專利名稱：治療神經系統疾病的孕烯醇酮硫酸鹽的制作方法
技術領域：
本申請涉及使用孕烯醇酮硫酸鹽(一種神經活性留體)以預防和治療神經系統疾病或功能紊亂。
背景技術：
神經變性疾病特征是慢性、漸進的神經元變性，引起神經系統功能紊亂且通常最終導致死亡。根據國家神經系統疾病與中風研究院(the National Institute ofNeurological Disorders and Stroke)報告,神經變性 疾病包括超過600種神經系統疾病，毎年影響約5000萬美國人。美國毎年花費億萬美元在直接醫療費上，僅阿爾茨海默病就估計姆年花費 1000 億美兀(Brown 等.，(2005) Environmental Health Perspectives)。神經變性疾病如阿爾茨海默病、唐氏綜合癥和路易體癡呆與神經元組織中的淀粉樣斑塊相關。這些斑是由￠-淀粉樣肽(AP)組成的纖維纏結構成。最普遍的異構體是A ^ト40和A P !_42,盡管A ^ !_42更加纖維化并與疾病狀態相關。目前，有一些治療(如果有)用于不同范圍的神經系統疾病。通常，現有的治療對癥狀的益處最小，僅集中于減少疾病癥狀的嚴重性或強度。需要其他g在預防和、或治療神經變性疾病有害效果的方法。發明概述本申請部分是基于發現孕烯醇酮硫酸鹽(PREGS)顯示親神經活性和提供神經保護抗￠-淀粉樣肽誘導的神經毒性。根據本申請的ー個方面，提供了治療患神經系統疾病或功能紊亂對象的方法。該方法包括施用有效量的孕烯醇酮硫酸鹽給對象以治療神經系統疾病或功能紊亂。神經系統疾病或功能紊亂的非限制性例子包括年齡相關的神經變性、阿爾茨海默病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、進行性腦灰質萎縮、巴藤病、瘋牛病(BSE)、化療誘發的神經病變、克雅病、糖尿病性神經病變、唐氏綜合癥、額顳葉變性、亨廷頓病、HIV相關性癡呆、克拉貝病、路易體癡呆、多系統性萎縮、尼曼-皮克病、帕金森病、多神經炎、朊病毒病、原發性側索硬化、雷弗素姆氏病、山霍夫氏病、老年癡呆癥，少年型家族性黑朦性癡呆、脊髄小腦性共濟失調、脊髄性肌萎縮、亞急性脊髄混合變性、脊髓癆或血管性癡呆。在一些實施方式中，神經系統疾病或功能紊亂由燒傷、外傷性損傷、機械性損傷、手術損傷、生理損傷、病理性損傷或免疫性損傷引起。在一些實施方式中，神經系統疾病或功能紊亂是神經變性疾病。P -淀粉樣肽如A ^ト42積聚可引起神經變性疾病。根據本申請的另ー個方面，提供了方法治療有神經元組織中0 -淀粉樣肽積聚相關病情的對象。該方法包括施用有效量的孕烯醇酮硫酸鹽給對象以治療病情。在一些實施方式中，病情是阿爾茨海默病、唐氏綜合癥或路易體癡呆。根據本申請的另外ー個方面，提供了減少或防止神經元組織中￠-淀粉樣肽積聚的方法。該方法包括使神經元組織接觸孕烯醇酮硫酸鹽。在一些實施方式中，￠-淀粉樣
肽是 A ^ !_42。根據本申請公開的另ー個方面，提供了刺激或促進神經元細胞生長的方法。該方法包括以有效刺激或促進神經元細胞生長的 量使神經元細胞接觸孕烯醇酮硫酸鹽。在ー些實施方式中，神經元細胞是在組織中。所述組織可以是腦組織、脊髄組織或外周神經組織。在一些實施方式中，神經元生長包括神經突觸生長。除非另有說明，下列實施方式同等地適用于本申請的各方面內容。在一些實施方式中，所用孕烯醇酮硫酸鹽是合成的PREGS㈠對映異構體(ent-PREGS)。在其他實施方式中，孕烯醇酮硫酸鹽ロ頭、靜脈內、肌肉內、鞘內、舌下、頰側、鼻內、關節內、腹膜內、皮下或局部施用。在一些實施方式中，孕烯醇酮硫酸鹽作為預防施用。在一些實施方式中，對象若非如本發明所述沒有需要孕烯醇酮硫酸鹽治療的跡象。在其他實施方式中，在孕烯醇酮硫酸鹽之外還給對象施用其它藥劑。本申請的各項限定包括本申請的不同實施方式。由此可見，含ー種要素或要素組合的本申請任ー限定適用于本申請的各方面。本申請的實施方式可以不同方法實踐或進行。同樣，本文所用表達和術語是為了描述目的，不應視作限制?！鞍ā?、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”和其它變形涵蓋其后所列的項目和其等價物以及其它項目。本申請的這些和其他方面以及多種優勢和用途可參考詳細描述。應當理解本申請的各方面涵蓋不同實施方式。本申請述及的所有文獻全部以引用的方式并入本文中。附圖
簡要說明附圖不按比例繪制。出于闡明目的，不是每種成分都在每張圖中標出。在圖中圖I顯示PREGS對B104細胞存活的效果。在24小時中以0. 25到40 ii M范圍間的不同濃度PREGS處理B104細胞。結果以細胞存活百分比表示，是3次試驗的平均值土標準誤差。PREG是非毒性的且不影響B104細胞存活。圖2顯示PREGS的親神經活性。B104細胞在⑷沒有PREGS、⑶存在5 u MPREGS條件下低密度培養7天所見的的神經突觸生長。箭頭顯示PREGS誘發的顯著突觸生長。圖3是顯示人A3卜42肽纖維形式(fA@ 1-42)對B104細胞壞死效果的柱狀圖。壞死效果早在處理后6小時開始顯現。fAP 1-42肽從5 ii M增加到20 ii M時，觀察到顯著的劑量依賴性壞死。壞死細胞的百分比是兩次試驗的平均值土標準誤差。圖4是顯示PREGS對B104細胞抗人A ^ ^42肽纖維形式(fA ^ 1-42)毒性的神經保護作用的柱狀圖。20 ii M PREGS能保護B104細胞抗20 y M fAP 1-42肽誘發的毒性。在第24小時觀察到效果并維持到96小吋。發明的詳細描述本文所述的申請部分涉及孕烯醇酮硫酸鹽(PREGS)和使用PREGS治療和預防神經系統疾病或功能紊亂的方法。本申請還涉及PREGS抗神經元組織中￠-淀粉樣肽積聚引起的神經毒性和神經變性的保護能力。在一些實施方式中，本申請的方法使用PREGS作為親神經劑以刺激或促進神經元細胞生長。在一些實施方式中，所用孕烯醇酮硫酸鹽是合成的PREGS(-)對映異構體(ent-PREGS)。本申請的方法包括施用有效量的孕烯醇酮硫酸鹽給需要的對象以治療、預防或緩解神經系統疾病或功能紊亂。PREGS屬于能通過與神經遞質門控離子通道相互作用來影響神經元興奮性的神經留體組。ent-PREGS (合成的PREGS (-)對映異構體)比其生理對應物更有效刺激大鼠和小鼠的記憶(Akwa等 Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2001 ；98 :14033-37)。孕烯醇酮硫酸鹽和其合成的對映異構體類似物ent-PREGS與經典類固醇激素具有不同的化學結構，已知它們能調節大腦功能，且所述調節與內分泌機制無關。
