專利名稱：隱孢子蟲CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種隱孢子蟲CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隱孢子蟲病(cryptosporidiosis)是由隱孢子蟲(Cryptosporidiumspp.)引起的一種世界范圍內(nèi)廣泛流行的人獸共患寄生蟲病，可以感染包括人類在內(nèi)的哺乳類、鳥類、爬行類、兩棲類、魚類等170多種動(dòng)物。對免疫功能正常的宿主可引起自限性腹瀉，對免疫功能受損的宿主則呈慢性腹瀉并常常危及生命，給人類健康和生命安全帶來了嚴(yán)重威脅，也給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的損失。隱孢子蟲最先由Tyzzer于1907年在小鼠胃腺粘膜組織切片中發(fā)現(xiàn)。其中，微小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)是最主要的人獸共患病病原。迄今為止，研究人員已在實(shí)驗(yàn)室篩選了上千種化學(xué)藥物和抗生素，仍未找到理想的抗隱孢子蟲藥物。因此隱孢子蟲病的免疫預(yù)防和治療就顯得十分重要，但目前仍缺乏有效的隱孢子蟲病預(yù)防疫苗。在以往的隱孢子蟲疫苗研究中，人們通常在重組疫苗中編碼一個(gè)全長的隱孢子蟲抗原蛋白。但是，此類單一的疫苗候選分子的免疫保護(hù)效果并不理想，其原因可能是隱孢子蟲基因組巨大，生活史復(fù)雜，抗原種類繁多，單一的抗原無法徹底阻斷病原在宿主體內(nèi)的生活周期，導(dǎo)致單一抗原、單一表位的免疫保護(hù)效果不夠理想。考慮使用多抗原疫苗時(shí)，由于載體容量有限，并且大分子蛋白可能會(huì)造成動(dòng)物免疫病理反應(yīng)，所以在單一載體中加入多個(gè)抗原存在很大的局限性。近年來，國際寄生蟲學(xué)界開始嘗試?yán)每乖砦活A(yù)測工具進(jìn)行抗原表位預(yù)測，構(gòu)建多表位疫苗(multi-印itope vaccine)，多表位疫苗也稱雞尾酒式疫苗，是同時(shí)攜帶多個(gè)與目標(biāo)抗原相關(guān)的表位及輔助性表位的疫苗。與傳統(tǒng)疫苗相比，多表位疫苗具有獨(dú)特的優(yōu)勢，能被多種遺傳背景的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)分子所識別、結(jié)合，從而得到高效的遞呈，尤其在細(xì)胞免疫方面具有顯著的優(yōu)勢，以應(yīng)對病原微生物的變異以及免疫反應(yīng)中諸多的不利因素。在抗瘧疾多表位疫苗研制領(lǐng)域，已設(shè)計(jì)合成了多個(gè)基因工程疫苗和合成肽疫苗，取得了較好的免疫保護(hù)效果，其中不少已進(jìn)入II期或III期臨床試驗(yàn)。在隱孢子蟲領(lǐng)域目前尚無這方面的報(bào)道。為使機(jī)體獲得最佳的免疫保護(hù)，構(gòu)建多表位疫苗時(shí)需綜合考慮機(jī)體的免疫應(yīng)答特征和疾病的特殊性，針對性地選擇目的抗原表位。體液免疫主要通過B細(xì)胞產(chǎn)生抗體來發(fā)揮作用，故可以選擇特異性B細(xì)胞表位來定向誘導(dǎo)宿主的體液免疫應(yīng)答。細(xì)胞免疫應(yīng)答包括CD4+輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th細(xì)胞，分為Thl與Th2兩個(gè)亞群)應(yīng)答和⑶8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxicT lymphocyte, CTL)應(yīng)答。因此，可根據(jù)機(jī)體對病原體的免疫應(yīng)答特點(diǎn)，選擇特異性的Thl、Th2或CTL表位來誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答向Thl、Th2或CTL應(yīng)答類型定向發(fā)展。細(xì)胞免疫在宿主抗隱孢子蟲感染過程中起著至關(guān)重要的作用。研究顯示微小隱孢子蟲初次和再次感染均引起強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，其中CD4+輔助性T細(xì)胞參與控制感染， CDS+細(xì)胞毒性T細(xì)胞則有很強(qiáng)的清除寄生蟲的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決缺少有效的隱孢子蟲多表位疫苗的技術(shù)問題，提供一種隱孢子蟲 CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白，該混合多表位基因和融合蛋白可用于制備抗隱孢子蟲病的多表位疫苗。此外，還需要提供一種隱孢子蟲CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白在制備預(yù)防或治療隱孢子蟲病的疫苗中的應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種隱孢子蟲混合多表位融合蛋白，包含SEQ ID NO. USEQ ID NO. 3中任意一條或兩條氨基酸序列。所述SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 3 都富含 CTL 和 Th 表位，SEQ ID NO. 1 中含有 4 個(gè)CTL表位和2個(gè)Th表位，SEQ ID N0. 3中含有3個(gè)CTL表位和1個(gè)Th表位。優(yōu)選的，所述隱孢子蟲混合多表位融合蛋白還包含SEQ ID N0. 2所示氨基酸序列， 該序列中含有4個(gè)Th表位。增加SEQ ID N0. 2序列可適當(dāng)提高免疫肽分子量，以使免疫小鼠產(chǎn)生更高的血清抗體效價(jià)、具有更好免疫原性。優(yōu)選的，所述SEQ ID N0. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3三段序列之間設(shè)有柔性氨基酸組成的接頭序列，該接頭序列能使各段富含CTL和Th表位的氨基酸序列在空間上互相獨(dú)立，防止各表位多肽分子由于空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而阻礙其和MHC(主要組織相容性復(fù)合體，具有抗原呈遞作用)分子的結(jié)合；同時(shí)接頭序列可適當(dāng)提高免疫肽分子量，以增強(qiáng)多表位融合蛋白的免疫原性。更優(yōu)選的，所述融合蛋白具有SEQ ID N0. 7所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種隱孢子蟲混合多表位基因，其包含編碼上述融合蛋白的核苷酸序列。優(yōu)選的，所述隱孢子蟲混合多表位基因具有編碼SEQ ID N0. 7所示氨基酸序列的核苷酸序列。更優(yōu)選的，所述隱孢子蟲混合多表位基因具有SEQ ID N0. 