專利名稱：一種高仿真組織工程神經修復材料及其制備方法
技術領域：
本發明涉及膠原、明膠及殼聚糖等多種生物原材料以及其加工エ藝和制作方法，確切講是ー種高仿真組織工程神經修復材料及其制備方法。
背景技術：
神經損傷的修復是ー個世界性難題。近年來，應用組織工程技術制備修復支架材料組裝組織工程替代物修復神經損傷成為研究的熱點，其研究重點包括(I)人工移植支架材料微觀結構的仿生性以及材料的組織相容性、細胞相容性和可降解性研究；(2)支架與細胞外基質及神經營養因子的聯合應用；(3)種子細胞的引入。其中支架作為種子細胞和神經營養因子的載體，作為組成神經損傷修復微環境的主體，其構建和性能改進研究成為制約周圍神經損傷修復的關鍵。
生物衍生材料具有良好的生物相容性，是目前比較理想的支架原料之一，主要有膠原蛋白、纖維蛋白、甲殼素、殼聚糖以及纖維素衍生物等。膠原(collagen)是機體細胞外基質(extracellular matrix, ECM )的主要結構蛋白質,在人體分布最廣，約占30%,有14種之多。而I型膠原則是各種膠原中含量最多的，它為生物細胞提供用于維持結構的支架。I型膠原由三個α鏈組成，構成直徑為67nm的三螺旋結構的原纖維，是基模的主要組成部分，具有抗壓和維持空間結構的功能，主要分布在骨角膜，肌腱等處。它是ー種良好的表面活性剤，并顯示出很好的無脂界面的穿透性、生物可降解性、弱抗原性和優越的生物相容性、易于被吸收，不產生炎癥反應，是組織工程中常用的生物材料；明膠(Gelatin)是ー種由膠原分子降解而制得的多肽混合物，共有18種氨基酸組成了明膠肽鏈，膠原廣泛存在于動物的骨、肌腱及結締組織中，可被生物酶降解。大量的實驗表明用細胞外基質制成的神經組織工程材料不僅具有良好的生物相容性，同時也具有良好的生物學活性，有利于神經細胞的粘附、增埴和再生纖維的遷延與生長。殼聚糖(Chitosan)是ー種天然的多聚糖，帶一定的量的胺基，溶于酸性介質，并帶一定正電荷。它來源廣泛，價格低廉，具有良好的生物學性能，不會引起過敏反應和排斥反應，在體內能逐步降解，具有良好的生物相容性和生物可降解性。殼聚糖具有抗菌活性、生物黏附作用、絮凝作用和抗癌活性；能夠加工成不同形式，如粉末，膜劑，糊劑，纖維等。正是由于這些性質使殼聚糖在生物醫學和藥物制劑學方面的應用弓I起越來越多的注意。神經組織再生不同于其它組織，神經再生纖維必須沿一定方向定向生長，才有可能有效地修復損傷。有研究表明，橋接修復材料內部結構的仿生程度，在很大程度上決定了神經再生細胞的生長、遷移結果，并且對再生神經纖維的伸展和神經軸突生長、連接等均有重要作用。目前，應用和研究較多的神經移植材料的內部結構主要包括大空管狀結構、空管加內容凝膠狀結構和平行縱管狀結構。這些結構雖然在一定程度上均能橋接兩神經斷端、為神經再生提供ー個相對隔絕的微環境，但材料內部沒有定向的、規律性排列的孔隙和結構，不利于神經軸突的生長，神經損傷的修復效果相對較差。理想的組織工程支架材料必須具有軸取向的微管矩陣排列的仿真特征，這樣才能使移植的種子細胞可順微管壁軸向排列、遷移，并有利于再生軸突定向生長，從而最大限度地使損傷的神經獲得有效的修復再生。但由于既往復合的橋接載體材料內部結構均無一定規律(在孔徑大小和方向上)，在體內無法保持理想的物理結構，不利于脊髓或周圍神經節段性損傷再生纖維定向生長，從而影響了治療或實驗的效果。制備具有軸取向微管矩陣排列仿真結構特征的膠原-殼聚糖橋接材料，目前世界上尚無類似報道。

