專利名稱：抑制beta分泌酶酶切作用的多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多肽及其在制備治療阿爾茨海默病藥物 中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
阿茲海默病Alzheimer’ s Disease，以下簡稱AD，俗稱老年性癡呆，是由無毒性的 β-淀粉樣蛋白單體分子(β-AmyloicKA β 40/42以下簡稱Αβ))聚集形成具毒性作用的 寡聚體引起的老年人主要以記憶力下降和腦部形成老年斑為特征的神經(jīng)退行性疾病。醫(yī)學(xué) 統(tǒng)計表明，我國和歐美國家中60歲以上老年人有5 6%患有阿茲海默病。該病已被列為 導(dǎo)致死亡的第四大疾病，僅次于心臟病、癌癥和中風(fēng)。我國現(xiàn)有60歲以上人口約一億，按照 60歲以上人口中老年性癡呆患病率為5%估算，全國可能有老年性癡呆患者約500萬。該 病已給家庭和社會帶來巨大的負(fù)擔(dān)。研究人員估計，如果防治措施得不到改善，原處于死亡 病因第4位的老年性癡呆癥將成為21世紀(jì)老年人健康的頭號殺手，將會有三分之一的65 歲以上老人患老年性癡呆癥。目前，對AD的臨床治療只是應(yīng)用一些神經(jīng)營養(yǎng)和消炎類藥物 進(jìn)行對癥治療，尚沒有任何特異性治療AD的藥物面世。基于Αβ的致病機(jī)理，目前對AD治療制劑的研究主要從三個方面入手通過抑制 酶促反應(yīng)降低Αβ產(chǎn)生、抑制Αβ的凝聚和加快Αβ的清除。Αβ主要由39-42個氨基酸 殘基組成，其中A β 42聚集較快、細(xì)胞毒性較大，為主要的AD致病因素。它來自于分子量為 110-135KD 的前體蛋白(Amyloid Precursor Protein，APP)。APP 經(jīng) β 分泌酶的作用產(chǎn)生 Αβ的氨基端，經(jīng)胞膜內(nèi)Y分泌酶作用產(chǎn)生Αβ的羧基端。在正常情況下，在β分泌酶作 用之前，α分泌酶在Αβ中間的1^816-1^1117處將4 裂解為4 8(1和嵌在膜上較短的 羧基片段C83(如圖1所示)。APPsa具有生長調(diào)節(jié)和神經(jīng)營養(yǎng)的作用，能延長神經(jīng)元的存 活，穩(wěn)定和加強(qiáng)突觸的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)神經(jīng)元的功能等。在機(jī)體異常的情況下，β、Y分泌酶活 性增強(qiáng)，或α分泌酶活性降低，將會產(chǎn)生較多量的Αβ，而引起AD的發(fā)生。于是，降低β或 Y分泌酶酶切作用或增強(qiáng)α分泌酶酶切作用的研究成為近十余年來AD研究領(lǐng)域的熱點之 一。目前，人們對這三類酶的分子生物學(xué)特性、作用機(jī)理和組成成分等的認(rèn)識研究有了較大 突破。Y分泌酶是由多個組分組成的多酶復(fù)合體，除能裂解APP產(chǎn)生Αβ外，還參與產(chǎn)生 其他30余種具有重要生理功能的I型膜蛋白的產(chǎn)生。因此，單純抑制這類酶的活性來減少 Αβ的產(chǎn)生必將會影響其它許多相關(guān)蛋白的正常功能。同樣地，抑制β分泌酶的抑制劑的 有效性和副作用問題也一直沒有得到解決。人們至今尚未找到可應(yīng)用于臨床的抑制β或 Y分泌酶酶切作用的有效藥物。研究表明，β分泌酶酶切位點氨基酸保守性很強(qiáng)。2005年Arbel等人以APP肽鏈 中β分泌酶酶切位點作為靶點，制備出抗該酶切位點的特異性抗體。該抗體可以與APP有 效結(jié)合，阻止β分泌酶的酶切作用，從而降低細(xì)胞A β的產(chǎn)生。這表明某些物質(zhì)與APP肽 鏈中β分泌酶酶切位點的結(jié)合，可以阻遏β分泌酶的酶促作用，這將成為降低Αβ產(chǎn)生的 有效途徑之一。然而，抗體分子較大，不易通過血腦屏障，并且抗體本身具有較好的抗原性，易引起變態(tài)反應(yīng)等副作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對抗APP上β分泌酶酶切位點的特異性抗體分子較大，不易 通過血腦屏障，且抗體具有抗原性，易引起變態(tài)反應(yīng)的缺陷，提供一種多肽，其氨基酸序列 為His-Asp-Pro-Ala-Pro-Rrg-Thr，或由上述的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、或添加一個或 幾個氨基酸，且具有抑制β分泌酶酶切作用、抑制Αβ聚集以及抑制Αβ細(xì)胞毒性作用的 多肽。