專利名稱：MyD88拓撲類肽化合物作為免疫抑制劑在醫學上的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種小分子化合物作為免疫抑制劑在醫藥和科研領域的應用，尤其是
在抗移植排斥、抗自身免疫疾病、抗缺血再灌注損傷和抗慢性炎癥反應方面的用途。
背景技術：
在本發明提出之前，本領域的醫學專家十分清楚，對機體免疫系統的抑制性調控 是治療多種疾病的關鍵，如治療器官移植后排斥反應、自身免疫性疾病、慢性炎癥性疾病、 缺血再灌注損傷等。而對免疫系統的調控可以從多方面入手的，而天然免疫反應作為近期 研究的熱點，是一個極佳的達成免疫抑制的方向。 機體免疫反應分為天然免疫和獲得性免疫。其中，后者因為其特異性極強的識別 功能和高效的反應效果一直以來被當作移植免疫的主要研究對象和干預標靶。傳統免疫 反應被認為是由獲得性免疫系統的第一和第二剌激信號激活NF-k B，激活的NF-k B進入 細胞核，啟動轉錄，細胞合成和分泌各種炎性細胞因子，引發隨后的一系列免疫反應。目前 的抗排斥藥物都是作用在獲得性免疫系統上的。天然免疫一直被認為是機體的天然保護 屏障，主要是抗擊病毒細菌感染、外來生物入侵等，但最近幾年大量的研究發現天然免疫系 統在移植免疫、自身免疫性疾病和缺血損傷等方面發揮著極其重要的作用。天然免疫系統 中又以Toll樣受體(Tool-Like Rec印tor， TLR)發揮最主要的作用而最受關注，目前發現 TLR有至少14個亞型，主要分布在APC等免疫細胞上，這些亞型除了 TLR3以外，都要通過 髓樣分化蛋白(myeloid-differentation protein 88，MyD88)分子傳遞信號。大量的研究 顯示各種內源性和外源性的危險因子，剌激天然免疫系統的各個TLR，剌激信號經關鍵分子 MyD88傳導，最后也激活NF-k B，其后的免疫反應過程與前述的一樣。 因此，簡而言之，MyD88就是天然免疫的關鍵分子節點，阻斷了 MyD88就阻斷了天 然免疫系統的主要反應，進而產生相應的免疫抑制效果。如果能夠用一種治療藥物對其進 行干預和阻斷，就能夠阻斷整個TLR途徑從而達成一系列的免疫調控，可以預見這是達成 免疫抑制的一條極佳的方案。 目前全世界成千上萬的研究報告驗證了此分子的重要性及阻斷其后能達成的治 療效果，但都沒有找到一種能對其進行抑制的藥物。而其它的對MyD88分子的干涉途徑如 基因敲除等方法不能臨床應用。 本發明設計人在TLR/MyD88方面所作的一系列前期研究，驗證了 TLR在移植免疫 中起著重要作用，并通過對MyD88基因敲除小鼠的研究證實阻斷MyD88分子能夠誘導和維 持移植免疫耐受，而在后期的相關研究中，本發明設計人通過反復篩選獲得了一類MyD88 拓撲抑制劑一種類肽小分子化合物(代號ST2825)，此類小分子物質為一種鹵代的七烷， 由于結構上和MyD88分子的關鍵活化部位類似，故能夠競爭性結合而抑制MyD88相應的信 號傳導。因此，將MyD88拓撲類肽小分子化合物ST2825應用于免疫抑制，開創了這種小分 子物質作為免疫抑制劑的應用的先河，為多種免疫相關性疾病找到了一種新的藥物治療可

發明內容