本文所用術語“神經系統疾病或功能紊亂”涉及的是以神經元組織和/或神經元組織功能損壞、退化或缺失為特征的神經系統疾病。神經系統疾病或功能紊亂的例子包括但不限于年齡相關的神經變性、阿爾茨海默病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、進行性腦灰質萎縮、巴藤病、瘋牛病(BSE)、化療誘發的神經病變、克雅病、唐氏綜合癥、糖尿病性神經病變、額顳葉變性、亨廷頓病、HIV相關性癡呆、克拉貝病、路易體癡呆、多系統性萎縮、尼曼-皮克病、帕金森病、多神經炎、朊病毒病、原發性側索硬化、雷弗素姆氏病、山霍夫氏病、老年癡呆癥，少年型家族性黑朦性癡呆、脊髄小腦性共濟失調、脊髄性肌萎縮、亞急性脊髄混合變性、脊髓癆或血管性癡呆。在一些實施方式中，神經系統疾病或功能紊亂由燒傷、外傷性損傷、機械性損傷、手術損傷、生理損傷、病理性損傷或免疫性損傷引起。在一些實施方式中，神經細胞損傷或功能紊亂不包括阿爾茨海默病和年齡相關的癡呆。本文中術語“疾病”或“紊亂”可交換使用，涉及對身體狀態或某些器官狀態的任何如下所述的改變，所述改變阻斷或干擾機體功能和/或引起患病對象的諸如不適、功能紊亂、痛苦或甚至死亡等癥狀?！吧窠涀冃约膊　钡奶卣魇侵鸩胶蜐u進的神經元組織和/或神經元組織功能喪失。在一些實施方式中，神經變性疾病以￠-淀粉樣肽(AP)積聚為特征。通過a、0和Y _分泌酶連續裂解淀粉樣蛋白前體形成39-43個氨基酸殘基的AP肽。APy2更加纖維化并認為是淀粉樣斑塊的主要成分，淀粉樣斑塊似乎引起神經元退化和隨后發展的疾病狀態。因此，本申請的ー個方面涉及治療神經元組織如腦、脊髄或外周神經系統中￠-淀粉樣肽積聚。此外，本申請也涉及治療、預防或緩解以神經元組織中￠-淀粉樣肽積聚為特征的病情。所述病情的例子包括但不限于阿爾茨海默病、唐氏綜合癥或路易體癡呆。反映AP肽神經毒性效果的細胞凋亡和壞死速度以及神經留體對其的調節主要通過流式細胞術和其他細胞存活實驗研究。另外，使用特定神經元標記通過免疫化學分析潛在的神經留體親神經活性。由Alois Alzheimer在1907年首先描述的阿爾茨海默病(AD)是ー種漸進的神經變性疾病，導致腦萎縮、認知缺陷和癡呆。其特征是老年斑和神經纖維纏結(Hyman，Neurobiol Aging 1997,18 :527-32 ；Delacourte 等，Neurology 1999,52 1158-65 ；Selkoe, JAMA 2000,283 :1615-1617)。神經纖維纏結的主要病理學成分是高度磷酸化微管相關蛋白 tau 的雙股螺旋形細絲(Grundke-Iqbal 等，Proc Natl Acad Sci USA. 1986,83 4913-17 ;Bu6e等，fcain Res Rev 2000，33 :95-30)，它破壞神經元細胞骨架的穩定性從而導致神經變性(Alonso 等,Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997,94 :298-03)。老年斑主要由過量3 _ 淀粉樣(AP)蛋白積聚引起(Hyman, Neurobiol Aging 1997,18 :527-32 ；Selkoe, JAMA2000,283 :1615-1617)。正常情況下，該AP蛋白是淀粉樣蛋白前體的可溶性代謝產物，是能在健康人血漿和CSF中檢測到的循環肽(Haass等，Nature 1992，359 :322-35 ；Selkoe,Physiol Rev 2001,81 :741-66)。已知腦積聚AP月太，特別是A@ト42在體內和體外對神經元高度有毒(LeFerla 等 Nat Genet 1995,9(1) :21-30 ;Tan 等 Journal of Neurochemistry1998,71 :95-105 ;Shimohama 等 Apoptosis 2000,5(1) :21-30)。AD迄今為止病因未明。流行病學調查顯示AD是超過65歲老年人中癡呆的主要原因(HeImer等，Med Sci (Paris) 2006，22 :288-96)。其普遍性估計達到全球約5000到10000萬個案例。由于人群預期壽命增加和年齡老化，AD正成為ー個急需克服的社會和經濟性公共健康問題。不幸的是，目前沒有AD治愈方法。僅有的藥物治療(膽堿脂酶抑制劑和NMDA受體配體)對ー些病人產生相對小的癥狀益處，但沒有減緩疾病進展。中樞神經系統(CNS)能生成稱為“神經甾體”的適當類固醇(Baulieu等，BiolCell 1991, 71 :3-10 ;Schumacher 等，Prog Neurobiol 2003, 71 :3-29),在神經兀和神經膠質細胞中鑒定了參與此類膽固醇生物合成和代謝的酶(圖2 ;Akwa等，J Steroid BiochemMol. Biol. 1991,40 :71-81 ；J. Cell. Biol. 1993，121 :135-43 ；Zwain 等，Endocrinology1999,140 :3843-52 ;Mensah_Nyagan等，Pharmacol Rev 1999,51 :63-81 ;Mellon等，TrendsEndocrinol Metab 2002,13(1) :35-43)。已知許多類固醇影響CNS活性，在這些神經活性類固醇中，神經留體調節不同的腦功能如記憶、應激、焦慮或睡眠，如動物模型的精神藥理學和行為學研究所不(Akwa 等，J Soc Biol 1999,193 :293-98 ;Rupprecht 等，IntRev Neurobiol 2001，46 :461-77)。特別是，孕烯醇酮(PREG)和其硫酸鹽衍生物PREGS能提高年輕嚙齒動物的記憶カ(Flood等，Proc Natl Acad Sci USA 1992,89 :1567-71 ；Proc Natl Acad Sci USA 1995,92 :10806-10 ；Darnaudery 等，Brain Res 2000,852:173-79 ;Akwa 等，Proc Nat Acad Sci USA 2001,98 :14033-37)并逆轉藥劑導致(Meziane等，Psychopharmacology (Berl) 1996,126 :323-30 ；Maurice 等，Neuroscience 1998,3 413-28)、與年齡老化相關(Vall6e 等，Proc Natl Acad Sci USA 1997，94 :14865-70)或
