專利名稱：低氧間充質干細胞的培養方法、用途及組合制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及干細胞應用技術領域，尤其是一種低氧間充質干細胞的培養方法、用 途及組合制劑。
背景技術：
間充質干細胞是干細胞家族的重要成員，源于發育早期的中胚層和外胚層。間充質
干細胞是一種具有自我復制能力和多向分化潛能的成體干細胞，屬于非終末分化細胞，它既
有間質細胞，又有內皮細胞及上皮細胞的特征。間充質干細胞在體外特定的誘導條件下，可分
化為成纖維細胞、脂肪細胞、血管內皮細胞、軟骨細胞、骨細胞、肌肉細胞、神經細胞、肝細胞、
心肌細胞、胰島P細胞和內皮細胞等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向
分化潛能。間充質干細胞免疫源性低，不論是自體還是同種異源的間充質干細胞， 一般都不會
引起宿主的免疫反應。間充質干細胞有向衰退、缺血或損傷組織歸巢的特征。間充質干細胞
輸入宿主體內后，可以歸巢在特定部位，在微環境影響下有可能分化成為心肌、肝、腎、胰島、
神經、皮膚、肌肉、骨、軟骨、肌腱等組織器官的細胞，達到治療疾病的目的。 在臨床應用方面，當前國內外的臨床研究主要集中在用間質干細胞來治療診斷明
確的疾病上，尤其是難治疾病，如移植物抗宿主反應(GVHD)、牙周疾病、心肌梗死、半月板損
傷、骨或軟骨缺損、股骨頭壞死、脊髓損傷、腦癱、克隆氏病、肌萎縮側索硬化癥、系統性紅斑
狼瘡、系統性硬化癥、中風、糖尿病、糖尿病足壞疽或肝臟損傷等疾病，部份疾病已取得明顯
的療效，其余也得到了部分改善或緩解。大家公認的間充質干細胞在機體內的作用機制有
①干細胞分化為功能性細胞，代替衰退、損傷的功能性細胞；②啟動再生相關基因的順序表
達，使組織器官的內源性衰退、損傷修復啟動；③外源性干細胞進入體內，分泌多種生長營
養因子，改善組織器官內部微環境；④免疫調節作用可減輕了局部組織器官的炎性反應。 當前針對間充質干細胞用于防治機體功能性衰退的研究尚少。機體功能性衰退
(包括了亞健康、生理性衰退及疾病前期)與疾病的發生密切相關，可以說機體功能性衰退
是疾病的前期，機體可同時存在機體功能性衰退和疾病兩種情況，兩者可互為因果條件相
互促進，伴隨著機體的整個生命周期。我們在進一步的研究中發現①靜脈輸注的骨髓、外
周血動員或體外培養的間充質干細胞，只有極少數間充質干細胞能植入受者體內，多數細
胞滯留于微血管處而死亡。②間充質干細胞有貼壁生長的特性，間充質干細胞在靜脈輸注
中會出現粘附、聚集成團，出現細胞團栓塞的可能。③胎盤、臍帶來源的間充質干細胞取材
方便、無道德倫理問題的限制，細胞的分化潛力、活力、增殖能力和細胞內的活性營養因子
種類及含量，都強于來源于成體的間充質干細胞。目前還尚未發現有人將源于胎盤、臍帶的
間充質干細胞用于抗衰老目的。

發明內容
本發明的任務是要克服現有技術的缺陷，提供一種在人體內的活力及植入成活率高，具有防治機體功能性衰退，不會滯留于微血管處而死亡，在靜脈輸注中不會出現粘附、 聚集成團從而導致細胞團栓塞，細胞的分化潛力、活力、增殖能力和細胞內的活性營養因子 種類及含量都強于來源于成體的低氧間充質干細胞的培養方法、用途及組合制劑。
本發明的技術方案是