發明內容
本發明的目的之ー是提供一種高仿真組織工程神經修復材料，該材料具有軸取向矩陣排列微管和微管間廣泛孔隙溝通的仿真結構，微管孔徑大小及方向可根據需要進行調控，而且具有良好生物相容性和可控生物可降解性，它既可用于神經損傷修復的基礎研究，也可用于臨床人體脊髄和周圍神經損傷或缺損的橋接修復。有利于神經再生纖維的生長，可用于脊髓、周圍神經損傷的修復。
本發明的另ー目的是提供一種高仿真組織工程神經修復材料的制備方法。為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是一種高仿真組織工程神經修復材料，其特征是該神經修復材料包括I型膠原蛋白、殼聚糖、明膠中的ー種或兩種或三種原料混合制成；所述的神經修復材料是按照下述重量份數的原料制成1型膠原蛋白1-10份，明膠I份；其制備方法按以下步驟進行
1)按上述重量份數稱取1-10份的I型膠原蛋白按放入相同重量的醋酸溶液中溶解24小時；
2)在4°C恒溫環境中，以15000r/min攪拌速度攪拌90min,制成懸池液；
3)稱取明膠I份，加入相同重量的醋酸溶液進行溶解24小時；
4)在4°C恒溫條件下，以15000r/min攪拌速度攪拌90min制成懸池液；
5)混合步驟2)、4)兩種懸濁液并保持4°C恒溫，再以15000r/min攪拌速度攪拌90min，制成膠原蛋白和明膠的懸濁液，抽真空靜置12小時；
6)將制備好的步驟5)的懸濁液注入硅膠管中密封兩端，沿管軸方向緩慢放入深低溫冷凝劑液氮中，進入速度控制為IOX 10-7m · s-Ι至10X 10-5 m · s_l ；
7)將懸濁液-硅膠管冷凍物放入預冷好的鋁盤中，于_60°C、IOOmtorr條件中凍干24小時；
8)真空狀態下升溫至(TC保持6h，再繼續升溫至22°C保持30 60min，解除真空，升至
常溫；
9)將材料用lwt%京尼平浸泡48h交聯，對雙蒸水反復透析；
10)將材料無菌密封包裝并置于20kGyC060環境中照射消毒24小吋。本發明所研制的新型脊髄、周圍神經修復橋接材料具有①材料的外表面為相對封閉結構(厚度2. 45 土I. 43 μ m) !②材料的微管孔徑大小可控制在20μπι 200μπι ;③微管的走行方向為軸向且平行、均勻；④微管間存在大量微孔相互溝通(孔徑大小20. 68 土 4.61μηι)。支架材料孔徑可控，能夠適應不同條件的不同需要大孔徑的材料對細胞的附壁爬行或灌注如嗅鞘細胞、雪旺細胞等起支架載體作用；而小孔徑的材料則適宜于復合各種神經生長因子、藥物等。軸向矩陣排列微管仿真結構，有利于定向引導再生神經細胞延展和神經纖維生長，適用于脊髓和周圍神經缺損處的橋接修復。微管間廣泛孔隙溝通，有利于細胞遷移和營養物質運輸交換，利用神經再生。所研制的材料表面相對封閉，使得在植入脊髄或周圍神經缺損處能防止增生結締組織纖維長入缺損段，避免阻礙神經再生軸突的定向生長。本發明的材料具有同一條件下材料的內部孔徑大小均勻、微管軸向平行排列高度仿真、鄰近微管孔隙廣泛溝通等結構優點，在神經修復組織工程中，將更有利于脊髓和周圍神經再生纖維沿軸向微管定向生長和遷移，有望獲得脊髄和周圍神經的有效修復、再生，在臨床和實驗中，應用前景廣闊，作用巨大。本發明提出的高仿真組織工程神經損傷修復材料具有以下特點