肽誘發(Maurice等，Neuroscience 19983:413-28)的健忘癥。制得注意的是，合成的PREGS對映異構體(ent-PREGS)也刺激記憶且比天然PREGS更有效(Akwa等，Proc Nat AcadSci USA2001,98 :14033-37)。除了其記憶錯誤(promnesiant)和抗健忘性質之外,神經甾體可在神經保護中發揮作用(Schumacher 等，J Neurocytol 2000，29 :307-26) oPREG減少海馬 HT-22神經元培養物中淀粉樣肽導致的死亡(Gursoy等,Neurochem Res 2001, 26 (I) :15_21)。孕酮(PROG)在腦挫傷或腦缺血后保護神經元(Roof等,Exp Neurol 1994,129 :64-9 ;Gonzales_Vidal等，Arch Med Res 1998,29 117~24)，曰抗A 13 蛋白神經韋性(Goodman等,J Neurochem 1996,66 :1836-44)。許多文獻報道了 17 0-雌ニ醇(E2)的親神經和神經保護效果(Fereira等，J Neurosci 1991,11:392-400 ;Murphy 等，J Neurosci 1996,16 :4059-68 ;Goodman 等，JNeurochem 1996,66:1836-44)。已知 E2 (Goodman 等，JNeurochem 1996,66 :1836-44 ;Green等，J Neurocytol 2000,29 :419-23)以及其非女性化(nonfeminizing)對映異構體(Green等，Endocrinology 2001,142 :400-06)具有抗淀粉樣肽神經毒性的神經保護。在此情況中，仍需評估PREGS和ent-PREGS抗A P肽誘導的神經毒性的效果。關于人中神經留體活性的知識仍然有限。然而，顯示在人腦組織中存在一些神經留體(Lanthier 等，J Steroid Biochem 1986,25 :445-49 ;Lacroix等，J Steroid Biochem1987,28 :317-25 ;Weill-Engerer 等，J. Clin Endocrinol Metab 2002,87 :5138-43),以及涉及其生物合成和代謝的酶(Stoffel-Wagner，Eur J Endocrinol 2001,145 :669-679 ； Weill-Engerer 等，Brain Res 2003,969 :117-25 ；Yau 等，Neuroscience2003, 121 307-14)。有趣的是，AD老年病人腦的某些區域與非癡呆的對象相比，某些神經甾體的濃度顯著較低，與此負相關的是高水平的AP蛋白和超磷酸化tau蛋白(Weill-Engerer等，JClin Endocrinol Metab 2002,87:5138-43)。這些發現提示神經留體可保護神經元抗老年斑和神經纖維纏結導致的損害(Schumacher等，Prog Neurobiol 2003, 71 :3_29),突出了該類固醇在AD中潛在作用的重要性(Akwa等，Alzheimer Dis Assoc Disord 2005,19 226-39)。如本文所用，“需要的對象”是例如目前或之前患神經系統疾病或功能紊亂的人。另外，對象可能懷疑患有神經系統疾病或功能紊亂或由醫學領域技術人員認為具有患神經系統疾病或功能紊亂的風險或風險提高。神經系統疾病或功能紊亂可由燒傷、外傷性損傷、機械性損傷、手術損傷、生理損傷、病理性損傷或免疫性損傷引起。在ー些方面，可以是以^ -淀粉樣肽如APト42積聚為特征的神經變性疾病所引起的神經系統疾病。
在一些實施方式中，對象若非如本發明所述沒有需要孕烯醇酮硫酸鹽治療的跡象。對象沒有需要孕烯醇酮硫酸鹽治療的跡象是對象沒有需要孕烯醇酮硫酸鹽治療的征兆或癥狀。本領域普通技術人員已知需要孕烯醇酮硫酸鹽治療的跡象。所述跡象的例子包括健忘癥、經前綜合癥、睡眠問題和抑郁癥。術語“治療”或“處理”包括預防、改善、防止或治愈病情。病情發生后治療旨在減少、改善或一起去除病情和/或ー種或多種其相關癥狀、或防止其惡化。病情開始前治療對象(即預防性治療)_在降低發病風險和/或如若發病則減輕其嚴重性。如本文所用，術語“防止”涉及預防性治療具有發展病情風險的對象，使得發病的可能性減少或使得病情相比如若沒有預防性治療較輕的可能性増加。通過例如確定治療的生理學效果如治療施用后癥狀減少或沒有，可測量本申請治療方法的效果。在一些實施方式中，神經元生長包括神經突觸生長。神經突觸生長包括朝向靶細胞的軸突生長，軸突可與靶細胞形成突觸。確立所述神經元連接性模式對于神經系統正常功能是必須的?？捎帽绢I域已知的多種測試評估此性質。例如，在存在或沒有治療時使用免疫熒光能直接檢測神經。治療相比“治療前”或相比對照具有更長神經突(包括軸突和/或樹突)的神經其神經細胞生長獲得了增強。神經細胞可體內(in vivo)、體外(in vitro)或活體外(ex vivo)處理。因此，細胞可以處于完整的對象之中，或是從對象中分離的，或是體外細胞系?！坝行Я俊痹邢┐纪蛩猁}是必需或足以在對象中提供醫學上需要的生物學結果(例如治療、防止或改善神經系統疾病或功能紊亂)的量。另外，所需生物學效果包括刺激神經細胞的神經突觸生長。有效量隨著治療的特定病情、治療對象的年齡和身體狀況、病情嚴重性、治療持續時間、同時療法(如果有)的性質、特定施用途徑以及醫療保健技術人員知識和專業范圍內的類似因素而變化。該量可用已知方法以經驗為主確定且隨著對象不同而不同。一般優選使用本申請所涉及藥劑(単獨或結合其他治療劑)的最大劑量，即根據可靠醫療判斷的最高安全劑量。通常，孕烯醇酮硫酸鹽的劑量是約10-100mg。其它施用形式如靜脈內施用可采用較低的劑量。如果在初始應用劑量時對象中的反應不足，可使用更高劑量(或通過不同的更集中化傳遞途徑有效達到的更高劑量)直到對象耐受允許的程度。應當理解，孕烯醇酮硫酸鹽用于治療或預防神經系統疾病或功能紊亂，即它可在具有發展神經元細胞損傷或功能紊亂風險的對象中預防性使用。因此，有效量是能降低風險、延遲發生或同時防止神經系統疾病或功能紊亂的量。應當意識到，當孕烯醇酮硫酸鹽在嚴重情況下使用吋，它用于防止ー種或多種通常來自此類不良情況的醫學上的不良結果。孕烯醇酮硫酸鹽可聯合其它治療劑，如治療神經系統疾病或功能紊亂所用其它治療劑。