8所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含上述隱孢子蟲混合多表位基因的重組載體。所述重組載體包括重組克隆載體或重組表達(dá)載體，重組表達(dá)載體包括重組原核表達(dá)載體、重組真核表達(dá)載體。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種疫苗，包含上述隱孢子蟲混合多表位基因和表達(dá)載體。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種隱孢子蟲混合多表位融合蛋白在制備預(yù)防或治療隱孢子蟲病的疫苗中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，將融合蛋白與弗氏不完全和完全佐劑、Montanide ISA 206等充分混勻制備亞單位疫苗。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種隱孢子蟲混合多表位基因在制備預(yù)防或治療隱孢子蟲病的疫苗中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，將隱孢子蟲混合多表位基因克隆到真核表達(dá)載體如pVAXl、pcDNA3. 1 等，或共同插入細(xì)胞因子基因，構(gòu)建成核酸疫苗。本發(fā)明隱孢子蟲CTL和Th混合多表位基因，克隆到真核表達(dá)載體后形成的核酸疫苗，經(jīng)動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，本發(fā)明核酸疫苗組排出卵囊數(shù)量明顯減少，開始排出卵囊時(shí)間延后，卵囊排出持續(xù)時(shí)間明顯縮短，提示該核酸疫苗對小鼠隱孢子蟲鼠基因型感染有很好的免疫保護(hù)效果。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1是本發(fā)明實(shí)施例2隱孢子蟲PI、P2和P3基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例2隱孢子蟲混合多表位融合基因P1-2和CpT的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例2重組質(zhì)粒pMD-CpT雙酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例3重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-CpT的雙酶切鑒定電泳圖；圖5是本發(fā)明實(shí)施例3重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖；圖6是本發(fā)明實(shí)施例3重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖；圖7是本發(fā)明實(shí)施例4隱孢子蟲混合多表位基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定圖；圖8是本發(fā)明實(shí)施例4重組克隆載體pMD18T_CpT(e)的雙酶切鑒定電泳結(jié)果圖；圖9是本發(fā)明實(shí)施例4重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-1-CpT的雙酶切鑒定圖；圖10是本發(fā)明實(shí)施例5重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-1-CpT作為核酸疫苗免疫后小鼠隱孢子蟲卵囊排出曲線圖。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎(chǔ)，等譯.第3版，北京科學(xué)出版社，200 中所述的方法進(jìn)行。本發(fā)明利用生物信息學(xué)技術(shù)，對微小隱孢子蟲疫苗候選抗原與宿主MHC I類分子 H2-Kd、H2-Ld和H2-Dd以及MHC II類分子H2_Ad、H2_Ed結(jié)合的表位分別進(jìn)行預(yù)測，篩選出理想的抗原表位；選取多個(gè)富含CTL和Th表位的不同抗原片段，構(gòu)建包含一個(gè)或多個(gè)抗原片段、且富含CTL和Th表位的多價(jià)多表位基因，各抗原片段之間用柔性氨基酸鏈接。將該多表位基因克隆到原核表達(dá)載體中進(jìn)行原核表達(dá)；將該多表位基因克隆到真核表達(dá)載體， 構(gòu)建核酸疫苗，觀察其對小鼠隱孢子蟲感染的免疫保護(hù)效果。動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示， 與對照組相比，核酸疫苗組排出卵囊數(shù)量明顯減少，開始排出卵囊時(shí)間延后，卵囊排出持續(xù)時(shí)間明顯縮短，提示該核酸疫苗對小鼠隱孢子蟲鼠基因型感染有很好的免疫保護(hù)效果。實(shí)施例1隱孢子蟲T細(xì)胞抗原表位的預(yù)測和篩選從GenBank下載微小隱孢子蟲抗原CP15 (登錄號L34568)、CP15/60 (登錄號L08612)的氨基酸(Amino Acid, AA)和基因序列，從實(shí)驗(yàn)室獲得隱孢子蟲鼠基因型(Cryptosporidiummousegenotype) P23 抗原氨基酸及基因序列。運(yùn)用 SYFPEITHI (http // www. syfpeithi. de/home. htm)、ProPred-1(http://www. imtech. res. in/raghava/ propredl/)和 NetMHC 3. O (http: //www. cbs. dtu. dk/services/NetMHC/) 3 個(gè)表位預(yù)測服務(wù)器，分別對上述隱孢子蟲抗原同鼠源9個(gè)氨基酸殘基的H2-d (包括H2-Kd、H2-Ld和 H2-Dd)型MHC I類分子結(jié)合的限制性CTL表位進(jìn)行預(yù)測。具體方法為預(yù)測H2_Kd、 H2-Ld限制性表位時(shí)，將抗原氨基酸序列分別輸入服務(wù)器，保存SYFPEITH I預(yù)測分值大于20的9肽；同時(shí)保存ftOPred-I返回結(jié)果的前15位；尋找二者的重復(fù)序列。按照文獻(xiàn)[Panagiotopoulos C，Qin H，Tan R，et al. Identification of a β -cell-specific HLA class I restricted epitope in type 1 diabetes[J]. Diabetes，2003，52 (11) 2647-2651]報(bào)道的方法，計(jì)算兩者所含MHC I類分子結(jié)合9肽的得分并排序，選取得分明顯大于其他肽段的序列。結(jié)合NetMHC 3. O預(yù)測結(jié)果，進(jìn)行綜合分析。預(yù)測H2_Dd限制性表位時(shí)，保存ProPred-I返回結(jié)果的前15位，結(jié)合NetMHC 3. O預(yù)測結(jié)果進(jìn)行綜合分析。