本發明的目的在于篩選和利用MyD88拓撲類肽小分子化合物作為免疫抑制劑，利 用其對天然免疫中MyD88分子的抑制作用達到對機體免疫抑制的作用，從而治療多種免疫 相關性疾病。實現本發明的具體技術方案的基礎在于，本發明首先提出MyD88分子類似物 作為免疫抑制劑，是利用其對天然免疫中MyD88分子的抑制作用。 本發明所述的MyD88蛋白由兩個結構域組成包括TIR(toll/IL-l recptor domain)域和DD域(death domain), TIR域是MyD88發生自身同源二聚化的物質基礎，進 而活化下游的IRAKI或IRAK4等激酶。經過對MYD88的TIR域的拓撲結構學分析后，合成 的七肽修飾物經試驗證明能有效的抑制MyD88轉導的信號。其為一種MyD88拓撲類肽化合 物，分子式PAM4-SP19-Beta8-NH2 麗=591. 0。它能特異性的結合在MyD88的TIR域，干 擾MyD88的TIR域的功能，阻止MyD88形成同源二聚體，使MyD88不能活化，從而阻斷MyD88 通路轉導，進而不能激活NF-k B，阻斷了炎性反應，因而在相關的炎癥及免疫疾病治療方面 有重要作用。 本發明所指的MyD88拓撲類肽小分子化合物ST2825分子結構如下
分子式PAM4-SP19-Beta8-NH2 麗=591. 0。 根據MyD88 TIR域共有序列H-Arg-Asp-Val-Leu-Pro-Gly-Thr-OH包含的三個區， Arg-Asp帶電區，Val-Leu-Pro疏水區和Pro-Gly-Thr B-轉角區其分別用不同的類似物(天 然或非天然氨基酸)取代，保持其酰胺連接。 構建MYD88TIR域一致序列的模擬結構，由三個不同區域組成一個由Arg-Asp組
成的帶電基團PAM4 <formula>formula see original document page 4</formula>
Val-Leu組成的疏水基團SP19
和一個Leu-Pro-Gly-Thr組成的P _轉角區Beta8。
<formula>formula see original document page 5</formula>
每個區段分別用不同的結構模擬代替，保持原有的酰胺功能性連接。 本發明MyD88同型二聚體抑制劑ST2825分子極小，結構穩定，可穿透細胞膜，并可
同時在體內外應用。 本發明一種作用于MyD88拓撲類肽化合物，作為TLR信號通路抑制劑，在制備免疫 抑制劑類藥物上的應用。 本發明一種作用于MyD88拓撲類肽化合物，用于制備免疫抑制劑類藥物，在治療 減低移植后排斥反應以及移植免疫耐受誘導和維持方面的應用。 本發明一種作用于MyD88拓撲類肽化合物，用于制備免疫抑制劑類藥物，在治療 多種慢性炎癥性疾病上的應用。例如慢性炎癥性腸病、哮喘等。 本發明一種作用于MyD88拓撲類肽化合物，用于制備免疫抑制劑類藥物，在治療 多種自身免疫性疾病上的應用。例如I型糖尿病、多發性硬化癥、紅斑狼瘡等。
本發明一種作用于MyD88拓撲類肽化合物，用于制備免疫抑制劑類藥物，在治療 缺血再灌注損傷類疾病上的應用。例如預防和治療心梗后缺血再灌注損傷、斷肢再植后缺 血再灌注損傷、移植物術后的缺血再灌注損傷以及器官保存液、細胞保存液的制作等。