其它治療劑的例子包括但不限于こ酰膽堿酯酶抑制劑(例如多奈哌齊、加蘭他敏和利凡斯的明)、NMDA受體拮抗劑(例如美金剛)、多巴胺激動劑(例如溴隱亭、培高利特)和單胺氧化酶-B抑制劑(例如司立吉蘭和雷沙吉蘭)。孕烯醇酮硫酸鹽和其它治療劑可同時或連續施用。當其它治療劑為同時施用吋，它們能在同一或分開的制劑中，但同時施用。其它治療劑和孕烯醇酮硫酸鹽的施用也可在時間上分開，意味著治療劑在不同時刻施用，在孕烯醇酮硫酸鹽施用之前或之后施用。施用這些化合物的時間間隔可以是幾分鐘或更長。施用時，孕烯醇酮硫酸鹽和其它治療劑優選以藥物制劑的形式，以可藥用量和可藥用配方來應用。所述制劑可包含鹽、緩沖劑、保存 劑、相容載體和任選的其它治療劑。藥用時，鹽應是可藥用的，但非可藥用鹽可用于方便地制成其可藥用鹽，因此屬于本申請的范圍之內。所述藥學可接收的和可藥用鹽包括但不限于從下列酸中制備的鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、こ酸、水楊酸、檸檬酸、甲酸、丙ニ酸、琥珀酸等。同樣，可藥用鹽也可制備成堿金屬或堿土金屬鹽，如納、鉀或鈣鹽。孕烯醇酮硫酸鹽可以結合可藥用載體。本文所用術語“可藥用載體”指一種或多種可人用的相容固體或液體填充料、稀釋劑或包囊物質。術語“載體”指與活性成分組合以利使用的有機或無機、天然或合成的成分。藥物組合物的組分也能與本申請的各種分子以適當的方式共混合，使得彼此間不會發生顯著損害所需藥物功效的相互作用。藥物組合物也可包含上述適當緩沖劑，包括こ酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、甘氨酸、硼酸鹽、碳酸鹽、重碳酸鹽、氫氧化物(和其它堿基)和上述化合物的可藥用鹽。所述藥物組合物還可包含適當保存劑，如苯扎氯銨、氯代丁醇、對羥基苯甲酸酯和硫柳汞。藥物組合物可方便地以單位劑型呈現，且通過藥學領域熟知的方法制備。所有方法都包括使活性劑與載體相聯的步驟，所述載體包含ー種或多種輔助成分。一般，制備組合物是通過使活性化合物與液體載體、精細粉碎的固體載體或以上這兩種載體構成均勻、密切的關聯，隨后，根據需要進行產物的成形。在一些實施方式中，孕烯醇酮硫酸鹽可ロ頭、靜脈內、肌肉內、鞘內、舌下、頰側、鼻內、關節內、腹膜內、皮下或局部施用。當需要全身傳遞時，可將孕烯醇酮硫酸鹽制成腸胃外施用的注射制劑，例如藥團推注或連續輸注。注射用制劑可以是單位劑型的形式，保存于例如加有保存劑的安瓿或多劑量容器中。組合物可采用的形式如在油或水載體中的懸浮液、溶液或乳液，可包含配方用制劑如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。用于腸胃外施用的藥物制劑包括水溶形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的懸浮液可制備成適當的油性注射懸浮液。適當的親脂性溶劑或載體包括脂肪油如麻油、或合成的脂肪酸酯如油酸こ酯或甘油三酷、或脂質體。水性注射懸浮液可包含增加懸浮液粘性的物質，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖?？蛇x地，懸浮液也可包含適當穩定劑或増加化合物溶解性的試劑以制備高濃縮溶液?；蛘撸钚曰衔锟梢苑勰┬问接糜谠谑褂们坝眠m當載體(例如鹽水、緩沖液或滅菌無熱原水)再生。適合口服的組合物可以是分散的多単位形式，如膠囊、片劑、藥丸、錠劑，各含預定量的活性化合物(孕烯醇酮硫酸鹽)。其它組合物包括水溶液或非水溶液中的懸浮液，如糖漿、酏劑、乳液或凝膠。ロ服藥物制品可制備成固體賦形劑，可選性地研磨所得混合物，根據需要添加適當輔助劑后將顆?；旌衔锛庸こ善瑒┗蛱且峦璧暮诵?。適當的賦形劑是填充劑，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇或纖維素制品，例如玉蜀黍淀粉、小麥淀粉、米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚こ烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解劑，如交聯聚こ烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽如海藻酸鈉。任選地，ロ頭制劑也可在鹽水或緩沖液中制成，即用于中和內部酸環境的EDTA，或可以無任何載體而施用。本發明還包括上述組合物的ロ服劑型?？苫瘜W修飾ー種或幾種組分使得所得衍生物經ロ傳遞有效。一般，考慮的化學修飾是將至少一修飾部分連接到組成分子上，其中所述修飾部分允許(a)蛋白質水解抑制和(b)從胃或腸進入血流的吸收。還需要ー種或幾種組分的總體穩定性提高和體內循環時間延長。所述修飾部分的例子包括聚こニ醇、こニ醇和丙ニ醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚こ烯醇、聚こ烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski 和 Davis, 1981,"可溶性聚合物-酶加合物"("Soluble Polymer-EnzymeAdducts" ) In Enzymes as Drugs,Hocenberg 和 Roberts,eds. ,Wiley-Interscience,NewYork, NY,第 367-383 頁;Newmark,等，1982, J. Appl. Biochem. 4 :185-189。能使用的其它聚合物是聚_1，3- ニ氧戍環和聚_1，3,6- ニ氧八環。如上所述，就藥用而目，優選聚こニ醇修飾。組分(或衍生物)的釋放部位可以是胃、小腸(十二指腸、空腸或回腸)或大腸。不溶于胃而會在十二指腸或腸其它地方釋放物質的現成制劑是本領域技術人員所已知的。釋放優選避免胃環境的不利影響，這可以通過孕烯醇酮硫酸鹽保護或是在胃環境外如腸中釋放生物活性物質來實現。為確保充分的胃內環境抗性，需要至少能在pH 5. 0防滲的包衣。用作腸溶包衣材料的常用惰性成分的例子是こ酸偏苯三甲酸酯纖維素(CAT)、羥丙基甲基纖維素酞酸酯(HPMCP)、HPMCP 50,HPMCP 55、聚醋酸こ烯酞酸酯(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、酞酸醋酸纖維素(CAP)、Eudragit L、Eudragit S和蟲膠。這些包衣材料可用作混合膜。包衣或包衣混合物也能用于不需要抗胃環境保護的片劑。這可包括糖包衣，或使得片劑更易吞咽的包衣。