一種低氧間充質干細胞的培養方法，其特征是在3_10%氧濃度的低氧條件下，按如下 步驟培養a、無菌操作將臍帶或胎盤切成組織塊，用Hank' s液沖洗后去除殘留血液并分離 血管；b、將處理后的組織塊用胰蛋白酶消化，觀察細胞大部分分散時，終止消化；c、對消化 后的物質過濾；d、將所得濾液低速離心；e、在離心后的濾液中加入細胞培養液制成細胞混 懸液；f、將細胞混懸液按(1 :2 4)的比例歷時約14-15天，進行4-5代傳代，得成品低氧 間充質干細胞。 進一步的該優化措施是
在所述步驟f后還設有檢驗程序g、對步驟f所得產物進行病源生物檢測，排除病源學 污染；h、進行表型檢測，符合CD31、 HLA-DR、 CD34和CD45陰性，CD44、 CD73、 CD90和CD105 陽性的細胞為合格細胞；i、將合格細胞加入凍存液后置于-205t: -185t:液氮中保存，并 記錄臍帶或胎盤的來源信息、細胞代數、細胞數量以及制備日期。
在于在所述步驟a中，將所述組織塊切成0. 5mm3 1. 5mm3的小塊。
在所述步驟d后設有步驟d':用Hank's液對間充質干細胞混懸液離心清洗至少1 次。 低氧間充質干細胞的用途，其特征是所述低氧間充質干細胞在防治人或動物機 體功能性衰退方面的應用。 用所述方法制得的低氧間充質干細胞配制的組合制劑，由使用時提前輸注的復合 氨基酸注入液、所述低氧間充質干細胞及與該間充質干細胞一同在后輸注的含肝素的生理 鹽水組配而成。 所述復合氨基酸注入液由18種氨基酸組成，包括L-異亮氨酸、L-精氨酸、L-亮氨 酸丄-天門冬氨酸、醋酸L-賴氨酸丄-半胱氨酸丄-谷氨酸丄-蛋氨酸丄-組氨酸丄-苯丙 氨酸丄-脯氨酸丄-蘇氨酸丄-絲氨酸丄-色氨酸丄-酪氨酸丄-纈氨酸、甘氨酸和L-丙氨 酸，每100ml復合氨基酸注入液中含10g左右氨基酸。 每組組合制劑中含低氧間充質干細胞的細胞數106_108個，每組組合制劑中所述
生理鹽水含肝素10-20IU/ml，每組組合制劑中含所述復合氨基酸25 50g。 經理論及實踐表明，用本發明培養方法所培養的低氧間充質干細胞所配制的組合
制劑，在人體內的活力及植入成活率高，不僅不會滯留于微血管處而死亡，在靜脈輸注中不
會出現粘附、聚集成團從而導致細胞團栓塞，反而細胞的分化潛力、活力、增殖能力和細胞
內的活性營養因子種類及含量都強于來源于成體的間充質干細胞，具有明顯的防治機體功
能性衰退的作用。 以下通過實施例對本發明作進一步說明。

具體實施例方式
低氧間充質干細胞的培養方法，在3_10%，優選5%氧濃度的低氧條件下，按如下步 驟培養a、無菌操作，將臍帶或胎盤切成0. 5mm3 1. 5mm3的小組織塊(優選lmm3小組織塊)，用Hank's液沖洗后去除組織塊上殘留的血液并分離血管；b、將處理后的組織塊用胰蛋白酶 消化，觀察到細胞大部分分散時終止消化；c、對消化后的物質過濾；d、將所得濾液低速離 心；d'、用Hank's液對間充質干細胞混懸液離心清洗5次；e、在離心后的濾液中加入細胞培 養液，制成細胞混懸液。