本發明的優越性MyD88拓撲類肽化合物作為免疫抑制劑在應用實驗中充分證實 了 MyD88抑制劑在用于移植后抗排斥和誘導免疫耐受具有明顯的效果。將是一種特殊的免 疫抑制劑、或移植耐受誘導劑、或移植耐受維持劑。其獨特的作用是目前的免疫抑制劑不可 比擬和替代的。MyD88抑制劑可降低CD80表達，從而阻止DC細胞的成熟。DC細胞成熟已 被證明為多種自身免疫性疾病如自身免疫性心肌病、實驗自身免疫性葡萄炎、I型糖尿病、 多發性硬化癥、紅斑狼瘡等發病的關鍵步驟之一。故MyD88抑制劑可用于此類疾病的治療。 MyD88途徑阻斷可以明顯起到對缺血再灌注損傷的保護作用，故MyD88抑制劑可用于防止 如心梗后缺血再灌注損傷、斷肢再植后缺血再灌注損傷、移植物術后的缺血再灌注損傷、器 官保存液、細胞保存液等許多方面起到重要作用。體外實驗結果表明MyD88抑制劑通過抑 制該通路能有效減少移植物內炎癥因子水平，說明其與炎癥因子的產生密切相關，故可能 成為各類炎癥治療的有效手段。


圖1心臟移植物生存曲線
圖2皮膚移植物生存曲線圖 圖3ELISP0T圖結果示移植皮膚耐受鼠對供體抗原特異性低反應 圖4分別以圖4 (a) 、 (b) 、 (c) 、 (d) 、 (e) 、 (f) 、 (g) 、 (h)標示MyD88拓撲類肽化合
物ST2825抑制LPS、 CpG引起的共剌激分子CD80的上調圖
圖5MyD88拓撲類肽化合物ST2825減低糖尿病發生率曲線圖 圖6分別以圖6 (a) 、 (b) 、 (c)標示MyD88拓撲類肽化合物ST2825影響移植受體體
內淋巴細胞亞群流式圖 圖7MyD88拓撲類肽化合物ST2825減輕心臟缺血再灌注損傷梗死面積圖 圖8MyD88拓撲類肽化合物ST2825減弱CpG剌激DC活化引發的T細胞增殖流式
圖 圖9分別以圖9 (a) 、 (b) 、 (c)標示MyD88拓撲類肽化合物ST2825減少移植物內炎
性因子實時定量PCR分析圖(IL-113 ， TNF- a ， IL_6三種炎性因子相對水平) 圖10分別以圖10 (a) 、 (b) 、 (c) 、 (d)標示MyD88拓撲類肽化合物ST2825減少肺
炎模型中炎性細胞滲出圖 圖11分別以圖11 (a) 、 (b) 、 (c) 、 (d)標示MyD88拓撲類肽化合物ST2825減少肺炎模型中炎癥因子滲出圖 在附圖1中Balb/c和C57bl/6為兩種小鼠品系 分組Balb/c心臟移植給C57bl/6為普通對照組，CMC溶媒對照組，C57bl/6到C57bl/6為同系對照圖，ST2825實驗組 在附圖2中異基因皮膚移植對照組(文獻報導排斥時間為8-10天)、單用ST2825組、單用MR1組和聯合用藥組(ST2825+MR1) 在附圖3中(1實驗組，2第三方對照，3排斥陽性對照，4ConA對照，5自身對照)
A為IFN- Y讀板代表性圖片皮肽耐受的C57BL/6受者對供者Balb/c來源的脾細胞剌激反應明顯弱于非相關第3方C3H抗原剌激，第1列<第2列。第3組為移植排斥組(反應極強)，第4組為ConA非特異剌激C57BL/6細胞活化陽性對照，第5組為C57BL/6細胞自身剌激組。 B為IL-4讀板代表性圖片皮膚耐受的C57BL/6受者對供者Balb/c來源的脾細胞剌激反應與非相關第3方C3H抗原剌激反應相當，第1列"第2列。第3組為移植排斥組，第4組為ConA非特異剌激C57BL/6細胞活化陽性對照，第5組為C57BL/6細胞自身剌激組。 