膠囊可由硬殼(如明膠)組成，用于傳遞干治療劑劑(即粉末)；對于液體形式而言，可使用軟明膠売。膠囊的殼材料可以是厚淀粉或其它可食用紙。對于藥丸、錠劑、模型片劑或模印片，可使用濕制丸技木。治療劑可作為精細多顆粒包括在制劑中，以顆?；驈椡栊问?，顆粒大小約為1mm。用于膠囊給藥的制劑也可以是粉末形式、輕壓縮拴塞或甚至片劑形式。治療劑劑可壓制而成。還可包括著色劑和增味劑。例如，可將孕烯醇酮硫酸鹽(如通過脂質體或微球體封裝)制成制劑，隨后將其包含在可食用產品中，如含著色劑和增味劑的冷凍飲料。 可用惰性物質來稀釋治療劑或增加治療劑的體積。這些稀釋劑包括碳水化合物，特別是甘露醇、乳糖、無水乳糖、纖維素、蔗糖、修飾的葡聚糖和淀粉。也可使用某些無機鹽作為填充劑，包括三磷酸鈣鹽、碳酸鎂和氯化鈉。一些可購得的稀釋劑是ast-Flo、Emdex,STA-Rx 1500、Emcompress 和 Avicello崩解劑可以包含在治療劑的固體劑型中。用作崩解劑的物質包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的市售崩解劑Explotab。羧甲淀粉鈉、離子交換樹脂、羧甲基纖維素鈉、ultramylopectin、海藻酸鈉、明膠、桔皮、羧甲基纖維素、天然海綿和皂土都可使用。崩解劑的另一形式是不溶的陽離子交換樹脂。粉末化樹膠可用作崩解劑和粘合劑，包括瓊脂、刺梧桐樹膠或黃芪膠等樹膠的粉末。藻酸和其鈉鹽也可用作崩解劑。
粘合劑用于使治療劑聚結成硬片劑，粘合劑包括來自天然產物的物質，如阿拉伯膠、黃芪膠、淀粉和明膠。其它包括甲基纖維素(MC)、こ基纖維素(EC)和羧甲基纖維素(CMC)。聚こ烯吡咯烷酮(PVP)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)都能以こ醇溶液的形式用于治療劑的造粒。治療劑的制劑可包括抗摩擦試劑以防止制備過程中的粘著。可使用潤滑劑作為治療劑和模壁間的ー層，它們包括但不限于硬脂酸，包括其鎂和鈣鹽、聚四氟こ烯(PTFE)、液體石蠟、植物油和蠟。也可使用可溶性潤滑劑如十二醇硫酸鈉、十三烷基硫酸鎂、不同分子重量的聚こニ醇、Carbowax 4000和6000。可加入能改善藥物在制備中的流動特性和有助于壓縮中重排的助流劑。助流劑可包括淀粉、滑石、焦化硅石和水合硅鋁酸。為幫助治療劑溶解于水性環境，可加入表面活化劑作為潤濕劑。表面活化劑可包括陰離子洗滌劑如十二烷基硫酸鈉、磺基丁ニ酸鈉ニ辛酯和琥珀酸ニ辛酯鈉?？墒褂藐栯x子洗滌劑，包括苯扎氯銨或芐索氯銨。制劑中可作為表面活化劑的非離子洗滌劑列表是 聚桂醇400、聚こニ醇40硬脂酸酷、聚氧こ烯氫化蓖麻油10、50和60、單硬脂酸甘油酯40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酷、甲基纖維素和羧甲基纖維素。這些表面活化劑単獨或以不同比例的混合物存在于孕烯醇酮硫酸鹽制劑中。可ロ服的藥物制品包括明膠制成的推合膠囊、以及由明膠、塑化劑如甘油或山梨醇制成的軟的密封膠囊。推合膠囊包含活性成分、填充物如乳糖、粘合劑如淀粉、和/或潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂，以及可選的穩定劑的混合物。在軟膠囊中，活性化合物可溶于或懸于適當液體，所述液體如脂油、液體石蠟或液體聚こニ醇。另外，可加入穩定劑。也可采用ロ服用微球體。所述微球體是本領域所熟知的。所有ロ服制劑應為適合ロ服的劑型。對于頰側給藥，組合物可采用常規方式制成的片劑或錠劑形式。對于吸入施用，根據本申請所用化合物可方便地以來自加壓包或霧化器的氣霧噴霧形式傳遞，為此使用適當推進劑，例如ニ氟ニ氯甲烷、三氯氟甲烷、ニ氯四氟こ烷、ニ氧化碳或其它合適氣體。在加壓噴霧劑情況中，通過提供閥門按計量傳遞來確定劑量単位。用于吸入器或吹入器的例如明膠膠囊和彈筒可配制成含化合物和適當粉末基底如乳糖或淀粉的粉末混合物。本文也考慮了肺傳遞孕烯醇酮硫酸鹽。孕烯醇酮硫酸鹽在吸入時傳遞給哺乳動物的肺，然后穿過肺上皮層進入血流給。其它吸入分子的報導包括Adjei等，1990, Pharmaceutical Research, 7 :565-569 ；Adjei 等，1990, International Journalof Pharmaceutics，63 :135—144(leuprolide acetate； ；Braquet %=,1989, Journalof Cardiovascular Pharmacology,13(suppl.5) : 143-146(endothelin-1) ；Hubbard等，1989, Annals of Internal Medicine,卷 III,第 206-212 頁(al-antitrypsin)；Smith 等，1989，J. Cli n. Invest. 84 :1145-1146 (a-1-proteinase) ；0swein 等，1990， " Aerosolization of Proteins" ， Proceedings of Symposium on RespiratoryDrug Delivery II，Keystone, Colorado, March，(recombinant human growth hormone)；Debs 等，1988，J. Immunol. 140 :3482-3488 (interferon- Y and tumor necrosis factoralpha)和Platz等，美國專利號5，284，656(粒細胞集落刺激因子)。用于全身效果的肺傳遞藥物的方法和組合物描述于Wong等1995年9月I日發行的美國專利號5，451，569。本申請的實施可采用大量設計用于肺傳遞治療產物的機械設備，包括但不限于本領域技術人員熟悉的霧化器、計量劑量吸入器和粉末吸入器。適合本發明實踐的一些具體市售裝置例子是Mallinckrodt, Inc. , St. Louis,Missouri 生產的 Ultravent 霧化器；Marquest Medical Products, Englewood, Colorado生產的 Acorn II 霧化器；Glaxo Inc. , Research Triangle Park, North Carolina 生產的Ventolin 計量劑量吸入器；Fisons Corp. , Bedford, Massachusetts 生產的 Spinhaler 粉末吸入器。所有這些裝置需要使用適合分送孕烯醇酮硫酸鹽的制劑。