在本發(fā)明的具體實施例中，將本發(fā)明所述多肽的N端乙酰化、缺失丙 氨酸(序列為=His-Asp-Pr0-Pr0-Rrg-Thr)、丙氨酸置換成甘氨酸(序列為 His-Asp-Pro-Gly-Pro-Rrg-Thr)或插入組氨酸且在C末端連接亮氨酸(序列為His-Asp-Pro-Ala-His-Pro-Rrg-Thr-Leu)，檢測其與APP的β分泌酶酶切位點及A β 42的特異性結(jié) 合，結(jié)果顯示，本發(fā)明所述多肽經(jīng)過置換、缺失或插入氨基酸后仍保留與APP上的β分泌酶 酶切位點和Αβ 42同時結(jié)合的能力。體外試驗表明，本發(fā)明所述多肽可特異性結(jié)合APP上β分泌酶酶切位點，其氨 基酸序列為Glu-val-Lys-Met-Asp-Gla-Glu-Phe，抑制β分泌酶酶切作用，可明顯抑制 Αβ 40禾Π Αβ 42的產(chǎn)生，并且可通過結(jié)合Αβ的N端多肽片段(結(jié)合的N端多肽序列為 Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser)來抑制A β 42的聚集，保護(hù)SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì) 胞免受Αβ42毒性的影響。將該多肽注射到AD轉(zhuǎn)基因小鼠(APP和PSl雙轉(zhuǎn)基因)的腦側(cè) 室進(jìn)行動物記憶實驗，結(jié)果表明，本發(fā)明所述多肽可以明顯改善小鼠的空間記憶能力，減少 腦內(nèi)老年斑的數(shù)量及Aβ 40和Αβ42的產(chǎn)量。本發(fā)明還提供所述任一項多肽作為β分泌酶抑制劑的應(yīng)用。本發(fā)明還提供所述任一項多肽作為A β聚集抑制劑的應(yīng)用。本發(fā)明還提供所述任一項多肽在制備治療阿爾茨海默病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述多肽分子量小，易穿過血腦屏障，并且相比其它大蛋白分子如抗體等 抗原性較差，副作用較小，在阿爾茨海默病的預(yù)防和治療方面具有廣泛的應(yīng)用前景。


圖1. Pbssl與APP上的β分泌酶酶切位點及A β結(jié)合的ELISA測定；圖2.經(jīng)置換、缺失或插入氨基酸了的Pbssl與APP上的β分泌酶酶切位點及A β 結(jié)合的ELISA測定；Pbssl-ΔΑ 為缺失丙氨酸的多肽(序列為His-Asp-Pro-Pro-Rrg_Thr)；Pbssl-Ac為N端乙酰化的多肽；Pbssl-A4G為丙氨酸置換成甘氨酸的多肽(序列為 His-Asp-Pro-Gly-Pro-Rrg-Thr)；
Pbssl-HL為插入組氨酸且在C端連接亮氨酸的多肽(序列為=His-Asp-Pr0-Ala-Hi s-Pro-Rrg-Thr-Leu)；圖3. ThT熒光測定Pbssl抑制A β 42的聚集；圖4. Pbssl抑制A β 42聚集的顯微鏡觀察；
圖5. Pbssl抑制A β 42的細(xì)胞毒性；圖6. Pbssl抑制A β 40的細(xì)胞外產(chǎn)生；圖7. Pbssl抑制A β 42的細(xì)胞外產(chǎn)生； 圖8.注射Pbssl多肽的AD轉(zhuǎn)基因小鼠的水迷宮實驗；圖9.注射Pbssl多肽的AD轉(zhuǎn)基因小鼠在目標(biāo)象限的時間；圖10.注射Pbssl多肽的AD轉(zhuǎn)基因小鼠穿臺次數(shù)；圖11.注射Pbssl多肽的AD小鼠腦組織內(nèi)老年斑定量測定。