該細胞培養液可以是采用美國StemCell公司的間充質干細胞專用 培養基MesencultTM作成的培養試劑，還可以是在美國GIBC0公司的DMEM、 F12、 DMEM/F12、 RPMI1640基礎培養基的基礎上添加血清、胰島素和/或細胞因子而得到的完全培養基；f、 將細胞混懸液按1 :2 4 (優選1 :3)的比例歷時約14-15天，進行4-5代傳代；g、檢驗對 步驟f所得產物進行病源生物檢測，排除病源學污染；h、進行表型檢測，符合CD31、HLA-DR、 CD34和CD45陰性，CD44、 CD73、 CD90和CD105陽性的細胞為合格細胞；i、將合格細胞加入 凍存液后置于_205°C _185°C (優選_196°C )液氮中保存，并記錄臍帶或胎盤的來源信息、 細胞代數、細胞數量以及制備日期，即得成品低氧間充質干細胞。 本發明低氧間充質干細胞可配制成組合制劑，用來防治人或動物的機體功能性衰 退。該組合制劑由使用時提前輸注的復合氨基酸注入液、低氧間充質干細胞及與該低氧間 充質干細胞一 同在后輸注的含肝素的生理鹽水組配而成。 所述復合氨基酸注入液由18種氨基酸組成，包括L-異亮氨酸丄-精氨酸丄-亮氨 酸丄-天門冬氨酸、醋酸L-賴氨酸丄-半胱氨酸丄-谷氨酸丄-蛋氨酸丄-組氨酸丄-苯丙 氨酸丄-脯氨酸丄-蘇氨酸丄-絲氨酸丄-色氨酸丄-酪氨酸丄-纈氨酸、甘氨酸和L-丙氨 酸，每100ml復合氨基酸注入液中含10g左右氨基酸。 當然，復合氨基酸注入液也可由不足18種氨基酸組成，只是使用效果不如18種氨 基酸的理想。 每組組合制劑中含低氧間充質干細胞的細胞數106-108 (優選107)個，每組組合制 劑中所述生理鹽水含肝素10-20IU/ml(優選10IU/ml)，每組組合制劑中含復合氨基酸25 50g，優選40g。 在臨床驗證中，我們按下列驗證條件選擇實驗對象 1、符合下列條件者
① 內分泌及性功能衰退人群男性、女性性功能下降、減退，女性月經失調、內分泌紊 亂，卵巢早衰、更年期提前，睡眠、情緒欠佳等；
② 機體未老先衰人群機體衰老，缺乏活力，易疲倦，組織器官功能老化等；
③ 心血管系統功能退變人群動脈硬化、老化，冠狀動脈硬化、狹窄，血壓增高等；
④ 內臟器官功能退化人群心、肝、肺、腎、胃腸等器官功能衰退或下降；
⑤ 骨骼運動系統退變人群骨質疏松，骨關節增生疼痛，骨關節退變，關節炎，肌肉、韌 帶、肌腱功能退化，運動及活動能力下降等；
⑥ 免疫系統衰退人群免疫力弱，易感冒或患感染性疾病等；
⑦ 血液系統功能衰退人群血脂高，血粘稠度高，血液流變學改變等；
⑧ 高壓力、工作緊張、亞健康人群；
⑨ 預防衰老，要求維持機體年輕化、面部美容年輕化的人群。
2、排除下列情況
① 高度過敏體質或者有嚴重過敏史者；
② 休克或全身衰竭生命體征不穩定者；③ 惡性腫瘤者；
④ 全身感染或局部嚴重感染需抗感染治療者；
⑤ 合并心、肺、肝、腎等重要臟器的功能障礙，身體情況不穩定者；
⑥ 凝血功能障礙者如血友病；
⑦ 血清學檢查陽性者如艾滋病、梅毒等(乙肝除外)；
⑧ 染色體或基因缺陷，免疫功能缺陷；
⑨ 診斷上尚未明確者；
⑩ 極個別的期望值過高，或者不切合實際的要求者。
3、驗證前作一下體檢項目
① 必需項目乙肝兩對半、丙肝病毒抗體測定(HCV-IgG)、轉氨酶、艾滋病病毒抗體(HIV-Ab)、梅毒血清實驗測定；
② 建議項目血壓、血脂、血糖、肝功生化、腎功、超敏C反應蛋白、心肌酶譜、C3、C4、IgA、 IgM、 IgG、性激素、風濕4項、血漿骨鈣素等，及B超、心電圖和體內脂肪測定等。