1.采用了生物相容性更好的原料，更接近生物的體內環境，更加有利于神經的再生。其中I型膠原蛋白(collagen I)是細胞外基質的主要組分，有利于細胞的粘附、遷移和増殖，可促進神經的再生，明膠(gelatin)則是組織工程修復最常用的原料，是神經營養因子最理想的載體；
2.探明了I型膠原蛋白(collagen I)、殼聚糖(chitosan)、明膠(gelatin)等生物材 料的最佳混合比例及對材料在生物學性質及力學性質等方面的影響；
3.探明了溫度、速度及添加劑(醋酸)濃度與新型神經組織工程修復材料內部結構間關
系;
4.探明了各種成分不同比例混合對材料內部結構的影響；
5.探明了組分之間交聯、固化的最佳條件増加了材料的抗拉強度和剛度，更好的改善了材料的力學性質；
6.通過控制材料的成分構成比率和交聯參數，有效的降低了材料在體內的分解速度。本發明的高仿真組織工程神經損傷修復材料是ー種新型脊髄、周圍神經修復橋接材料，既可直接植入脊髄、周圍神經缺損處；也可作為神經組織工程各種子細胞移植的載體，可復合、攜帯各種促進神經再生的藥物，用于人體脊髄、周圍神經節段性損傷、缺損后的橋接；同樣可用于脊髓、周圍神經節段損傷修復的基礎研究。


圖I是掃描電鏡下軸向切面觀察的圖片，其材料內部為走向平行、孔徑均一、排列規律的仿真軸向微管(標尺=200 Mm)；
圖2是掃描電鏡下軸向切面觀察的圖片，顯示材料內部軸向矩陣排列的微管間有廣泛的微孔結構相互溝通(標尺=50 Mm)；
圖3是橫切面電鏡下的圖片，顯示材料外部相對封閉結構(標尺=200 Mm)；
圖4是橫切面電鏡下的圖片，顯示材料內部微孔內徑較為均一(標尺=200 Mm)。
具體實施例方式以下結合制作エ藝及實施實例對本發明做進ー步詳細說明。需要說明的是本實施例僅用于說明本發明，并不限制本發明的實施范圍。依照本發明的技術方案，該高仿真組織工程神經損傷修復材料用膠原及殼聚糖混合制成，材料采用I型膠原蛋白(collagen I)、殼聚糖(chitosan)、明膠(gelatin)。其配方比例為(280:28:28) " (280:280:280)
上述材料在低溫溫度梯度環境中，調整原料混合物的冷淋速度及添加劑(醋酸)濃度變化和溫度梯度遞減速率，是決定材料內部微孔結構孔徑大小、微孔取向的關鍵因素，改變注有膠原ー殼聚糖混合物硅膠管進入冷淋劑的速度可以達到對所需制備的材料在內部結構上孔徑大小和孔隙方向及均勻程度均具有可調控性，從而得到高仿真脊髄、周圍神經組織工程損傷修復材料。實施例I (按照I型膠原蛋白殼聚糖明膠的比例為280 70 70)
按照本發明的技術方案，以膠原蛋白、明膠和殼聚糖為例，其制作方法按以下步驟進
行
1).按重量份數稱取上述比例的I型膠原蛋白，按28mg/ml的濃度放入3mg/ml醋酸溶液中溶解24小時；
2).在4°C恒溫環境中，15000r/min攪拌90min,制成懸池液；
3).另按比率稱取上述重量比例的殼聚糖、明膠加入3mg/ml醋酸溶液中溶解24小時；
4).在4°C恒溫,15000r/min攪拌90min制成懸池液；
5).混合兩種懸池液保持4°C恒溫，15000r/min攪拌90min,制成膠原蛋白和殼聚糖的懸濁液，抽真空靜置12小吋；
6).將制備好的橋接材料懸池液注入內徑為2mm、外徑為3mm、長5cm至20cm的娃膠管中密封兩端，沿管軸方向緩慢放入深低溫冷淋劑中，進入速度控制為10X10_7m· s—1至10Xl(T5m · sベ；