具體實施例方式本發(fā)明公開了一種可特異性結(jié)合APP上β分泌酶酶切位點的多肽及其應(yīng)用，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替 換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn) 品及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和 范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。根據(jù)阿茲海默病AD的發(fā)病原理，治療AD的根本方法應(yīng)是減少β淀粉樣蛋白 (Αβ)的產(chǎn)生、抑制Αβ的聚集或加快Αβ的清除。本發(fā)明的發(fā)明人應(yīng)用噬菌體顯示技術(shù)， 以含有APP上β分泌酶酶切位點和Αβ部分氨基端序列為一篩選底物，將IX IO8種七肽 進(jìn)行了四輪淘選，應(yīng)用噬菌體ELISA從中篩選出了一條可同時與APP上的β分泌酶酶切位 點禾ΠΑβ42 明顯結(jié)合的多肽 Pbssl。Pbssl 的序列為His-Asp-Pro-Ala-Pro-Rrg_Thr。研究顯示，Pbssl在體外可以明顯降低Αβ產(chǎn)生，且可以抑制Αβ的聚集及細(xì)胞毒 性。應(yīng)用AD轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行的體內(nèi)實驗結(jié)果表明，Pbssl可以明顯改善小鼠的空間記憶能 力，減少腦內(nèi)老年斑的數(shù)量及Αβ40和Αβ42的產(chǎn)生。Αβ分子量很小，易穿過血腦屏障發(fā) 揮療效，并且抗原性較差，副作用較小，是一條極具AD治療潛力的多肽。本發(fā)明所述多肽Pbssl為一七肽，可由按常規(guī)方法合成制備。我們用以實驗的 Pbssl多肽純度為大于或等于95%。Pbssl保存于_20°C，避免反復(fù)凍融。本發(fā)明所有的實驗數(shù)據(jù)都是通過至少3次獨立的實驗獲得的，實驗數(shù)據(jù)表示為平 均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析是應(yīng)用One-wayANOVA軟件進(jìn)行，多組比較分析則應(yīng)用 Duncan‘ s test0以下結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明實施例1. Pbssl與APP上的β分泌酶酶切位點及A β 42的特異性結(jié)合分別將PBS緩沖液配制的APP上的β分泌酶酶切位點多肽(上海吉爾多肽公司)、 A β 42 (American Peptide Co.)及陰性對照多肽以1 μ g/孔包被96孔高親和力酶標(biāo)板，4°C 過夜。以BSA封閉酶標(biāo)板上未與多肽結(jié)合的空白位點，然后加入連接有6個組氨酸作為標(biāo) 簽的Pbssll μ g/孔，室溫作用2h。洗滌后，加入能與組氨酸標(biāo)簽結(jié)合的偶聯(lián)HRP的抗體， 室溫作用lh。洗滌后，加入底物TMB，顯色15分鐘后，以多功能酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光 度。在相同的條件下重復(fù)三次，結(jié)果見圖1，圖中數(shù)據(jù)為三次的平均值，error bar為 SD,與陰性對照相比，*，P < 0. 01，表明Pbssl可與APP上的β分泌酶酶切位點和A β 42 同時結(jié)合。
實施例2. Pbssl的氨基酸經(jīng)置換、缺失或插入仍與APP的β分泌酶酶切位點及 A β 42的特異性結(jié)合將本發(fā)明所述多肽Pbssl的N端乙酰化、缺失丙氨酸(序 列為His-Asp-Pro-Pro-Rrg-Thr)、丙氨酸置換成甘氨酸(序列為 His-Asp-Pro-Gly-Pro-Rrg-Thr)或插入組氨酸且在末端連接亮氨酸(序列為=His-Asp-Pr o-Ala-His-Pro-Rrg-Thr-Leu)，然后按照實施例1所述試驗方法檢測與APP的β分泌酶酶 切位點及A β 42的特異性結(jié)合，用ELISA方法測定OD值，結(jié)果見圖2。表明Pbssl經(jīng)過某些 修飾、某個氨基酸經(jīng)置換、缺失或在多肽中增加氨基酸后仍保留與APP上的β分泌酶酶切 位點和A β 42同時結(jié)合的能力(與陰性對照相比，P < 0. 01)。實施例3. Pbssl體外抑制A β 42的聚集1)將國外購買的 Αβ 42 (American Peptide Conpany, USA)六氟異丙醇(HFIP) 溶解至lmg/ml 室溫超聲波處理lOmin，分裝到印idorf管中，于真空中揮發(fā)HFIP，然后 于-20°C保存。用前將HFIP處理過的Αβ 42在室溫放置20min，然后加入二甲基亞砜 (DMSO)，使A β 42的濃度為lmg/ml，然后以0. 02M pH 7. 