在附圖4中，a為DC圈門，b為CD80陰性對照，cd為LPS剌激DC， ST2825下調CD80的表達；ef為CpG剌激DC， ST2825下調CD80的表達；g、 h為心肌組織勻漿溶媒剌激DC， ST2825下調CD80的表達 在附圖5中，實驗分組MyD88K0 NOD小鼠，MyD88K0/+N0D小鼠，NOD小鼠ST2825用藥組 在附圖6中，圖6(a、b)為不同移植組別受體脾臟內淋巴細胞亞群分析(同基因組，治療組，對照組)(c)顯示ST2825治療的移植受者體內CD4+CD25+Fo鄧3+T細胞比例明顯上調 在附圖7中，RA危險區LV左心室IA缺血區 I/R對照組I/R CMC為溶媒對照組I/R ST2825為實驗組 在附圖10中，分別以圖10(a) 、 (b) 、 (c) 、 (d)分別為支氣管肺泡中細胞總數，中性粒細胞數，淋巴細胞數，和巨噬細胞數 在附圖11中，圖11 (a)為支氣管肺泡中性粒細胞數，圖11 (b)為肺組織中髓過氧化酶活性，圖11(c)和圖11(d)為肺組織中角質化細胞衍生趨化因子和白細胞介素-6
具體實施方法 應用實例1 :MYD88類肽化合物在移植后抗排斥反應和誘導移植免疫耐受方面的應用實驗。 1)MYD88拓撲類肽化合物ST2825用于小鼠心臟移植模型
實驗共分為四組，分別為 空白對照組(不做任何處理，做心臟移植)、CMC組(溶媒對照組)、同系心臟移植組(理論上同系無排斥，長期存活)和ST2825用藥組(效果檢測組)。具體處理方法如下
空白對照組取Balb/c小鼠心臟移植到C57bl/6小鼠腹腔，術后不做特殊處理；
CMC對照組取Balb/c小鼠心臟移植到C57bl/6小鼠腹腔，術后心臟移植前第0天到第6天給予腹腔注射不含ST2825的羧甲基纖維素鈉(CMC)溶液； 同系心臟移植組取C57bl/6小鼠心臟移植到同系C57bl/6小鼠腹腔，術后不做特殊處理； ST2825用藥組取Balb/c小鼠心臟移植到C57bl/6小鼠腹腔，術后心臟移植前第0天到第6天給予腹腔注射溶于CMC的ST2825， 150mg/kg。 所得到實驗結果如生存曲線圖(見附圖1)所示，結果顯示空白對照組和文獻報道
排斥時間基本一致，為8天左右；CMC溶媒對照組無差異；同系心臟移植組心臟長期存活，
ST2825用藥組平均心臟移植物存活時間20天左右，較對照組有明顯延長。 2)MYD88拓撲類肽化合物ST2825聯合共剌激分子抑制劑_抗CD154單抗(MR1)用
于小鼠皮膚移植模型 實驗分為4組異基因皮膚移植對照組(文獻報導排斥時間為8-10天)、單用ST2825組、單用MR1組和聯合用藥組(ST2825+MR1)。
具體處理方式如下 異基因皮膚移植對照組取Balb/c小鼠皮膚移植到C57bl/6小鼠背部，術后不做特殊處理； 單用ST2825組取Balb/c小鼠皮膚移植到C57bl/6小鼠背部，術后第0-3， 5， 7，9， 11， 13， 15天150mg/kg分別腹腔注射溶于CMC的ST2825， 150mg/kg ;
單用MR1組取Balb/c小鼠皮膚移植到C57bl/6小鼠背部，術后第0， 1， 3， 7， 14天給予腹腔注射MR1 ， 200 ii g/天； 聯合用藥組取Balb/c小鼠皮膚移植到C57bl/6小鼠背部，術后術后第0_3，5，7，9， 11， 13， 15天150mg/kg分別腹腔注射溶于CMC的ST2825， 150mg/kg，同時第0-3， 5， 7， 9，H，13，15天150mg/kg給予腹腔注射MRl，200ii g/天。 所得到實驗結果如生存曲線圖(見附圖2)所示，異基因皮膚移植對照組移植物排斥時間為10天左右，和文獻報導時間一致 單用ST2825組和單用MR1組皮膚移植物排斥時間10天左右，無統計學差異，而聯合用藥組(ST2825+MR1)皮膚移植物長期存活達150天(文獻認為> IOO天為移植物耐受)
