專利名稱：重組微纖維蛋白溶酶及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物學藥物領域，具體地涉及一種應用于眼科疾病方面的重組微纖維蛋白溶酶及其制備方法和應用。
背景技術：
病理性纖維增殖導致的后玻璃體粘連變形是增殖型玻璃體視網膜病變等疾病發展的結果。由病理性纖維增殖膜及玻璃體后皮質對視網膜的粘連、牽拉，成為影響黃斑性目盲疾病治療和預后的重要因素。玻璃體切除術是現今治療增殖型玻璃體視網膜病變等疾病的一種醫療手段。但是在這些疾病中，病理性纖維增殖膜和玻璃體后皮質與視網膜緊密粘連，難于完整剝離，手術難度大，并發癥多。因此探尋分離玻璃體后皮質、松解病理性纖維增殖膜與視網膜之間的粘連的新方法成為當前亟待解決的難題。糖尿病引起的視網膜病變是目前的多發病之一。糖尿病已成為威脅人類健康的第三大殺手，中國的糖尿病患者人數第一、增長速度最快，目前患病人數接近一個億。糖尿病嚴重時可累及全身各個器官，引起多種并發癥，致死致殘。視網膜病變是糖尿病的主要并發癥，已成為主要致盲眼病。玻璃體黃斑粘連是其病變和預后的主要因素。如上所述，現今治療方案是用外科手術完全切除玻璃體后皮質及病理性纖維增殖膜，解除其對視網膜黃斑的粘連和牽拉。此手術方法具有費用高、手術難度大，及因剝離不完全而導致術后并發癥多等缺點。因此現在有廣大的糖尿病患者因得不到治療而導致盲目。非手術、簡便和經濟的藥物治療玻璃體黃斑粘連是當前的迫切需求。

發明內容
為了解決上述問題，本發明提供一種重組微纖維蛋白溶酶，通過對患者的眼部玻璃體或/和水狀體施加一定有效量的包括重組`微纖維蛋白溶酶的藥物組合物，以溶解玻璃體和/或引起玻璃體后脫離。本發明可用于降低玻璃體粘性，溶解玻璃體，誘導玻璃體后脫離，降低眼內出血，清除或降低對眼睛有毒的物質，增加眼部用藥的擴散，減低外視網膜新血管生成及任何以上病狀的復合。本發明可輔助或者代替傳統的機械玻璃體切除術。應用本發明的酶解法可避免手術，應用簡單，使病理性纖維增殖膜及玻璃體后皮質對視網膜的粘連剝離完全，無并發癥，及治療費用低廉。本發明采用的技術方案是:一種重組微纖維蛋白溶酶原多肽，具有如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。一種利用大腸桿菌表達系統生產上述的重組微纖維蛋白溶酶原多肽的方法，步驟如下:
(1)將編碼重組微纖維蛋白溶酶原多肽的DNA序列插入基于質粒的大腸桿菌疋表達載體PETll中，然后傳導到大腸桿菌宿主中，并用氨芐青霉素選擇抗性克隆；所述的編碼重組微纖維蛋白溶酶原多肽的DNA序列如SEQ ID N0.1所示；
(2)重組微纖維蛋白溶酶原多肽的表達、復性以及純化:①將(I)中選擇的培養攜帶表達質粒的疋coli抗性克隆在培養基中培養到A600=0.6-0.9的生長期加入IPTG誘導蛋白以包涵體形式表達，37 °C下繼續培養3-5小時；③離心收獲細菌，然后通過凍融和漂洗得到純化的包涵體；@在pH 8-10的8M尿素緩沖液中溶解包涵體； 將含有包涵體的尿素緩沖液快速稀釋到20倍的20 mM Tris, 0.2 M精氨酸，pH 9.0的緩沖液中，得復性蛋白；⑥采用分子排阻色譜法將復性蛋白完全分離出來；⑦采用離子交換和親和層析進一步純化復性蛋白，即為重組微纖維蛋白溶酶原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。一種重組微纖維蛋白溶酶:是將上述的重組微纖維蛋白溶酶原多肽經活化酶激活成重組微纖維蛋白溶酶。所述的激活酶是尿激酶、組織纖溶酶原激活物、鏈激酶、或普激酶。上述的重組微纖維蛋白溶酶作為有效成分用于制備治療玻璃體黃斑牽引綜合癥、黃斑裂洞、視網膜脫離、視網膜撕裂、視網膜新生血管形成、視網膜出血、視網膜水腫、或者處理玻璃體后脫離不完全的手術并發癥的藥物。