通常，各制劑專門適合所用的裝置種類并使用合適的推進物質，此外還包括常用的稀釋劑、佐劑和/或載體外。也考慮使用脂質體、微膠囊或微球體、包合物或其它載體類型?？蓪⒒瘜W制備的孕烯醇酮硫酸鹽配制成不同制劑，這取決于化學修飾類型和所用裝置種類。適用于諸如噴射或超聲波霧化器的制劑通常包括溶于水或其它可藥用溶劑的孕烯醇酮硫酸鹽。制劑還可包含緩沖液和單糖(例如用于穩定孕烯醇酮硫酸鹽和調節滲透壓力)。霧化器制劑還可包含表面活性剤，以減少或防止噴霧形成中溶液原子化導致的表面誘發孕烯醇酮硫酸鹽集聚。用于計量吸入器裝置的制劑一般包括含孕烯醇酮硫酸鹽的精細粉末，其在表面活性劑幫助下懸于推進劑。推進劑可以使用與此目的的任何常規物質，如含氯氟烴、氫化含氯氟烴、氫氟碳化合物、或碳氫化合物，包括三氯氟甲烷、ニ氟ニ氯甲烷、四氟ニ氯こ醇、1，1，1，2_四氟こ烷或其組合。適當的表面活性劑包括三油酸山梨酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性剤。用于從粉末吸入裝置分送的制劑包括含孕烯醇酮硫酸鹽的精細干粉，還可包括填充劑如乳糖、山梨醇、蔗糖或甘露醇，其量達到可助粉末從裝置中分散出來，例如制劑重量的50%到90%。最好將孕烯醇酮硫酸鹽制成平均顆粒大小低于IOmm(或微米級)的顆粒形式，最優選0. 5到5mm,用于最有效傳遞到肺末梢?？煽紤]鼻(或鼻內)傳遞本申請的藥物組合物。鼻傳遞可使本申請的藥物組合物在治療產物施用給鼻后直接進入血流，不需要在肺中沉淀產物。鼻傳遞的制劑包含葡聚糖或環葡聚糖。對于鼻傳遞，所用裝置是附有計量噴霧器的小硬瓶。在一個實施方式中，傳遞計量是通過將本申請的藥物組合物吸入確定體積的小室，小室有孔，其尺寸可在小室中的液體受壓縮時通過形成噴霧來將氣霧劑霧化。通過壓縮小室來施用本申請的藥物組合物。在一個具體實施方式
中，小室裝有活塞。此類裝置可購買得到。或者，使用帶孔或開ロ的塑料擠瓶，孔或開ロ的大小可在擠壓時通過形成噴霧來霧化制劑。開ロ通常位于瓶頂部，頂部一般逐漸變細以部分配合鼻通道，從而有效施用霧化制劑。鼻吸入器優選提供計量霧化制劑的，可用于施用定量藥物。孕烯醇酮硫酸鹽也制成直腸或陰道組合物，如栓劑或保留灌腸，例如含常規栓劑基底如可可油或其它甘油酯的那些。除了上述制劑外，孕烯醇酮硫酸鹽也可制成貯存型制劑。所述長效制劑可用適當的聚合或疏水物質(例如用可接受油配成乳剤)或離子交換樹脂來配制，或制成難溶衍生物,例如難溶鹽。藥物組合物還可包含適當的固相和凝膠態載體或賦形劑。所述載體或賦形劑的例子包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、多種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚合物如聚こニ醇。適當的液體或固體藥物制品形式是例如水或鹽水溶液、用于吸入、裝入微膠囊、螺卷化(encochleated)、包被到微小金粒上、包含于脂質體、霧化、氣霧劑、用于植入皮膚的彈丸、或在干燥粘附到鋒利物體上后通過刮擦進入皮膚。藥物組合物還包括細粒、粉末、片劑、包被片劑、(微)膠囊、栓劑、糖槳、乳剤、懸浮液、乳脂、滴劑或延長活性化合物釋放的制劑，其中制備所用賦形劑和添加物和/或輔助物如崩解劑、粘合剤、涂層劑、膨脹劑、潤滑劑、調味劑、增甜劑或增溶劑如上所述，按常規使用。本發明藥物組合物適用于多種藥物傳遞系統。簡要的藥物傳遞方法綜述參見Langer，Science 249 :1527_1533，1990，其以引用的方式并入本文中。治療劑包括但不限于以粒子形式提供的孕烯醇酮硫酸鹽。本文所用粒子指納米或微米顆粒(或在某些例子中更大)，可全部或部分由孕烯醇酮硫酸鹽或本文所述其它治療劑組成。粒子可包含治療劑作為核心，外包包衣，包括但不限于腸溶包衣。治療劑也可分散在粒子中。治療劑也可吸收到粒子中。粒子可以具有任意級別釋放動力學，包括零級釋放、ー級釋放、ニ級釋放、延遲釋放、維持釋放、立即釋放和其組合。除了治療劑之外，粒子可包括藥學和醫學領域常規使用的物質，包括但不限于易蝕、非易蝕、可生物降解、或非生物降解的材料或其組合。粒子可以是含溶液或半固體狀態孕烯醇酮硫酸鹽的微膠囊。粒子可以是幾乎任何形狀。非生物降解和可生物降解聚合物都能用于制造傳遞治療劑的粒子。所述聚合物可以是天然或合成聚合物。聚合物基于所需釋放時間段選擇。具有特別興趣的生物粘性聚合物包括 H. S. Sawhney, C. P. Pathak 和 J. A. Hubell in Macromolecules, (1993) 26 :581-587描述的生物蝕解水凝膠，其內容以引用的方式并入本文中。所述聚合物包括聚透明質酸、酪蛋白、明膠、麥蛋白、聚酐、聚丙烯酸、藻酸鹽、脫こ酰殼多糖、聚(甲基丙烯酸甲酷)、聚(甲基丙烯酸こ酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸異癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酷)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酷)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)和聚(丙烯酸異十八酷)。治療劑可包含于控制釋放系統。術語“控釋”涉及藥物從制劑釋放的方式和分布受到控制的含藥物制劑。這指立即以及非立即釋放制劑，非立即釋放包括但不限于維持釋放和延遲釋放制劑。術語“維持釋放”(也稱為“延長釋放”)在一般指在延長時間段內持續釋放藥物的藥物制劑，雖非必要但為優選地在延長時間段內產生基本恒定的血液藥物水平。術語“延遲釋放” 一般指藥物從施用到從中釋放有時間延遲的藥物制劑。“延遲釋放”可以包括或不包括在延長時間段內持續釋放藥物，因此，可以是或不是“維持釋放”。長期維持釋放植入體可能特別適合治療慢性病。本文所用“長期”釋放指植入體被構建并安排成能夠按治療水平傳遞活性成分的時間至少7天，優選30-60天。長期維持釋放植入體是本領域普通技術人員已知的，包括上述的某些釋放系統。對于眼、鼻膜、粘膜或皮膚的局部施用，可將孕烯醇酮硫酸鹽制成油膏、霜劑或乳液、或制成透皮貼片或眼內插入裝置或離子電滲治療劑。例如，油膏和霜劑可單獨用水性或油性基底或與適當增厚劑或膠凝劑一起制成。乳液可以用水性或油性基底制成，通常還包含ー種或多種乳化剤、穩定劑、分散劑、懸浮劑、增厚劑或著色劑。(參見例如美國申請號5，563，153，名為“無菌局部麻酔凝膠”，Mueller, D.等發布，描述了基于凝膠的可藥用局部載體。)