可見ST2825和MR1單用對耐受誘導無明顯效果，但聯合應用效果顯著，能使及其難以誘導耐受的皮膚移植物長期存活。 體外實驗Elispot顯示MyD88抑制劑ST2825聯合MR1作皮膚移植后出現對供體
7抗原特異性低反應
步驟及結果 步驟分離出存活170天耐受了皮膚移植物的C57BL/6鼠的淋巴細胞，與不同剌激細胞混合培養于ELISPOT板3天后，做ELISPOT攝相檢測。 為檢測對移植皮膚長期耐受鼠的免疫細胞功能狀態，分離出存活170天耐受了皮膚移植物的C57BL/6鼠的淋巴細胞，與不同剌激細胞混合培養于ELISPOT板3天后，做ELISPOT攝相檢測。分組及檢測結果見附圖3。結果顯示耐受了移植皮膚的小鼠對供體源抗原反應低下，而對無關第三方抗原和ConA等的剌激反應強烈，說明該鼠已處于對供體源抗原特異性無反應狀態——即免疫耐受狀態。該結果證實皮膚移植后經過ST2825+MR1短期治療，可以誘導移植受者產生強烈而穩定的移植耐受，使通常不能移植成功的皮膚移植物被長期耐受。 附圖3 :ELISPOT結果示移植皮膚耐受鼠對供體抗原特異性低反應。
組 別1實驗組2第三方對照3排斥陽性對 昭4ConA對照5自身對照
反應D170移植皮膚D170移植皮膚D15移植皮膚D170移植皮膚耐D170移植皮膚耐
細胞耐受C57BL/6耐受C57BL/6已排斥C57受C57BL/6受C57BL/6
(ST2825+MR1)(ST2825+MR1)BL/6(ST2825+MR1)(ST2825+MR1)
刺激 細胞Balb/cC3HBalb/cConAD170移植皮膚耐 受的C57BL/6 附圖3A :IFN-Y讀板代表性圖片皮膚耐受的C57BL/6受者對供者Balb/c來源的脾細胞剌激反應明顯弱于非相關第3方C3H抗原剌激，第1列<第2列。第3組為移植排斥組(反應極強)，第4組為ConA非特異剌激C57BL/6細胞活化陽性對照，第5組為C57BL/6細胞自身剌激組。 附圖3B :IL-4讀板代表性圖片皮膚耐受的C57BL/6受者對供者Balb/c來源的脾細胞剌激反應與非相關第3方C3H抗原剌激反應相當，第1列"第2列。第3組為移植排斥組，第4組為ConA非特異剌激C57BL/6細胞活化陽性對照，第5組為C57BL/6細胞自身剌激組。 以上實驗結果直接和間接說明，MyD88抑制劑在用于移植后抗排斥和誘導免疫耐
受具有明顯的效果。將是一種特殊的免疫抑制劑、或移植耐受誘導劑(短期用藥即可使極
難移植成功的皮膚移植物長期存活)、或移植耐受維持劑(如可對抗病菌感染所誘發的排
斥)。其獨特的作用是目前的免疫抑制劑不可比擬和替代的。 應用實例2 :MyD88抑制劑在治療自身免疫性疾病中的應用實驗。 體外實驗——細胞流式儀結果證明MyD88抑制劑可阻止DC成熟，用于治療自身
免疫性疾病。 步驟1.應用了 ST2825的BALB/c小鼠來源骨髓細胞，破紅2 X 106/ML密度RPMI1640培養基(加GM-CSF10ng/ml， IL-410ng/ml)
2. 48小時去懸浮細胞，第六天收懸浮及半貼壁細胞 3.DCs加50mM ST2825培養1小時，加入壞死心肌上清液，LPS (200ng/ml) ， Poly I:
C(20mg/ml) ， CpG(10mg/ml)培養12小時 4.加流式抗體FITC標記抗CD80， CD86，上機檢測 ST2825抑制了 RAW264. 7細胞對TLR剌激物(LPS、CpG)引起的共剌激分子CD80的