運(yùn)用RANKPEP (http //bio. dfci. harvard. edu/RANKPEP/) ,MHCPred (http //www. jenner. ac. uk/MHCPred)、MHC2Pred (http: //www. imtech. res. in/raghava/mhc2pred/)禾口 MHC BindingPrediction(http://epitope, liai. org :8080/tools/matrix/iedb_input ？ matrixClass = I，II) 4個(gè)表位預(yù)測服務(wù)器預(yù)測3個(gè)隱孢子蟲抗原同鼠源H2_d (包括H2_Ad 和H2-Ed)型MHC II類分子結(jié)合的Th表位。具體方法是，將隱孢子蟲抗原的氨基酸序列分別以FASTA格式輸入以上服務(wù)器，返回的表位數(shù)據(jù)存至word文檔。若氨基酸序列長度大于 1000個(gè)AA殘基時(shí)，保存得分高的前20個(gè)表位，否則取前15個(gè)表位。保存RANKPEP顯示為紅色的返回結(jié)果。找出4個(gè)服務(wù)器預(yù)測結(jié)果重復(fù)率大于60%的片段(即有5個(gè)以上重復(fù)氨基酸殘基)取其并集，將序列向兩端各延長1-6個(gè)序列作為鼠源H2-d型分子結(jié)合的候選表位。結(jié)果經(jīng)過預(yù)測，發(fā)現(xiàn)微小隱孢子蟲CP15抗原5-59AA區(qū)段(SEQ ID NO. 1)、隱孢子蟲鼠基因型P23抗原的1-113AA區(qū)段(SEQ ID N0. 2)、微小隱孢子蟲CP15/60抗原的 11-95AA區(qū)段(SEQ ID N0. 3)分別含有4、0、3個(gè)CTL表位，包括H2_Kd型表位2個(gè)，H2_Ld 型3個(gè)，H2-Dd型2個(gè)；分別含有2、4、1個(gè)Th表位。與其他區(qū)段相比，上述區(qū)段所含的T細(xì)胞表位較多，是CTL和Th表位富集區(qū)域，故選擇這3段序列構(gòu)建CTL和Th混合多表位基因， 并將CP15抗原5-59AA區(qū)段、P23抗原的1-113AA區(qū)段、CP15/60抗原的11-95AA區(qū)段編碼的核苷酸序列 SEQ ID N0. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6，依次命名為 PI、P2 和 P3。 實(shí)施例2隱孢子蟲CTL和Th混合多表位基因的擴(kuò)增和鑒定(1)引物的合成根據(jù)篩選的隱孢子蟲抗原CP15、P23和CP15/60表位富集區(qū)域編碼的核苷酸序列， 按照重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接法(gene splicing by overlap extension, gene S0Eing)PCR技術(shù)方法要求，設(shè)計(jì)3對引物，分別擴(kuò)增基因片段PI、P2和P3。引物序列見表1，在Pl上游引物(PlF)的5’端加上適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)性堿基、限制性內(nèi)切酶EcoR I序列；在P2的上游引物 (P2F)和Pl的下游引物(PlR)的5’端加上互補(bǔ)的一個(gè)15氨基酸多肽接頭的DNA序列；在 P2的下游引物(P2R)和P3上游引物(P3F)的5’端加上柔性氨基酸接頭GS的DNA序列；在 P3下游引物(P3R)的5’端加上限制性內(nèi)切酶Ml I序列、終止密碼子TAA和保護(hù)性堿基。 引物交由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。
表IPCR引物序列
目的片段來源引物名稱引物序列(5’ —3)添加序列擴(kuò)增產(chǎn)物大小 (bp)PlFCCGGAATTCCCGACCATGAAATTGGATGAGGnGTTG (SEQ ID NO. 9)EcdR. ICP15PlRCGACCCGCCACCGCCGCTGCCACCTCCGCCTGMCCGCCTCCACLinker (GGGGS) 3225CACGTAAATGGGTACGAACAG (SEQ ID NO. 10)P2FGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCLinker (GGGGS) 3P23GATGGGTTGTTCATCATCAAAGCC (SEQ ID NO. 11)393P2RCATGGATCCGGCATCAGCTGGCTTGTCTT (SEQ ID NO. 12)Linker GS/ Ββ λ ICP15/60P3FGCCGGATCCATGGGTAACTTGAAATCCTGTTGTTC (SEQ ID NO. 13)Linker GS/ Badl I276P3RCCCGTCGACTTATTCATCCAAAGCAATATTTCTGSa J I(SEQ ID NO. 14)在表1中，引物序列的加粗字體為酶切位點(diǎn)或Linker序列。(2)目的基因的擴(kuò)增與連接以實(shí)驗(yàn)室保存的隱孢子蟲重組質(zhì)粒pMD-18T-CP15、pMD_18T_P23、 PMD-18T-CP15/60的DH5 α轉(zhuǎn)化菌為模板，用表1的引物通過PCR分別擴(kuò)增目的片段Ρ1、Ρ2、 Ρ3。結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期大小相符。圖1中，M:100bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1 :P1擴(kuò)增產(chǎn)物；2 :P2擴(kuò)增產(chǎn)物；3 :P3擴(kuò)增產(chǎn)物。序列測定結(jié)果顯示，Pl大小為22^p，P2 大小為39!3bp，P3大小為276bp，未發(fā)生序列變異。PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收，通過gene SOEing PCR技術(shù)連接Pl、P2片段，命名為P1-2。用膠回收試劑盒回收P1-2，再次通過gene SOEing PCR技術(shù)連接P1-2和P3，命名為CpT。電泳結(jié)果顯示，P1-2和CpT的大小與預(yù)期相符(見圖2)。圖2中，M :100bp DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :P1"2擴(kuò)增產(chǎn)物；2 =CpT擴(kuò)增產(chǎn)物。用膠回收試劑盒回收CpT，采用TA克隆方法將目的基因與pMDIS-T載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α，挑取陽性克隆，用PCR、酶切和測序法驗(yàn)證。經(jīng)EcoR I和Ml I酶切鑒定正確(見圖3)后，進(jìn)行序列測定，結(jié)果顯示其大小為837bp(SEQ ID NO. 8)，其中16_擬8 位核苷酸為編碼區(qū)序列，該編碼區(qū)序列中，16-18位核苷酸ATG為起始密碼子，擬6-擬8位核苷酸TAA為終止密碼子，整個(gè)序列未發(fā)生序列變異。鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pMD-CpT。 圖3中，Ml IOObp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；M2 =Marker IV DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 重組質(zhì)粒pMD_CpT 的EcoR I和Ml I雙酶切產(chǎn)物。CpT的具體序列為CCGGAATTCCCGACCATGAAATTGGATGAGGTTGTTGAGCTTTTACCAGCACGTAAAAGACGTAAGATA GCCAGAGGTTGTCTTAACAGAAGAACTGCAGCTTTTATCGCAAAGCTCCGCAAATCTAAGGCTGAATGTCCAATGGGAGAGAAACCTGTTGCTGTTCGTACCCATTTACGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGT CGATGGGTTGTTCATCATCAAAGCCAGAAACTAAAGTTGCTGAAAATAAATCTGCAGCAGATGCTAACAAACAAAGA GAATTAGCTGAAAAGAAGGCTCAATTAGCCAAGGCTGTAAAGAATCCAGCTCCAATCAGCAACCAAGCTCAACAAAA GCCAGAAGAACCAAAGAAGTCCGAGCCTGCTCCAAATAACCCTCCAGCTGCTGATGCGCCAGCAGCCCAAGCTCCTG CTGCCCCTGCCCCTGCTGCCCCTGCTTCACAGGATAAGCCAGCTGAGGCTCCAGCTGCTGAAGCTCCAGCTGCTGAA CCTGCTGCTCAACAAGACAAGCCAGCTGATGCCGGATCCATGGGTAACTTGAAATCCTGTTGTTCTTTTGCCGATGA ACACTCCCTAACCTCTACTCAACTAGTAGTTGGAAATGGTTCAGGAGCTTCAGAAACTGCTTCCAACCACCCCCAAG AAGAAGTTAATGATATTAATACTTTTAATGTAAAGTTAATAATGCAAGATAGAAGTAAGCTTGACTGTGAGGTAGTA TTTGATAGCACAAGTATTTCGCTTTCTGGAGATGGAAAATGCAGAAATATTGCTTTGGATGAATAAGTCGACGGG(S EQ ID NO. 8)共編碼270個(gè)AA，序列為MKLDEVVELLPARKRRKIARGCLNRRTAAFIAKLRKSKAECPMGEKPVAVRTHLRGGGGSGGGGSGGGG SMGCSSSKPETKVAENKSAADANKQRELAEKKAQLAKAVKNPAP I SNQAQQKPEEPKKSEPAPNNPPAADAPAAQ APAAPAPAAPASQDKPAEAPAAEAPAAEPAAQQDKPADAGSMGNLKSCCSFADEHSLTSTQLVVGNGSGASETASNH PQEEVNDINTFNVKLIMQDRSKLDCEVVFDSTSISLSGDGKCRNIALDE(SEQ ID NO. 7)實(shí)施例3隱孢子蟲混合多表位基因的原核表達(dá)(1)原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定取pGEX-4T-l質(zhì)粒和pMD_CpT質(zhì)粒，分別同時(shí)用EcoR I和Ml I酶切。酶切產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收后用T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞， 篩選陽性菌落。堿裂解法提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR、EcoR I和Ml I雙酶切鑒定及測序鑒定陽性克隆，將鑒定正確的重組原核表達(dá)質(zhì)粒命名為pGEX-CpT。重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-CpT經(jīng) EcoR I和Ml I雙酶切鑒定結(jié)果如圖4所示，圖4中，1 pGEX-CpT的EcoR I和Ml I雙酶切產(chǎn)物；M =Marker IV DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，圖4表明重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX_CpT經(jīng)EcoR I 和Ml I雙酶切鑒定正確。(2)原核表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)將pGEX-CpT轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性單菌落，培養(yǎng)至 D600nm達(dá)0. 5左右時(shí)，以終濃度為1. Ommol/L的IPTG誘導(dǎo)7h，期間每隔Ih取樣，進(jìn)行濃度為 12%的SDS-PAGE電泳，觀察蛋白表達(dá)情況。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)證后表達(dá)量達(dá)到最高(見圖5)， SDS-PAGE分析蛋白的分子量比預(yù)計(jì)的57ku略大。在圖5中，1_3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌IPTG誘導(dǎo)證產(chǎn)物；4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌未誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；M 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量。取IPTG誘導(dǎo)證的表達(dá)菌，經(jīng)液氮凍融3次并進(jìn)行超聲波裂解，收集上清液，沉淀加8mol/L尿素溶解，離心后分別收集上清液和沉淀，經(jīng)GST柱純化后用SDS-PAGE分析重組蛋白的存在形式(見圖6)。圖6中，M 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量；1 :pGEX-CpT轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)證菌液；2 :pGEX-CpT轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)證菌液超聲裂解后的上清；3 :pGEX-CpT轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)證菌液超聲裂解后的沉淀溶于8mol/L尿素中；4 :pGEX-CpT轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)證菌液超聲裂解后的沉淀溶于PBS。BandScan軟件分析顯示，表達(dá)的重組蛋白占菌體蛋白總量的12. 3 %，主要以包涵體形式表達(dá)。實(shí)施例4隱孢子蟲混合多表位基因真核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建(1)引物的設(shè)計(jì)和合成