4的PBS緩沖液進(jìn)行稀釋至所需濃度。2)將Pbssl溶解于0.02M pH 7. 4的PBS緩沖液中，然后加入到Αβ 42溶液，使 Aβ 42終濃度為10 μ M和Pbssl的終濃度為10 μ M和100 μ Μ。并以不加Pbssl的Αβ42溶 液做為對照。將所有樣品于37°C放置24小時。3)將硫黃素(ThT)溶解在pH 6. 5、50mM的磷酸鹽緩沖液使其濃度為5 μ Μ。取放 置37°C 24小時后的樣品20 μ 1加入到含有180 μ 1 ThT溶液的黑色酶標(biāo)板中。混勻后在 多功能酶標(biāo)儀上以450nm激發(fā)波長和482nm的發(fā)射波長測定ThT的熒光強(qiáng)度。該實驗重復(fù) 三次，將各樣品的熒光強(qiáng)度減去ThT本身的背景熒光，并分析樣品之間的差異顯著情況，結(jié) 果見圖3。與單獨的Αβ 42樣品相比，*，Ρ<0. 05;**，Ρ< 0. 01，結(jié)果顯示加入Pbssl 后的Aβ 42熒光強(qiáng)度顯著低于單獨Aβ 42的樣品。由于ThT與Αβ 42聚集后的聚集物中的 β -片層結(jié)合后才可激發(fā)出熒光，熒光越強(qiáng)，表明A β 42聚集越多。將放置37°C 24小時后的樣品應(yīng)用透射顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察。樣品各10 μ 1滴加 到200目的銅網(wǎng)格中，20min后用濾紙吸干樣品，再各取10 μ 1 2. 5%的戊二醛滴在網(wǎng)孔中 作用5min，用濾紙吸干戊二醛后，再用雙氧鈾染料10 μ 1滴在銅網(wǎng)上作用30s，吸干后，晾 干。在透射電鏡下觀察樣品，電壓80kV，放大倍數(shù)為40K。單獨孵育的Aβ 42可聚集成許多 長纖維，如圖4Α所示，而加入100 μ M Pbssl的Αβ 42不能夠聚集成纖維狀體，只形成了一 些寡聚體，如圖4Β所示，標(biāo)尺為1微米。實施例4. Pbssl體外抑制A β 42的細(xì)胞毒性用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基(MEM，Invotrigen)將SH-SY5Y細(xì)胞配成單個細(xì)胞懸 液，以每孔10000個細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔體積100 μ L0細(xì)胞于37°C培養(yǎng)24 小時，培養(yǎng)箱C02濃度為5%。每孔加入樣品后(Αβ 42與Pbssl的混合物，AB 42alone及 PBS對照)，A β 42蛋白的終濃度是1 μ Μ, Pbssl的終濃度是4 μ M和10 μ Μ。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 48小時后，每孔加MTT溶液(5mg/mL) 10 μ L，37°C孵育3小時，終止培養(yǎng)，每孔加100 μ L晶 體溶解液(10% SDS和5%異丁醇溶解在0. OlM HCL中)，37°C孵育過夜，使結(jié)晶物充分溶 解。在多功能酶聯(lián)免疫檢測儀上以570nm波長測定各孔光吸收值。減去本底后，以樣品的吸光度除以不加樣品的細(xì)胞的吸光度作為細(xì)胞的活性指標(biāo)，并分析樣品之間的差異顯著情況，與單獨的Αβ42樣品相比，*，P < 0.05 *，P < 0.01，結(jié)果如圖5所示。實施例5. Pbssl體外抑制A β 42的產(chǎn)生應(yīng)用A β 42禾口 A β 42試劑盒(Invotrigen，USA)測定細(xì)胞培養(yǎng)液中A β 40禾口 A β 42 的量，按照廠家說明書進(jìn)行實驗測試。簡述如下1)將轉(zhuǎn)染APP基因的人胚腎細(xì)胞(7ΡΑ2， 由美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院饋贈)在6孔板上培養(yǎng)至豐度為90%時，更換無血清培養(yǎng)基，加入 PBS和終濃度為3μΜ、100μΜ的Pbssl，繼續(xù)培養(yǎng)15小時。2)收集培養(yǎng)液，離心除細(xì)胞碎片。3)應(yīng)用200 μ 1 2%脫脂奶粉封閉ELISA微孔板，置37°C 2小時。4)加入100 μ 1(1 μ g/ml)各細(xì)胞培養(yǎng)液，置37°C 1小時。5)甩去樣品溶液，以含0. 