重組微纖維蛋白溶酶的用量為:每只眼睛0.005毫克-0.2毫克。本發明的重組微纖維蛋白溶酶(μρ )可以溶解造成后玻璃體粘連的纖維蛋白，包括fibronectin和Iaminin,從而達到酶解法后玻璃體脫離的治療效果。本發明采用大腸桿菌生產重組μρ πι，通過眼部的玻璃體腔注射μρ πι可以有效解除玻璃體黃斑粘連，具有特異性強、免疫原性低、副作用小等優點。利用本發明采用大腸桿菌表達系統生產的重組μρ πι，制備治療玻璃體黃斑粘連的藥物，具有表達量高，生 產工藝簡便，生產成本低，和表達蛋白活性穩定，制品使用安全等特點。應用本發明可開發出經濟安全，非手術治療玻璃體黃斑粘連的藥物，以克服目前外科切除手術所面臨的費用高、手術難度大和并發癥多等問題。


圖1是重組微纖維蛋白溶酶原多肽(mPlg)在用尿激酶激活成重組微纖維蛋白溶酶(mPlm)前的SDS-PAGE電泳圖。線道1，標準分子量；線道2，非還原的mPlg ;線道3，還原的mPlg。圖2是重組微纖維蛋白溶酶原多肽的氨基酸序列。圖中標記了酶原的激活健(R27V21)。圖3是本發明復性的重組微纖維蛋白溶酶與市場纖維蛋白溶酶(Sigma，St.Louis, MO)的酶動力學參數比較(Hanes plot kinetic comparison)。酶解底物是發色作用物 S-2403 (Chromogenix, Goteberg, Sweden)。圖4是圖三中動力學常數的總結。
具體實施例方式實施例1重組微纖維蛋白溶酶 (一)重組微纖維蛋白溶酶原多肽的制備
(I)本發明的重組微纖維蛋白溶酶原多肽在大腸桿菌中表達。將編碼所需重組微纖維蛋白溶酶原多肽(氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示)的DNA序列(如SEQ ID NO:1所示)插入基于質粒的大腸桿菌(萬.co7i)表達載體(如pETll載體)中，然后傳導到合適的大腸桿菌宿主(如BL21(DE3))中，并用氨節青霉素(Ampicillin)選擇抗性克隆。
(2)重組微纖維蛋白溶酶原多肽(PPlg)的表達、復性以及純化。具體流程如下:I)將(I)中選擇的培養攜帶表達質粒的疋coli抗性克隆在培養基(如LB/Ampicillin)中培養到一定的生長期(如A600=0.6-0.9) ；2)加入IPTG誘導蛋白以包涵體形式表達，繼續培養一定的時間(如3-5小時，37 °C) ；3)通過離心等方法收獲細菌，然后通過凍融和漂洗等方法得到純化的包涵體；4)在SM尿素緩沖液中溶解包涵體，此緩沖液包括一種或多種還原劑，和使溶液緩沖至約pH 8-10的緩沖劑，如20 mM Tris ；5)用復性方法將變性蛋白復性成它的天然構象，如用快速稀釋法將包含體緩沖液稀釋到20倍的20 mM Tris,0.2 M精氨酸，pH 9.0的緩沖液中,得復性蛋白；6)采用分子排阻色譜(size ExclusionChromatography, SEC)法從部分或全部未折疊的KPlg或它的多聚體中將復性蛋白完全分離出來，示例性的SEC柱層析包括Superdex 200和Superdex 75,示例性的層析柱緩沖液為20 mM Tris, 0.2 M精氨酸，0.2 M NaCl, pH 8.0 ；7)采用離子交換和親和層析技術進一步純化復性蛋白，即為重組微纖維蛋白溶酶原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示；8)SEC純化的PPlg可以進一步用其他層析柱如離子交換柱和輸水柱等方法純化。圖1顯示了純化后的重組微纖維蛋 白酶原多肽。(3) PPlg 的活化:
以上所純化的重組微纖維蛋白溶酶原多肽(KPlg)可以用不同的方法激活成重組微纖維蛋白溶酶(μρ πι)。激活重組微纖維蛋白溶酶原多肽的活化酶可以是尿激酶，組織纖溶酶原激活物(tPA)，鏈激酶，及普激酶。激活的過程采用本領域的常規知識，是本領域技術人員所共知的。激活后所得到的μρ πι可以用離子交換柱層析方法純化，然后傳入到穩定緩沖液中。穩定緩沖液包括:20 mM檸檬酸，10%蔗糖，pH 3.1。此緩沖液中的微纖維蛋白溶酶可以作為一種藥物組合物制備成藥物劑型。(二)酶動力學及實驗分析
(I)重組μρ πι與商用纖溶酶在動力學方面的比較。如圖3和圖4所示，本發明復性純化的μ Plm與市場的血纖維蛋白溶酶的特異活性及動力學性質都相似。具體動力學測定方法是本領域技術人員所周知的。下面是一個簡單的描述。用固定濃度的μ Plm，在21° C環境下，與不同濃度的一系列纖溶酶底物S-2403混合。用酶標儀測定各反應速度并具此計算動力學數據。圖3和圖4用此處所描述的顯色法比較了重組型μ Plm與商業的血纖維蛋白溶酶(Sigma，Cat # P1867)動力學特性。原始數據被轉換為μ M單位，并采用Hanes plot方法進行分析工作。如圖3所示。μΡΙπι和血纖維蛋白溶酶按照固定的濃度混合成一系列濃度的s-2403 (200-2000 μ Μ)，分成四組用titertek公司的微量洗液管移到96孔板中。每間隔 5 15 分鐘使用 384 板的酶標儀(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)測試 A405nm30秒，數據被轉換成μ M格式并使用Hanes plot進行分析。如圖4所示，μΡΙπι和血纖維蛋白溶酶的Km’s and Kcats非常相似。總的來說，μΡΙπι的催化效率比血纖維蛋白溶酶(15.2μ M min-1 vs.11.9 μ M min-1)的效率要高 1.27 以上。(2)動物實驗:
Ca)毒理學的動物物種選擇。下列動物可以用于本發明的動物實驗。.采用豬作為非嚙齒類動物，可以獲得有效的數據；
采用兔子作為嚙齒類動物，因為兔子已被廣泛的應用于眼科研究的試驗中，并且兔子眼睛的尺寸更易于在玻璃體內給藥和取樣； 選擇小鼠作為系統性的毒性物種，因為小鼠是一種可以獲得有效數據的物種。(b)豬動物實驗示例
下列是重組微纖維蛋白溶酶的實驗劑量:在0.1毫升的體積中，包括劑量為0.0625，
0.125,0.156, 0.25和0.390毫克。上述重組微纖維蛋白溶酶分別注射入新鮮宰殺的豬眼睛的玻璃體內液中。在室溫(約24 °C)注射量為0.0625毫克，約I小時后可觀察到玻璃體后剝離，但注射量為0.125毫克約半小時后即可觀察到玻璃體后剝離。另外，在注射量低于0.25毫克的情況下觀察不到任何眼睛或視網膜的毒性，說明有效濃度是在毒性濃度以下。(C)玻璃腔體內單次和重復給藥的毒理研究總結
單次給藥:在兔子和豬的玻璃腔體內單次給藥以獲得急性毒性數據，最高劑量設為3mg/eye(60mg/ml,0.050ml/eye),低劑量和中間劑量為高劑量的1/2遞減(I mg/eye或者
0.3mg/eye)，同時設置未給藥的對照組用于評估玻璃腔體注射對眼睛損傷。給藥后采集眼睛中玻璃體的基底膜樣本，用于測定藥物的殘留，同時采集血漿樣本用于評估玻璃腔體注射之后，藥物的系統性分布。

重復給藥:兔子和豬每周給藥一次，連續5周，給藥劑量與單次給藥的劑量一致，同時設置未給藥的對照組用于評估玻璃腔體注射對眼睛損傷。每次給藥后采集血漿樣，連續給藥后采集眼睛中玻璃體的基底膜樣本，用于測定藥物積累效果。結論:實驗結果證明即使在高劑量，重組微纖維蛋白溶酶對眼睛組織也沒有明顯損傷。在中底劑量，重組微纖維蛋白溶酶對眼睛組織沒有可觀察到的毒性。(d)單次和重復靜脈給藥的毒理研究