4、實施驗證
(1)、觀察療效人數確定56人，女性32人，男性24人，年齡29-78歲之間。所有人符合上述治療條件，體檢項目的必需項目及建議項目中的常規項目在治療前一月內完成。
(2)、治療細胞數及次數確定同樣在低氧條件下培養的間充質干細胞，3-5代為主，細胞數在107左右；治療次數依據個人身體情況及體檢結果， 一般在3-4次，必要時可在5次以上。 (3)、間充質干細胞解凍干細胞從-196°〇液氮中取出，置入42t:水浴箱進行解凍。 (4)、復合氨基酸的提前輸注建立靜脈通道，依據受治療者實際情況選250ml復合
氨基酸，少數選500ml，采取緩慢靜脈滴注的方式。注射速度每小時輸注氨基酸相當10g左
右(本品100ml)， 1分鐘約25滴緩慢滴注。老人及身體情況較差都更需緩慢滴注。 (5)、間充質干細胞輸注用9號以上注射器針頭抽取間充質干細胞濃縮液，配合
0. 9%生理鹽水(內含10IU/ml低分子肝素鈉)20ml進行緩慢靜脈推注或滴注。 (6)、觀察與處理治療過程中觀察受治療者的情況，有無過敏反應或特殊反應。56
人中出現過2人次輕度過敏反應，密切觀察未做特殊處理自愈。必要時可靜脈推注2mg地
塞米松進行處理。未見其它不良反應。 5、臨床實驗效果
A、觀察周期療程開始后的一年時間。
B、可能出現的效果
①外在變化剛開始皮膚變光滑、潤澤，膚色變白；1月左右細小皺紋減輕、變淺，面部色斑變淡；3月后，頭發出現增多、白轉黑現象，全松弛的皮膚開始變得緊致以及肌肉變得緊實，女性乳房、臀部變得緊致富有彈性。
②免疫力增強，原來易感冒的人不易再感冒。
③睡眠改善，不容易疲倦，精力充沛，心情舒暢，記憶力好轉。
④肌肉變得有力，腰膝酸軟疼痛癥狀減輕。
⑤食欲好轉，腹脹、便秘現象減輕甚至消失，腸炎癥狀好轉。 ⑥男性功能改善，前列腺肥大增生減輕好轉；女性卵巢早衰患者月經的恢復，更年期癥狀的改善，女性乳房及臀部變得緊致有彈性，乳暈由黑轉紅現象。 ⑦代謝率提高，減肥不再困難，體態發生變化，肥胖的人身材變的苗條，脂肪重新分布，機體年輕態的恢復。 ⑧全面提高人體機能，改善人體退變現狀，使機體保持青春活力和年輕狀態。
⑨體檢指標如血壓、血脂、血糖、肝功生化、腎功、超敏C反應蛋白、心肌酶譜、C3 、C4、 IgA、 IgM、 IgG、性激素、風濕4項、血漿骨鈣素等，及B超、心電圖和體內脂肪測定等有明顯改善或提高。 ⑩對于長期使用降糖藥的糖尿病人，用本發明藥物治療后降糖藥的用量會明顯減少。 C、療效及療養評估標準，分為無效、有效、明顯有效三個標準
① 無效治療前后主客觀癥狀無一項明顯變化；
② 有效主觀癥狀改善2項或/和客觀指標改善1項；
③ 明顯有效主觀癥狀改善2項以上或/和客觀指標改善1項以上。
56人實驗中含無效0例，有效18例，明顯有效38例。
權利要求
一種低氧間充質干細胞的培養方法，其特征是在3-10% 氧濃度的低氧條件下，按如下步驟培養a、無菌操作將臍帶或胎盤切成組織塊，用Hank，s液沖洗后去除殘留血液并分離血管；b、將處理后的組織塊用胰蛋白酶消化，觀察細胞大部分分散時，終止消化；c、對消化后的物質過濾；d、將所得濾液低速離心；e、在離心后的濾液中加入細胞培養液制成細胞混懸液；f、將細胞混懸液按1(2～4)的比例歷時約14-15天，進行4-5代傳代，得成品低氧間充質干細胞。