上調，說明ST2825能夠有效的阻斷TLR信號通路，進而抑制了細胞的免疫反應。 附圖4 :ST2825抑制LPS、 CpG引起的共剌激分子CD80的上調 以上檢測結果說明MyD88抑制劑可降低CD80表達，從而阻止DC細胞的成熟。DC
細胞成熟已被證明為多種自身免疫性疾病如自身免疫性心肌病、實驗自身免疫性葡萄炎、I
型糖尿病、多發性硬化癥、紅斑狼瘡等發病的關鍵步驟之一。故MyD88抑制劑可用于此類疾
病的治療。 體內試驗應用MyD88-/_以及ST2825對構建I型糖尿病模型的影響
實驗步驟 1.實驗分組MyD88K0 NOD小鼠，MyD88K0/+N0D小鼠，NOD小鼠ST2825用藥組
2.用藥組抗原注射前兩周腹腔注射溶于CMC的ST2825,150mg/kg
2.腹腔注射分支桿菌抗原并持續監測其濃度 3.清潔級飼養觀察30周，取尾靜脈血，測非空腹血糖，連續2次所測血糖
> 22mmol/L為糖尿病建模標準 所得I型糖尿病發生率曲線見附圖5 : 結果顯示MyD88K0雜合子組隨著時間延長I型糖尿病發生逐漸增加，而MyD88K0
純合子組無I型糖尿病發生，ST2825組I型糖尿病發生率與MyD88K0純合子組相當，說明
MyD88通路與I型糖尿病的發生有必然的聯系，阻斷其通路能減少糖尿病的發生，因此小分
子MyD88抑制劑ST2825可能成為I型糖尿病的有效防治方法。 應用實例3 :MyD88抑制劑在預防和治療缺血再灌注損傷的應用實驗。 體外實驗不同移植組別受體脾臟內淋巴細胞亞群分析及ST2825治療的移植受
者體內CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例流式檢測 實驗步驟 1.取不同移植組別受體脾臟，碾磨分離淋巴細胞 2.加流式抗體APC標記的IFN-g和APC標記的IL_17， APC標記的CD25和PE標記的Foxp3 3.上流式分析不同移植組別受體脾臟內淋巴細胞亞群和ST2825治療的移植受者體內CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例 結果見附圖6A，B和C為不同移植組別受體脾臟內淋巴細胞亞群分析(同基因組，治療組，對照組)ST2825治療的移植受者體內CD4+CD25+Fo鄧3+T細胞比例明顯上調。
通過應用MyD88抑制劑ST2825后，對移植受體脾臟內淋巴細胞亞群分析和CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例的檢測發現ST2825的應用通過上調CD4+CD25+Foxp3+T細胞而改變受體小鼠的移植耐受狀態。而大量文獻表明調節性T細胞可以通過其免疫抑制作用調節炎癥的發展，炎癥因子，促炎癥因子的釋放與缺血再灌注時細胞因子的交聯，從而出現損傷，因此，ST2825的應用將減輕缺血再灌注損傷。
體內實驗部分 MyD88途徑阻斷減輕心臟缺血再灌注損傷實驗
實驗步驟 1.分組普通Balb/c組，CMC溶媒組，ST2825組(第15天做)各組6只做缺血再灌注處理夾閉阻斷冠狀動脈45分鐘后開放4小時，取心臟 2. ST2825組禾口 CMC組，術前兩周腹腔注射溶于CMC的ST2825,150mg/kg， CMC,150mg/kg 3.做TTC染色，計算各組心臟梗死面積，結果顯示如下
附RA危險區LV左心室IA缺血區
結果見附圖7: 結果顯示ST2825組心臟梗死面積明顯縮小，與對照組有統計學差異。 由以上實驗可見MyD88途徑阻斷可以明顯起到對缺血再灌注損傷的保護作用，故