以小鼠來做靜脈給藥的毒性研究，首先是用血漿的PK端點做單次給藥的測距研究。由于對眼睛的給藥劑量很小，以mg/m2為基礎，在老鼠的靜脈給藥中使用以超過人類用量100倍的高劑量，而不是使用最大耐受劑量(MTD)或者最高可行劑量(MFD)。所用的大劑量為122mg/kg(350mg/m2),這個數值是人體內預計最高劑量(3 mg/kg, 3.5 mg/m2 )的100倍以上，低劑量及中間劑量分別是10mg/kg和30 mg /kg。結論:實驗結果證明在100倍的高劑量情況下，靜脈給藥的重組微纖維蛋白溶酶對小鼠沒有明顯的溶血付作用。在中底劑量，重組微纖維蛋白溶酶對小鼠沒有可觀察到的毒性。綜上所述，經過以上動物實驗證明本發明的重組微維纖蛋白溶酶安全有效，為臨床實驗和臨床應用奠定了實驗基礎。
權利要求
1.一種重組微纖維蛋白溶酶原多肽，其特征在于具有如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
2.一種利用大腸桿菌表達系統生產權利要求1所述的重組微纖維蛋白溶酶原多肽的方法，其特征在于步驟如下: (1)將編碼重組微纖維蛋白溶酶原多肽的DNA序列插入基于質粒的大腸桿菌疋表達載體PETll中，然后傳導到大腸桿菌宿主中，并用氨芐青霉素選擇抗性克隆；所述的編碼重組微纖維蛋白溶酶原多肽的DNA序列如SEQ ID N0.1所示； (2)重組微纖維蛋白溶酶原多肽的表達、復性以及純化:①將(I)中選擇的培養攜帶表達質粒的疋coli抗性克隆在培養基中培養到A600=0.6-0.9的生長期加入IPTG誘導蛋白以包涵體形式表達，37 °C下繼續培養3-5小時；③離心收獲細菌，然后通過凍融和漂洗得到純化的包涵體；@在pH 8-10的8M尿素緩沖液中溶解包涵體； 將含有包涵體的尿素緩沖液快速稀釋到20倍的20 mM Tris, 0.2 M精氨酸，pH 9.0的緩沖液中，得復性蛋白；⑥采用分子排阻色譜法將復性蛋白完全分離出來；⑦采用離子交換和親和層析進一步純化復性蛋白，即為重組微纖維蛋白溶酶原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.重組微纖維蛋白溶酶，其特征在于:將權利要求1或2所述的重組微纖維蛋白溶酶原多肽經活化酶激活成重組微纖維蛋白溶酶，所述的活化酶是尿激酶、組織纖溶酶原激活物、鏈激酶、或普激酶。
4.權利要求3所述的重組微纖維蛋白溶酶作為有效成分在制備治療玻璃體黃斑牽引綜合癥、黃斑裂洞、視網膜脫離、視網膜撕裂、視網膜新生血管形成、視網膜出血、視網膜水腫、或者處理玻璃體后脫離不完全的手術并發癥藥物中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于:重組微纖維蛋白溶酶的用量為:每只眼睛.0.005毫克-0.2毫克。
全文摘要
本發明涉及一種重組微纖維蛋白溶酶及其制備方法和應用。重組微纖維蛋白溶酶原多肽，具有如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。本發明采用大腸桿菌生產重組μPlm，通過眼部的玻璃體腔注射μPlm可以有效解除玻璃體黃斑粘連，具有特異性強、免疫原性低、副作用小等優點。利用本發明采用大腸桿菌表達系統生產的重組μPlm，制備治療玻璃體黃斑粘連的藥物，具有表達量高，生產工藝簡便，生產成本低，和表達蛋白活性穩定，制品使用安全等特點。應用本發明可開發出經濟安全，非手術治療玻璃體黃斑粘連的藥物，以克服目前外科切除手術所面臨的費用高、手術難度大和并發癥多等問題。
文檔編號A61P7/10GK103205410SQ20121000998
公開日2013年7月17日 申請日期2012年1月13日 優先權日2012年1月13日
發明者藺新力 申請人:藺瑩瑩