05%的TWeen-20PBS洗滌微孔板3次。6)加入100μ1(1 2000稀釋)特異結(jié)合Αβ 42的鼠源單抗，置37°C 1小時。7)洗滌同步驟5)。8)加入100μ1(1 1000稀釋)HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，置37°C 1小時。9)洗滌同步驟5)。10)加入100 μ 1 TMB顯色，以IN的硫酸終止顯色反應(yīng)。11)應(yīng)用酶標(biāo)檢測儀測定450nm處的光吸收值。結(jié)果顯示，加入Pbssl多肽后細(xì)胞培養(yǎng)液中，Αβ40(見圖6)和Αβ42(見圖7)的 水平都明顯降低，與加入PBS對照相比，*，P < 0.01。實施例6. Pbssl改善AD轉(zhuǎn)基因小鼠的記憶能力實驗方法1)腦側(cè)室注射將12月齡大的轉(zhuǎn)APP和PSl基因的小鼠隨機(jī)分為注射多肽Pbssl 和PBS組，每組7只。同時以7只年齡相似的野生型小鼠(為非AD型)做為對照。腦內(nèi)注 射前12h對小鼠禁食不禁水。首先將小鼠麻醉，麻醉劑量為25g小鼠腹腔注射0. ImL濃度 為10%的水合氯醛。將小鼠固定在立體定位儀上，參照標(biāo)準(zhǔn)圖譜(AcademicPublish)進(jìn)行 腦立體定位側(cè)室注射給藥。小鼠右側(cè)腦室注射定位參數(shù)為前囪后0. 8mm，中線旁開0. 8mm, 硬膜下2. 5mm。用無菌水溶解Pbssl至lmg/ml，注射劑量為5 μ L。每只動物注射時間為 5min,留針lOmin。注射14天后，對小鼠進(jìn)行水迷宮記憶能力檢測。2)記憶力訓(xùn)練小鼠水迷宮訓(xùn)練之前放在室溫25°C，濕度46%的環(huán)境適應(yīng)3天。 所有行為學(xué)檢測試驗中均采用隨機(jī)雙盲的方式。訓(xùn)練前，除去平臺，在水槽中央輕輕放入， 讓其自由游動60s。測定每組小鼠游泳象限偏好，以選擇將對面水槽的壁，作為該小鼠初始 釋放位置。第一次訓(xùn)練前讓小鼠站在平臺(平臺直徑10厘米)上15s，讓它記憶一下池(直 徑1.1米)中臺的空間位置。平臺放在第二象限中部，并且平臺的上表面距水面1.5厘米。 池水中加入奶粉，以增加動物的視覺反差，利于圖像記錄。每天按指定投放點，訓(xùn)練小鼠4 次。將小鼠面朝池壁，輕輕放入水中，讓其在水槽中游泳60s。小鼠在臺上站立2s就停止計 時，認(rèn)為上臺，訓(xùn)練時間每次最長為60s。期間應(yīng)用軟件(購自中國醫(yī)科院藥物所)記錄其 軌跡以及從入水到爬上平臺的時間，即潛伏期。如果小鼠在60s內(nèi)找到平臺則讓其在平臺 上停留20s。如果小鼠在60s內(nèi)找不到平臺，則在60s后由實驗人員弓丨導(dǎo)其上平臺，并讓其 在平臺上停留20s。
3)記憶力測試小鼠水迷宮訓(xùn)練8天，8天訓(xùn)練完后，撤掉水下平臺。24h后，測定 記憶保持力。將小鼠放入池中游泳60s，以錄像和軟件系統(tǒng)記錄實驗結(jié)果。一天內(nèi)進(jìn)行3次 測定后，軟件統(tǒng)計每組小鼠穿臺次數(shù)、首次穿臺所需時間及在各相限內(nèi)的時間。隨著訓(xùn)練時間的增長，野生組小鼠找到臺的潛伏期逐漸縮短，6天后即達(dá)平衡狀 態(tài)。注射Pbssl的小鼠找到臺的潛伏期在訓(xùn)練到第6天時和8天時，與注射PBS的陰性對 照相比具有顯著差異(與注射PBS組相比，*，P < 0. 05 ； * *，P < 0. 01)，結(jié)果見圖8，表 明注射Pbssl后的小鼠的空間記憶能力明顯好于注射PBS的對照組。 撤臺測試實驗結(jié)果表明，注射Pbssl的小鼠在目標(biāo)象限(即有平臺的象限)的時 間明顯高于注射PBS對照組，與注射PBS組相比，*，P < 0. 05，結(jié)果見圖9。并且注射Pbs si的小鼠穿臺次數(shù)也明顯高于注射PBS的對照組，與注射PBS組相比，*，P < 0. 05，結(jié)果 見圖10。實施例7. Pbssl降低AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)老年斑的數(shù)量免疫組化染色方法檢測Pbssl降低AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)老年斑的數(shù)量1)小鼠心臟灌流，取腦組織，進(jìn)行石蠟包埋。