MyD88抑制劑可用于防止如心梗后缺血再灌注損傷、斷肢再植后缺血再灌注損傷、移植物術
后的缺血再灌注損傷、器官保存液、細胞保存液等許多方面起到重要作用。 應用實例4 :MyD88抑制劑在治療慢性炎癥性疾病中的應用實驗。 體外實驗ST2825減弱CpG剌激DC活化引發的T細胞增殖及移植物內炎性因子
實時定量PCR分析 實驗步驟 1.取Bal b/c小鼠股骨，分離骨髓細胞，加入GMS-CSF和IL-4細胞因子，培養骨髓源性DC 2.培養至第六天，吹打細胞，分離未成熟DC。離心，1640培養基重懸。
3.加入絲裂霉素，37t:水浴，15min。 1640洗一次，計數。
4.取C57小鼠脾臟，利用小鼠淋巴細胞分離液分離脾臟淋巴細胞，并計數。
5.取C57小鼠脾臟淋巴細胞標記CFSE。 6. Bal b/c來源的DC與C57小鼠淋巴細胞做混合淋巴細胞培養。并分組如下
空白組在混合培養的過程中不加CPG及st2825
對照組在混合培養的過程中加CPG而不加st2825 實驗組1 :在混合培養的過程中同時加CPG及st2825。其中ST2825的量為10 ii M
實驗組2 :在混合培養的過程中同時加CPG及st2825。其中ST2825的量為20 y M
實驗組3 :在混合培養的過程中同時加CPG及st2825。其中ST2825的量為40 y M
7.培養至第三天，收集細胞，流式檢測C57小鼠淋巴細胞增殖情況。
流式結果見附圖8 結果顯示隨著ST2825量的增加，T細胞增殖(CD44為其表面標志)呈下降趨勢
說明ST2825可減弱CpG剌激DC活化引發的T細胞增殖 實時定量PCR步驟1.從心臟移植物用TRIzol法抽提總RNA 2.逆轉錄為cDNA，兩步法RT-PCR 3.做標準曲線對比得出IL-1 P ， TNF- a ， IL-6相對水平 附圖九為移植物內炎性因子(IL-113 ， TNF-a ， IL_6)實時定量PCR分析(第七天取心臟移植物)結果顯示第七天心臟移植物內炎癥因子水平ST2825組明顯比對照組低，有顯著統計學差異 體外實驗結果表明MyD88抑制劑ST2825通過抑制該通路能有效減少移植物內炎癥因子水平，說明其與炎癥因子的產生密切相關，故可能成為各類炎癥治療的有效手段。
體內試驗 MyD88途徑阻斷降低小鼠氣管炎癥反應
方法與步驟 1. BLM的給藥40 ii 1氯胺酮甲苯噻嗪氣道麻醉，鼻腔滴入法BLM硫酸鹽(300 y gor 15mg/kg) 2.支氣管肺泡灌洗液切開氣管，插入塑料套管，37t:，0.3mlPBS灌洗，抽吸灌洗液(回抽達95%以上)，重復10次。灌洗液分兩部分一部分用于細胞因子檢測(600g離心10min收集上清存放-S(TC用于檢測) 一部分用于細胞計數(連同下層0. 4ml重懸)4°C計數 3.肺勻漿BAL后，取整肺，攪碎，離心取上清-S(TC存放用于MPO的檢測 4.肺MPO活性鹽水經右心充分灌洗肺臟，肺勻漿，離心去上清，lmlPBS(含O. 5%
HTAB，5mM EDTA)重懸沉淀。離心，50 ii 1上清加入試管(200 ii 1PBS-HTAB-EDTA， 2mlHBSS，
100 iil 二鹽酸鄰聯茴香胺(1. 25mg/ml) ， 100 yl H2020. 05 % ) ， 15min， 37 °C漩渦水箱，