為使隱孢子蟲多表位基因CpT正確克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒中并正常表達(dá)，根據(jù) PVAXl載體多克隆位點(diǎn)上酶切位點(diǎn)及三聯(lián)密碼子要求重新設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增CpT(e)，引物引入限制性酶切位點(diǎn)EcoR I和)(ba I及Kozak序列，在EcoR I后補(bǔ)充堿基保證三聯(lián)體密碼子不錯(cuò)位。該引物序列的上游引物 CpT F(e)為CCGGAATTCCCGACCATGGCTATGAAATTGGATGAGG TTGTTG(SEQ IDN0. 15)；下游引物 CpT R(e)為CCCTCTAGATTATTCATCCAAAGCAATATTTCT (SEQ ID NO. 16)。(2)目的基因的擴(kuò)增、克隆和鑒定以pMD-CpT重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌為模板，利用引物CpT F(e)/CpT R(e)，擴(kuò)增目的片段 CpT(e)。經(jīng)過30個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增，獲得了 CpT(e)基因，大小與預(yù)計(jì)相符(見圖7)。圖7 中，M =IOObp DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 :CpT(e)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。用膠回收試劑盒回收CpT (e)，采用TA克隆方法將目的基因與pMD18_T載體連接， 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α，挑取陽性克隆，用PCR、EcoR I/Xba I雙酶切和測序法進(jìn)行驗(yàn)證， 鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為PMD-CpT (e)。重組質(zhì)粒pMD-CpT (e)經(jīng)EcoR I/Xba I雙酶切后得到2條帶，與預(yù)計(jì)片段大小相同(見圖8)。圖8中，Ml IOObp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；M2 Marker IV DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 重組質(zhì)粒pMD-CpT(e)的EcoR I和Xba I雙酶切產(chǎn)物。經(jīng)測序鑒定序列未發(fā)生堿基突變。(3)真核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建大量提取重組質(zhì)粒pMD-CpT (e)和真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX_l，用EcoR I和)(ba I分別進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收后用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性菌落，堿裂解法提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定陽性克隆，將鑒定正確的真核重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pVAX-l-CpT。pVAX-I-CpT經(jīng)EcoR I和)(ba I 雙酶切鑒定，得到與預(yù)計(jì)片段大小相符的片段(見圖9)。圖9中，Ml =Marker IV DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；M2 =IOObp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX_l_CpT的EcoR I和Xba I雙酶切產(chǎn)物。pVAX-1-CpT經(jīng)測序鑒定未發(fā)生堿基突變，插入的序列符合開放閱讀框的三聯(lián)體密碼子順序。用堿裂解法大量提取pVAX-1-CpT質(zhì)粒，聚乙二醇(PEG8000)沉淀法純化質(zhì)粒DNA， GEHeal thcare NanoVue紫外可見光分光光度計(jì)測定質(zhì)粒濃度。 實(shí)施例5動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)將30只4周齡BALB/c小鼠分成3組，每組10只，包括pVAX-I-CpT試驗(yàn)組和 pVAX-Ι空載體、生理鹽水對照組。試驗(yàn)組用重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-1-CpT經(jīng)生理鹽水稀釋后進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)免疫，每只小鼠注射質(zhì)粒0. 05mg ；2個(gè)對照組以相同的方法分別注射pVAX-Ι空載體和生理鹽水，pVAX-1免疫劑量亦為0. 05mg/只小鼠，生理鹽水對照組接種劑量為0.05mL/只小鼠。每2周免疫1次，共免疫3次。第3次免疫2周后，每只小鼠經(jīng)口接種IX IO6個(gè)隱孢子蟲鼠基因型卵囊。感染后每隔2d采取糞便10g，加40mL水溶解，銅紗網(wǎng)過濾，濾液3000r/min離心lOmin，收集沉淀。力卩IOmL飽和蔗糖混勻，1500r/min離心 IOmin0用鐵絲圈蘸取液面表層至載玻片上，蓋上蓋玻片，用10X40倍顯微鏡鏡檢，對50個(gè)視野內(nèi)的隱孢子蟲卵囊進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果與對照組相比，試驗(yàn)組開始排出卵囊時(shí)間延后。至感染后31d，核酸疫苗pVAX-1-CpT僅于感染后第IOd檢測到卵囊；pVAX-Ι空載體組于感染后第IOd檢測到卵嚢， 第16d達(dá)到高峰，至試驗(yàn)結(jié)束即接種后第31d，仍有卵囊排出；而生理鹽水對照組于感染后 第7d開始檢測到卵嚢，13-19d達(dá)到高峰，至感染后第31d仍有卵囊排出(圖7)。與對照組相比，試驗(yàn)組所排出卵囊數(shù)量明顯減少。各組小鼠糞便中隱孢子蟲卵囊 排出情況如圖10所示，31天各組總共檢測到的相對卵囊數(shù)依次為pVAX-l-CpT免疫組2 個(gè)；pVAX-Ι空載體對照16個(gè)；生理鹽水空白對照20個(gè)，差異非常顯著。