一般，按重量計，孕烯醇酮硫酸鹽存在于局部制劑的量約為組合物總重量的0. 01%到30. 0%。孕烯醇酮硫酸鹽存在量優選從約0. 5%重量到約30%重量，孕烯醇酮硫酸鹽存在量最優選從約0.5%重量到約10%重量。在一個實施方式中，本申請的組合物包括凝膠混合物，用于獲得與局部疼痛表面的最大接觸，同時盡可能減少緩解局部疼痛所需體積和劑量。GELFOAM (Upjohn Corporation生產的ー種基于甲基纖維素的凝膠)是優選的可藥用局用載體。其它可藥用載體包括用于經皮膚傳遞的離子電滲載體。本申請還考慮使用試劑盒。在本申請的ー些方面，試劑盒包括藥物制備瓶、藥物制備稀釋瓶和孕烯醇酮硫酸鹽。含用于藥物制備的稀釋劑的瓶是可選的。稀釋劑瓶包含稀釋劑如生理鹽水用于稀釋可能為濃縮溶液或凍干粉末形式的孕烯醇酮硫酸鹽。說明書可包括關于混合特定量稀釋劑與特定量濃縮藥物制品從而制備用于注射或輸入的最終制劑的說明。說明書可包括用有效量孕烯醇酮硫酸鹽治療對象的說明。并且，含制品的容器可具有標記如當制品高壓滅菌或以其它方式無菌化時會變色的常規標記，所述容器可以是瓶、帶分隔的小瓶、帶分隔的安瓶、液袋等。本申請不局限于下列描述或附圖所示的詳細成分組成和安排。本申請允許未述及的其它實施方式，可以多種方法實施。同樣，本文所用表達和術語是為了描述目的，不應視作限制?！鞍ā?、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”和其它變形涵蓋其后所列的項目和其等價物以及其它項目。描述了本申請ー個實施方式的諸多方面后，本領域技術人員可想到多種改變、修飾和改進。這些改變、修飾和改進是本申請的一部分，在本申請的精神和范圍內。因此，上面提到的描述和附圖僅作為例子。以下將通過實施例進ー步闡述本申請，這些不是限制。本申請中引用的所有參考文獻(包括文獻、專利、公開的專利申請和尚未審定的相關專利申請)全部以引用的方式并入本文中。
實施例實施例IPREGS對B104細胞存活的效果為了確定PREGS是否具有神經毒性，在培養的B104細胞中進行劑量-響應研究。用從0. 25到40 ii M范圍的不同濃度PREGS處理B104細胞24小時。以細胞存活百分比表示的結果顯示PREGS無神經毒性，與對照細胞相比不影響這些細胞的存活(圖I)。實施例2
PREGS的親神經活性 在低密度培養的B104細胞中測定PREGS的親神經活性。與對照細胞相比，5yMPREGS存在下培養7天，觀察到了顯著的神經元細胞產物(圖2)。實施例3人A 0 !_42肽纖維形式對B104細胞的壞死效果用IOii M人AP卜42肽處理僅6小時后，B104細胞相較對照細胞表現出明顯的壞死效果。此外，A P 1-42肽從5 u M増加至IJ 20 u M時，觀察到顯著的劑量依賴性壞死(圖3)。實施例4PREGS對B104細胞抗人A ^ ^42肽纖維形式毒性的神經保護分析PREGS糾正人AP卜42肽所誘導細胞毒性的能力。20iiM PREGS能保護B104細胞抗20 ii M人A Pト42肽。在第24小時觀察到效果，并維持到96小時(圖4)。實施例5材料和方法a)細胞培養模式因其在無血清培養基中生長時的神經元表型而選擇大鼠B104神經節細胞作為細胞培養物模型(Schubert等自然(Nature) 1974 ；249 :224-27)。B104細胞按常規培養在75cm2燒瓶中，所用完全培養基含添加2mM L-谷氨酰胺、青霉素G(50U/ml)、硫酸鏈霉素(50iig/ml)、10%胎牛血清和5%馬血清的達氏改進依氏培養基(DMEM)。每周對細胞進行再次培養，且每3天更換培養基。在90%空氣和10% CO2的加濕培養箱中37°C維持細胞培養物。對于實驗，細胞以所需密度在血清完全培養基中平板培養24小時，隨后用含或不含所需處理的無血清培養基置換培養基。b)神經甾體和P -淀粉樣肽制品制備初始濃度IM 的類固醇 PREG(Sigma)、PREGS (Steraloids)、ent-PREGS (St.Louis,Missouri) >PR0G(Sigma)、別孕烯醇酮(Sigma)和 E2 (Sigma)的こ醇(0. 05% )溶液。進行劑量-反應實驗，類固醇在培養基中稀釋到實驗需要的最終濃度。PROG和E2用作正對照。A0卜42獲得自Bachem并制備成已知介導神經毒性的纖維形式(Lorenzo等Proc NatlAcad Sci USA 1994;91:12243-47)。如下所述生產A @卜42 :將該肽溶于重蒸餾水(ddH20)到 IOii g/iil，之后于 37°C 振蕩(300-400rpm)孵育 I 周。使用B104人神經節細胞培養物在體外研究了兩種不同但互補的方法I)PREGS或ent-PREGS的潛在親神經效果和2) PREGS或ent-PREGS抗A P ^42肽誘導神經毒性的潛在神經保護活性。在兩項研究中，將E2、PROG或別孕烯醇酮(PR0G的還原代謝物)之類類固醇代謝物用作正對照，已知它們在不同神經元毒性模型中表現出神經保護性質。細胞存活-流式細胞術采用流式細胞術觀察反映AP i_42神經毒性效果以及神經甾體神經保護效果的細胞凋亡或壞死百分比，為此，用對磷脂酰絲氨酸(PS)有親和性的膜聯蛋白V染色細胞(VanGenderen et al. 2006)。在正常活細胞中，PS位于細胞膜的細胞質側。然而，在凋亡細胞中，PS從內部轉移到質膜的外片，在此，膜聯蛋白V能結合PS。此外，膜聯蛋白V能穿過壞死細胞受損的膜從而結合細胞內部的PS (Van Genderen等 Nat Protoc 2006;1:363-67)。細胞以所需密度接種到6孔板中，生長24小吋。隨后根據兩種操作步驟處理細胞用特定類固醇后用AP卜42或用AP卜42后用類固醇。根據肽濃度，在6、12或24小時進行動力學研究。為了進行流式細胞分析，用PBS洗滌細胞并通過胰蛋白酶消化收集細胞。離心和重懸于膜聯蛋白結合緩沖液，用5-25 Ul膜聯蛋白V孵育15分鐘，然后用膜聯蛋白結合緩沖液洗滌細胞，通過流式細胞術進行檢測。用適當軟件檢測數據，分析分布圖。