100 ii 1 NaN31 %中止反應，460nm檢測MPO吸光度值。 5.細胞計數MG-lL染色4min，95X GS-500染色8min，涂片計數 6.因子檢測KC， IL-6水平用ELISA檢測 7.統計學分析U檢驗分析統計學差異 附圖10 :顯示MYD88-/-小鼠在支氣管炎發生過程中募集中性粒和淋巴細胞減少 實驗分組B6NaCL組，B6BLM組，MyD88-/-和ST2825組(n = 4) 在MyD88-/_和ST2825組支氣管肺泡中性粒細胞和淋巴細胞的募集明顯減少。 A圖顯示第1，7，11天的細胞總數，WT小鼠和MyD88V-和ST2825組有統計學差巳
升； B圖顯示WT小鼠支氣管肺泡中性細胞24h達峰，持續7天，11天恢復，而MyD88-/_和ST2825組明顯募集減少 C.對比WT小鼠，第7到第11天MyD88-/_和ST2825組肺泡支氣管淋巴細胞明顯減少 D.對比WT小鼠，第11天MyD88-/_和ST2825組巨噬細胞無明顯增加 附圖11圖顯示]\^088-/-8111和ST2825BLM組減輕BLM誘導的肺炎癥反應，表現為
炎癥細胞及炎癥因子的減少。 A圖支氣管肺泡的中性粒細胞減少 B圖肺組織中MPO因子(第7天檢測)的減少 CD圖分別顯示24h肺組織中KC和IL_6的減少 從炎癥細胞的募集到炎癥因子的釋放兩個方面的實驗可以看出MyD88V-BLM和ST2825BLM組明顯減輕BLM引起的肺炎癥反應，從而證明ST2825的抗炎效果。
以上實驗說明MyD88途徑阻斷可降低炎癥反應。因此MyD88抑制劑可用于治療多種慢性炎癥性疾病，如慢性炎癥性腸病、哮喘等。
權利要求
一種作用于MyD88拓撲類肽化合物，作為TLR信號通路抑制劑，在制備免疫抑制劑類藥物上的應用。
2. 按權利要求l所述一種作用于MyD88拓撲類肽化合物，用于制備免疫抑制劑類藥物， 在治療減低移植后排斥反應以及移植免疫耐受誘導和維持、多種慢性炎癥性疾病、多種自 身免疫性疾病、缺血再灌注損傷類疾病上的應用。
3. 按權利要求1或2所述一種作用于MyD88拓撲類肽化合物，其特征在于所述MyD88 拓撲類肽化合物是小分子化合物ST2825，其分子結構式<formula>formula see original document page 2</formula>分子式PAM4-SP19-Beta8-NH2 麗=591. 0。
全文摘要
MyD88拓撲類肽化合物作為免疫抑制劑在醫學上的用途，本發明的目的在于篩選和利用MyD88拓撲類肽小分子化合物ST2825作為免疫抑制劑，利用其對天然免疫中MyD88分子的抑制作用達到對機體免疫抑制的作用，本發明所述的MyD88蛋白由兩個結構域組成包括TIR域和DD域，TIR域是MyD88發生自身同源二聚化的物質基礎，進而活化下游的IRAK1或IRAK4等激酶。經過對MYD88的TIR域的拓撲結構學分析后，合成的七肽修飾物經試驗證明能有效的抑制MyD88轉導的信號。在治療減低移植后排斥反應以及移植免疫耐受誘導和維持方面、多種慢性炎癥性疾病、多種自身免疫性疾病、缺血再灌注損傷類疾病上的應用實驗，充分證實了MyD88抑制劑在用于移植后抗排斥和誘導免疫耐受自身免疫性疾病對缺血再灌注損傷的保護作用。
文檔編號A61P19/00GK101745094SQ201010103669
公開日2010年6月23日 申請日期2010年1月28日 優先權日2010年1月28日
發明者周平 申請人:華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院