與對照組相比，試驗(yàn)組卵囊排出持續(xù)時(shí)間明顯減少。pVAX-1-CpT試驗(yàn)組僅于感染 后第IOd檢測到卵囊；pVAX-Ι空載體組排卵囊持續(xù)時(shí)間超過21d ；生理鹽水對照組排卵囊 時(shí)間超過24d(見圖10)。圖10結(jié)果表明本發(fā)明重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-1-CpT制成的核酸疫苗具有很好的 免疫保護(hù)效果。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能 因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說， 在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所<120>隱孢子蟲CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白及其應(yīng)用<160>16<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>55<212>PRT<213>Cryptosporidium parvum<220><221>MISC_FEATURE<222>(1). . (55)<223>CP15 抗原片段<400>1Met Lys Leu Asp Glu Val Val Glu Leu Leu Pro Ala Arg Lys Arg Arg151015Lys lie Ala Arg Gly Cys Leu Asn Arg Arg Thr Ala Ala Phe lie Ala202530Lys Leu Arg Lys Ser Lys Ala Glu Cys Pro Met Gly Glu Lys Pro Val354045Ala Val Arg Thr His Leu Arg5055<210>2
<211>113
<212>PRT
<213>Cryptosporidium mouse genotype
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1). . (113)
<223>P23 抗原
<400>2
Met Gly Cys SerSerSerLysProGluThrLysValAlaGluAsnLys
151015
Ser Ala Ala AspAlaAsnLysGlnArgGluLeuAlaGluLysLysAla
202530
Gln Leu Ala LysAlaValLysAsnProAlaProlieSerAsnGlnAla
354045
Gln Gln Lys ProGluGluProLysLysSerGluProAlaProAsnAsn
505560
Pro Pro Ala AlaAspAlaProAlaAlaGlnAlaProAlaAlaProAla
65707580
Pro Ala Ala ProAlaSerGlnAspLysProAlaGluAlaProAlaAla
859095
Glu Ala Pro AlaAlaGluProAlaAlaGlnGlnAspLysProAlaAsp
100105110
Ala
<210>3
<211>85
<212>PRT
<213>Cryptosporidium parvum
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1). . (85)
<223>CP15/60抗原片段
<400>3
Met Gly Asn LeuLysSerCysCysSerPheAlaAspGluHisSerLeu
151015
Thr Ser Thr GlnLeuValValGlyAsnGlySerGlyAlaSerGluThr
202530
Ala Ser Asn HisProGlnGluGluValAsnAsplieAsnThrPheAsn
354045
Val Lys Leu lieMetGlnAspArgSerLysLeuAspCysGluValVal
505560
Phe Asp Ser Thr Ser lie Ser Leu Ser Gly Asp Gly Lys Cys Arg Asn65707580lie Ala Leu Asp Glu85<210>4<211>165<212>DNA<213>Cryptosporidium parvum<400>4atgaaattgg atgaggttgt tgagctttta ccagcacgta aaagacgtaa gatagccaga 60ggttgtctta acagaagaac tgcagctttt atcgcaaagc tccgcaaatc taaggctgaa 120tgtccaatgg gagagaaacc tgttgctgtt cgtacccatt tacgt165<210>5<211>339<212>DNA<213>Cryptosporidium mouse genotype<400>5atgggttgtt catcatcaaa gccagaaact aaagttgctg aaaataaatc tgcagcagat 60gctaacaaac aaagagaatt agctgaaaag aaggctcaat tagccaaggc tgtaaagaat 120ccagctccaa tcagcaacca agctcaacaa aagccagaag aaccaaagaa gtccgagcct 180gctccaaata accctccagc tgctgatgcg ccagcagccc aagctcctgc tgcccctgcc 240cctgctgccc ctgcttcaca ggataagcca gctgaggctc cagctgctga agctccagct 300gctgaacctg ctgctcaaca agacaagcca gctgatgcc339<210>6<211>255<212>DNA<213>Cryptosporidium parvum<400>6atgggtaact tgaaatcctg ttgttctttt gccgatgaac actccctaac ctctactcaa 60ctagtagttg gaaatggttc aggagcttca gaaactgctt ccaaccaccc ccaagaagaa 120gttaatgata tcaatacttt taatgtaaag ttaataatgc aagatagaag taagcttgac 180tgcgaggtag tatttgatag cacaagtatt tcgctttctg gagatggaaa atgcagaaat 240attgctttgg atgaa255<210>7<211>270<212>PRT<213>人工序列<220><221>MISC_FEATURE0181]<222>(1)..