實施例6MTT 測試在類固醇存在或沒有時，通過3-(4，5_四甲基噻唑-2-yl)_2，5-ニ苯基溴化四唑實驗(體外毒理學測試試劑盒，MTT based, Sigma)確定AP卜42對B104細胞的神經毒性作用。細胞以所需密度接種到96孔板中，生長24小吋。隨后根據上述兩種操作步驟對細胞做不同時間(6、12或24小時)處理用特定類固醇后用AP卜42或用AP卜42后用類固醇。在孵育結束時，加入含5mg/ml MTT的磷酸鹽緩沖液(PBS)到各孔，孵育再進行4小吋。最后，加入100 ill含50% ニ甲基甲酰胺、20%酸性異丙醇的增溶溶液。使用自動微量滴定讀數儀在590nm測定吸收值。各實驗重復3次。實施例7錐蟲藍用錐蟲藍評估細胞存活性。B104細胞在6孔板中生長24小時，在上述流式細胞術或MTT測試的條件下進行處理。用I. 5%錐蟲藍(Sigma)溶液染色細胞至少10分鐘，用PBS洗滌。在相差顯微鏡下用血細胞計數器計數未染色或細胞。所有測試和細胞計數重復3次。實施例8免疫細胞化學通過免疫標記方法研究PREGS和ent-PREGS的親神經效果，使用某些神經元標記小鼠抗68KD神經絲蛋白突光抗體(Sigma)、小鼠抗神經元核(NeuN)單克隆抗體(Chemicon)。在特定神經留體存在或沒有(對照)的條件下培養的B104細胞在こ醇/乙酸(95 5)中固定4分鐘，在含2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中洗滌和孵育30分鐘以阻斷非特異性結合。用適當ー級抗體稀釋液室溫(RT)進行B104免疫染色2小吋。隨后，洗滌細胞并用羊抗小鼠IgG孵育。在顯微鏡(Leica或Zeiss Axiovert 135M，微設置表面熒光系統或光學顯微鏡Nikon Labophot 2)下檢測免疫染色著染的細胞。統計分析數據表示為平均值±3次或更多單獨實驗的S.E.M，各自重復3次。對于所有實驗，用方差分析法(AN0VA;用于各組中不同參數的単獨系列)對照組和處理組進行統計學比較，隨后如必要進行Newman-Keuls post-hoc測試。顯著性水平定為p < 0. 05。
權利要求
1.一種治療患神經系統疾病或功能紊亂對象的方法，其特征在于，所述方法包括 將孕烯醇酮硫酸鹽(PREGS)施用給對象，施用的量為治療神經系統疾病或功能紊亂的有效量。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述孕烯醇酮硫酸鹽是合成的PREGS(-)對映異構體(ent-PREGS)。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述神經系統疾病或功能紊亂是年齡相關的神經變性、阿爾茨海默病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、進行性腦灰質萎縮、巴藤病、瘋牛病(BSE)、化療誘發的神經病變、克雅病、糖尿病性神經病變、唐氏綜合癥、額顳葉變性、亨廷頓病、HIV相關性癡呆、克拉貝病、路易體癡呆、多系統性萎縮、尼曼-皮克病、帕金森病、多神經炎、朊病毒病、原發性側索硬化、雷弗素姆氏病、山霍夫氏病、老年癡呆癥、少年型家族性黑朦性癡呆、脊髄小腦性共濟失調、脊髄性肌萎縮、亞急性脊髄混合變性、脊髓癆或血管性癡呆。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述神經系統疾病或功能紊亂由燒傷、外傷性損傷、機械性損傷、手術損傷、生理損傷、病理性損傷或免疫性損傷引起。
5.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述神經系統疾病或功能紊亂是神經變性疾病。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述神經變性疾病由神經元組織中￠-淀粉樣肽積聚引起。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述￠-淀粉樣肽是A0 1-42。
8.一種治療具有以神經元組織中￠-淀粉樣肽積聚為特征病情的對象的方法，其特征在于，所述方法包括 將孕烯醇酮硫酸鹽(PREGS)施用給對象，施用的量為治療病情的有效量。
9.一種減少或預防神經元組織中￠-淀粉樣肽積聚的方法，其特征在于，所述方法包括 使神經元組織接觸孕烯醇酮硫酸鹽(PREGS)，接觸的量為減少或預防神經元組織中 淀粉樣肽積聚的有效量。
10.如權利要求8-9所述的方法，其特征在于，所述爲-淀粉樣肽是六ら吣。
11.如權利要求8-9所述的方法，其特征在于，所述孕烯醇酮硫酸鹽是合成的PREGS(-)對映異構體(ent-PREGS)。
12.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述病情是阿爾茨海默病、唐氏綜合癥或路易體癡呆。
13.ー種刺激或促進神經元細胞生長的方法，其特征在于，所述方法包括 使神經元組織接觸孕烯醇酮硫酸鹽(PREGS)，接觸的量為刺激或促進神經元細胞生長的有效量。
14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述孕烯醇酮硫酸鹽是合成的PREGS(-)對映異構體(ent-PREGS)。
15.如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述神經元細胞處于組織之中。
16.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述組織是腦組織、脊髄組織或外周神經組織。
17.如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述神經元生長包括神經突觸生長。
18.如權利要求1-17中任一項所述的方法，其特征在于，所述孕烯醇酮硫酸鹽經ロ、靜脈內、肌肉內、鞘內、舌下、頰側、鼻內、關節內、腹膜內、皮下或局部施用。
19.如權利要求1-17中任一項所述的方法，其特征在于，所述孕烯醇酮硫酸鹽是預防性施用。
20.如權利要求1-17中任一項所述的方法，其特征在于，所述對象若非如上所述沒有需用孕烯醇酮硫酸鹽治療的跡象。
21.如權利要求1-17中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法進ー步包括施用除了孕烯醇酮硫酸鹽外的藥劑。
全文摘要
本申請分涉及使用孕烯醇酮硫酸鹽(PREGS)抗β-淀粉樣肽Aβ1-42神經毒性的方法。本申請還公開了使用孕烯醇酮硫酸鹽治療神經系統疾病或功能紊亂的方法。本申請進一步公開提供使用孕烯醇酮硫酸鹽方法刺激或促進神經元細胞生長。
文檔編號A61K31/56GK102625703SQ200980157216
公開日2012年8月1日 申請日期2009年12月9日 優先權日2008年12月9日
發明者C·N·阿德拉 申請人:費薩爾國王專科醫院及研究中心