應(yīng)用的需要控制兩次藥物投放的量或藥物的濃度或藥物的種類，減少突釋，緩解PLGA降解引起的酸性問題。
文檔編號A61K9/16GK101658497SQ200910092500
公開日2010年3月3日 申請日期2009年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月16日
發(fā)明者馮慶玲, 王明波 申請人:清華大學(xué)