(55)0182]<223>CP15抗原片段0183]<220>0184]<221>MISC_FEATURE0185]<222>(56). . (70)0186]<223>接頭序列0187]<220>0188]<221>MISC_FEATURE0189]<222>(71). . (183)0190]<223>P23抗原序列0191]<220>0192]<221>MISC_FEATURE0193]<222>(184). . (185)0194]<223>接頭序列0195]<220>0196]<221>MISC_FEATURE0197]<222>(186). . (270)0198]<223>CP15/60抗原片段0199]<400>70200]Met LysLeu Asp GluValValGluLeuLeuProAlaArgLysArgArg0201]1510150202]Lys IleAla Arg GlyCysLeuAsnArgArgThrAlaAlaPhelieAla0203]2025300204]Lys LeuArg Lys SerLysAlaGluCysProMetGlyGluLysProVal0205]3540450206]Ala ValArg Thr HisLeuArgGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly0207]5055600208]Ser GlyGly Gly GlySerMetGlyCysSerSerSerLysProGluThr0209]657075800210]Lys ValAla Glu AsnLysSerAlaAlaAspAlaAsnLysGlnArgGlu0211]8590950212]Leu AlaGlu Lys LysAlaGlnLeuAlaLysAlaValLysAsnProAla0213]1001051100214]Pro lieSer Asn GlnAlaGlnGlnLysProGluGluProLysLysSer0215]1151201250216]Glu ProAla Pro AsnAsnProProAlaAlaAspAlaProAlaAlaGln0217]1301351400218]Ala ProAla Ala ProAlaProAlaAlaProAlaSerGlnAspLysPro0219]145150155160
Ala Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Glu Pro Ala Ala Gln165170175Gln Asp Lys Pro Ala Asp Ala Gly Ser Met Gly Asn Leu Lys Ser Cys180185190Cys Ser Phe Ala Asp Glu His Ser Leu Thr Ser Thr Gln Leu Val Val195200205Gly Asn Gly Ser Gly Ala Ser Glu Thr Ala Ser Asn His Pro Gln Glu210215220Glu Val Asn Asp lie Asn Thr Phe Asn Val Lys Leu lie Met Gln Asp225230235240Arg Ser Lys Leu Asp Cys Glu Val Val Phe Asp Ser Thr Ser lie Ser245250255Leu Ser Gly Asp Gly Lys Cys Arg Asn lie Ala Leu Asp Glu260265270<210>8<211>837<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(16). . (828)<400>8ccggaattcc cgacc atg aaa ttg gat gag gtt gtt gag ctt tta cca gca 51Met Lys Leu Asp Glu Val Val Glu Leu Leu Pro Ala1510cgt aaa aga cgt aag ata gcc aga ggt tgt ctt aac aga aga act gca 99Arg Lys Arg Arg Lys lie Ala Arg Gly Cys Leu Asn Arg Arg Thr Ala152025get ttt ate gca aag ctc cgc aaa tct aag get gaa tgt cca atg gga 147Ala Phe lie Ala Lys Leu Arg Lys Ser Lys Ala Glu Cys Pro Met Gly303540gag aaa cct gtt get gtt cgt acc cat tta cgt ggt gga ggc ggt tea 195Glu Lys Pro Val Ala Val Arg Thr His Leu Arg Gly Gly Gly Gly Ser45505560ggc gga ggt ggc age ggc ggt ggc ggg tcg atg ggt tgt tea tea tea 243Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Gly Cys Ser Ser Ser657075aag cca gaa act aaa gtt get gaa aat aaa tct gca gca gat get aac 291Lys Pro Glu Thr Lys Val Ala Glu Asn Lys Ser Ala Ala Asp Ala Asn
808590
caaagagaattagetgaaaagaaggetcaattagccaaggetgta339
LysGlnArgGluLeuAlaGluLysLysAlaGlnLeuAlaLysAlaVal
95100105
aagaatccagetccaateageaaccaagetcaacaaaagccagaagaa387
LysAsnProAlaProlieSerAsnGlnAlaGlnGlnLysProGluGlu
110115120
ccaaagaagtccgagcctgetccaaataaccctccagetgetgatgcg435
ProLysLysSerGluProAlaProAsnAsnProProAlaAlaAspAla
125130135140
ccagcagcccaagetcctgetgcccctgcccctgetgcccctgettea483
ProAlaAlaGlnAlaProAlaAlaProAlaProAlaAlaProAlaSer
145150155
caggataagccagetgaggetccagetgetgaagetccagetgetgaa531
GlnAspLysProAlaGluAlaProAlaAlaGluAlaProAlaAlaGlu
160165170
cctgetgetcaacaagacaagccagetgatgccggatccatgggtaac579
ProAlaAlaGlnGlnAspLysProAlaAspAlaGlySerMetGlyAsn
175180185
ttgtcctgttgttcttttgccgatgaacactccctaacctctact627
LeuLysSerCysCysSerPheAlaAspGluHisSerLeuThrSerThr
190195200
caactagtagttggaaatggtteaggagetteagaaactgettccaac675
GlnLeuValValGlyAsnGlySerGlyAlaSerGluThrAlaSerAsn
205210215220
cacCCCcaagaagaagttaatgatattaatacttttaatgtaaagtta723