2. 依照權利要求1所述的低氧間充質干細胞的培養方法，其特征是在所述步驟f后 還設有檢驗程序g、對步驟f所得產物進行病源生物檢測，排除病源學污染；h、進行表型檢 測，符合CD31、HLA-DR、CD34和CD45陰性，CD44、 CD73、 CD90和CD105陽性的細胞為合格細 胞；i、將合格細胞加入凍存液后置于_205°C _1851:液氮中保存，并記錄臍帶或胎盤的來 源信息、細胞代數、細胞數量以及制備日期。
3. 依照權利要求1所述的低氧間充質干細胞的培養方法，其特征在于所述細胞培養液 采用美國StemCell公司的間充質干細胞專用培養基Mesencult 作為培養試劑。
4. 依照權利要求1所述的低氧間充質干細胞的培養方法，其特征是所述細胞培養液 是在美國GIBC0公司的DMEM、 F12、 DMEM/F12、 RPMI1640基礎培養基的基礎上添加血清、胰 島素和/或細胞因子而得到的完全培養基。
5. 依照權利要求l-4所述的任一種低氧間充質干細胞的培養方法，其特征在于在所述 步驟a中，將所述組織塊切成0. 5mm3 1. 5mm3的小塊。
6. 依照權利要求l-4所述的任一種低氧間充質干細胞的培養方法，其特征是在所述 步驟d后設有步驟d':用Hank's液對間充質干細胞混懸液離心清洗至少1次。
7. 權利要求1-6所述任一種低氧間充質干細胞的用途，其特征是所述低氧間充質干 細胞在防治人或動物機體功能性衰退方面的應用。
8. 用權利要求1-6所述的任一種方法制得的低氧間充質干細胞配制的組合制劑，由使 用時提前輸注的復合氨基酸注入液、所述低氧間充質干細胞及與該間充質干細胞一同在后 輸注的含肝素的生理鹽水組配而成。
9. 依照權利要求8所述的組合制劑，其特征是所述復合氨基酸注入液由18種氨基酸 組成，包括L-異亮氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-天門冬氨酸、醋酸L-賴氨酸、L-半胱氨 酸、L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-色 氨酸丄-酪氨酸丄-纈氨酸、甘氨酸和L-丙氨酸，每100ml復合氨基酸注入液中含10g左右 氨基酸。
10. 依照權利要求8或9所述組合制劑，其特征是每組組合制劑中含低氧間充質干細 胞的細胞數106-108個，每組組合制劑中所述生理鹽水含肝素10-20IU/ml，每組組合制劑中 含所述復合氨基酸25 50g。
全文摘要
本發明公開了一種低氧間充質干細胞的培養方法、用途及組合制劑。采用低氧條件下培養的臍帶或胎盤間充質干細胞，結合復合氨基酸注射液提前輸注等手段，提高了間充質干細胞在體內的活力、植入成活率及治療效果；為了避免間充質干細胞在血管中出現粘附、聚集成團，出現細胞團栓塞的可能，治療時配合含肝素的生理鹽水，通過靜脈注射或靜脈滴注的方式進行。通過3次以上的治療，受治療者身體狀況明顯好轉，免疫、血脂、血糖等客觀指標顯著改善。
文檔編號A61K31/198GK101792737SQ20101013053
公開日2010年8月4日 申請日期2010年3月24日 優先權日2010年3月24日
發明者晏澤 申請人:晏澤