切片后脫蠟處理，并修復(fù)切片。2)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3% H202，室溫封閉5 lOmin，用水洗3次。3)滴加2% BSA, Ih后甩去多余液體。4)滴加一抗，6E10(1 1000) 37°C作用lh。然后以PBS洗三次，每次2min。5)滴加含有BSA的生物素化羊抗鼠(1 200) PBS溶液，37°C作用lh。PBC洗 3次，每次2min。6)滴加聯(lián)接 HRP 的親和素(1 100)，37°C 20min。PBS 洗 4 次，每次 5min。7)加入DAB顯色(DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色(鏡下掌握顯色程度))。8)蒸餾水沖洗。蘇木素復(fù)染2min、鹽酸酒精分化。9)脫水、透明、封片、鏡檢。檢測結(jié)果注射緩沖液PBS的小鼠海馬和皮層里的老年斑數(shù)量和面積明顯多于注射多肽 Pbssl的海馬和皮層)里的老年斑。應(yīng)用軟件系統(tǒng)(visiopharm)測定注射多肽(η = 7) 及對照小鼠(η = 7)海馬和皮層(每只動物每個部位檢測10-12張切片)的老年斑面積。 統(tǒng)計學(xué)分析表明，注射多肽Pbssl的小鼠老年斑面積明顯減少(與注射PBS組相比，*，P < 0.01)，結(jié)果如圖11所示。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
如下(a)或(b)的多肽，(a)其氨基酸序列為His-Asp-Pro-Ala-Pro-Rrg-Thr，(b)由(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、或添加一個或幾個氨基酸，且具有抑制β分泌酶酶切作用的由(a)衍生的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，其為(a)所示的多肽N端乙酰化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，其氨基酸序列為 His-Asp-Pro-Pro-Rrg-Thr。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，其氨基酸序列為 His-Asp-Pro—Gly-Pro-Rrg-Thr。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，其氨基酸序列為HiS-ASp-Pr0-Ala-HiS-Pro-Rrg-Thr-Leu0
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述多肽作為0分泌酶抑制劑的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述多肽作為A0聚集抑制劑的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述多肽在制備治療阿爾茨海默病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種多肽，其氨基酸序列為His-Asp-Pro-Ala-Pro-Rrg-Thr。本發(fā)明還提供所述多肽作為β分泌酶抑制劑、Aβ聚集抑制劑及在制備治療阿爾茨海默病的藥物中的應(yīng)用。實驗表明，本發(fā)明所述多肽可特異性結(jié)合APP上β分泌酶酶切位點，抑制β分泌酶酶切作用，抑制Aβ40和Aβ42的產(chǎn)生，抑制Aβ42的聚集和細(xì)胞毒性。將該多肽注射到AD轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行動物記憶實驗，結(jié)果表明，可以明顯改善小鼠的空間記憶能力，減少腦內(nèi)老年斑的數(shù)量。本發(fā)明所述多肽分子量小，易穿過血腦屏障，并且相比抗體，抗原性較差，副作用較小，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號A61K38/08GK101863962SQ20101017206
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月7日
發(fā)明者劉瑞田, 楊世高 申請人:清華大學(xué)