HisProGlnGluGluValAsnAsplieAsnThrPheAsnValLysLeu
225230235
ataatgcaagatagaagtaagCttgactgtgaggtagtatttgatage771
lieMetGlnAspArgSerLysLeuAspCysGluValValPheAspSer
240245250
acaagtatttcgCtttctggagatggatgcagaaatattgetttg819
ThrSerlieSerLeuSerGlyAspGlyLysCysArgAsnlieAlaLeu
255260265
gatgaataagtcgacggg837
AspGlu
270
<210>9
<211>37
<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (37)<223> 引物<220><221>misc_feature<222> (4). . (9)<223>EcoR I 酶切位點(diǎn)<400>9ccggaattcc cgaccatgaa attggatgag gttgttg37<210>10<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (65)<223> 引物<220><221>misc_feature<222>(1). . (45)<223>接頭序列<400>10cgacccgcca ccgccgctgc cacctccgcc tgaaccgcct ccaccacgta aatgggtacg60aacag65<210>11<211>68<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (68)<223> 引物<220><221>misc_feature<222>(1). . (45)<223>接頭序列
<400>11ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggcagc ggcggtggcg ggtcgatggg ttgttcatca 60tcaaagcc68<210>12<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (29)<223> 引物<220><221>misc_feature<222> (4) · · (9)<223>BamH I 酶切位點(diǎn)<220><221>misc_feature<222> (4) · · (9)<223>接頭序列<400>12catggatccg gcatcagctg gcttgtctt29<210>13<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (35)<223〉引物<220><221>misc_feature<222> (4) ·· (9)<223>BamH I 酶切位點(diǎn)<220><221>misc_feature<222>(4). . (9)<223>接頭序列<400>13gccggatcca tgggtaactt gaaatcctgt tgttc 35
<210>14<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (34)<223> 引物<220><221>misc_feature<222> (4) (9)<223>Sal I 酶切位點(diǎn)<400>14cccgtcgact tattcatcca aagcaatatt tctg 34<210>15<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (43)<223> 引物<220><221>misc_feature<222> (4) (9)<223>EcoR I 酶切位點(diǎn)<400>15ccggaattcc cgaccatggc tatgaaattg gatgaggttg ttg 43<210>16<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (33)<223> 引物<220><221>misc_feature<222バ4). .(9)
<223>Xba I 酶切位點(diǎn)<400>16ccctctagat tattcatcca aagcaatatt tct3權(quán)利要求
1.一種隱孢子蟲混合多表位融合蛋白，其特征在于，包含SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3 中任意一條或兩條氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的隱孢子蟲混合多表位融合蛋白，其特征在于，還包含SEQID NO. 2所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的隱孢子蟲混合多表位融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有SEQ ID NO. 7所示的氨基酸序列。
4.一種隱孢子蟲混合多表位基因，其特征在于，包含編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的隱孢子蟲混合多表位基因，其特征在于，所述混合多表位基因具有編碼SEQ ID NO. 7所示氨基酸序列的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的隱孢子蟲混合多表位基因，其特征在于，所述混合多表位基因具有SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。
7.—種重組載體，其特征在于，包含權(quán)利要求4所述的隱孢子蟲混合多表位基因。
8.一種疫苗，其特征在于，包含權(quán)利要求4所述的隱孢子蟲混合多表位基因和表達(dá)載體。
9.權(quán)利要求1所述的隱孢子蟲混合多表位融合蛋白在制備預(yù)防或治療隱孢子蟲病的疫苗中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求4所述的隱孢子蟲混合多表位基因在制備預(yù)防或治療隱孢子蟲病的疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種隱孢子蟲CTL和Th混合多表位融合蛋白，其包含SEQ ID NO.1、SEQID NO.3中任意一條或兩條氨基酸序列。本發(fā)明還公開了隱孢子蟲混合多表位基因，其包含編碼上述融合蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明隱孢子蟲混合多表位基因和融合蛋白，能制成疫苗，對小鼠隱孢子蟲感染具有很好的免疫保護(hù)效果，適于作為抗隱孢子蟲病的多表位疫苗。
文檔編號A61K39/002GK102276725SQ20101020011
公開日2011年12月14日 申請日期2010年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月13日
發(fā)明者周鵬, 李艷, 米榮升, 陳兆國, 黃燕 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所