7).將懸濁液-硅膠管冷凍物放入預冷好的鋁盤中，于_60°C、IOOmtorr條件中凍干
24h ；
8).真空狀態下升溫至0°C保持6h，再繼續升溫至22°C保持30 60min，解除真空，升
至常溫；
9).將材料用Iwt%京尼平浸泡48h交聯，對雙蒸水反復透析；
10).將材料無菌密封包裝并置于20kGyCO6tl環境中照射消毒24小吋。本發明所研制出的橋接材料具有以下特點①材料的外表面為相對封閉結構，可有效的阻止疤痕組織長入(圖3);②材料的微孔直徑可人為簡單調控，既有利于神經再生纖維的長入，又有利于神經因子和種子細胞的植入；③內部微管尺寸均勻，呈軸向矩陣排列，與正常神經基底膜結構高度仿真，有利于神經再生纖維的定向生長(圖I、圖4);④微管間廣泛孔隙溝通，有利于細胞遷移和營養物質運輸交換，利用神經再生(圖2);⑤動物實驗證明該材料生物相容性好且降解速度可控有利于神經再生；⑥該材料經特殊エ藝處理后，力學性質好，抗拉及抗變形能力好。以下實例2 8各原材料的混合比相同。實施例2:采用膠原(I型)、殼聚糖和明膠作為原材料，其重量分別為280 mg、280mg、280 mg,實施過程同實例I。實施例3:采用膠原(I型)、殼聚糖和明膠作為原材料，其重量分別為280 mg,28mg、28 mg,實施過程同實例I。實施例4 :采用膠原(I型)和殼聚糖作為原材料，其重量分別為280mg、280mg，實施過程同實例I。實施例5 :采用膠原(I型)和殼聚糖作為原材料，其重量分別為280mg、28mg，實施過程同實例I。
實施例6 :采用膠原(I型)和殼聚糖作為原材料，其重量分別為280mg、70mg，實施過程同實例I。實施例7 :采用膠原(I型)和明膠作為原材料，其重量分別為280mg、280mg，實施過程同實例I。實施例8 :采用膠原(I型)和明膠作為原材料，其重量分別為280mg、28mg，實施過程同實例I。實施例9 :采用膠原(I型)和明膠作為原材料，其重量分別為280mg、70mg，實施過程同實例I。實施例10 :采用殼聚糖和明膠作為原材料，其重量分別為70mg、70mg，實施過程同實例I ;其制備步驟省略了步驟1)、2)。實施例11 :采用膠原(I型)作為原材料，其重量為280mg，實施過程同實例I ;其 制備步驟省略了步驟3)、4)、5)。實施例12 :采用膠原(I型)作為原材料，其重量為28mg，實施過程同實例I ;其制備步驟省略了步驟3)、4)、5)。實施例13 :采用膠原(I型)作為原材料，其重量為70mg，實施過程同實例I ;其制備步驟省略了步驟3)、4)、5)。實施例14 :采用殼聚糖作為原材料，其重量為70mg，實施過程同實例I ;其制備步驟省略了步驟1)、2)。實施例15 :采用明膠作為原材料，其重量為70mg，實施過程同實例I ;其制備步驟省略了步驟1)、2)。本發明所研制的新型高仿真神經組織工程修復材料具有可簡易調控的內徑大小在2(Γ200 μ m之間的各種尺寸的孔徑和平行、均勻的單一軸取向的縱軸向微管以及廣泛溝通的管間微孔結構。該材料還可方便的制成不同的外型，如圓柱型，橢圓柱型等。在生物組織工程材料的應用中，較大孔徑的對細胞附壁爬行或灌注如嗅鞘細胞、雪旺細胞等起支架、載體作用；而較小孔徑的則適宜于復合各種神經生長因子、藥物等，作為其緩釋的載體，用于脊髓或周圍神經組織缺損處的橋接。本發明所研制的材料無論內部軸向矩陣排列的微管結構，還是表面相對封閉結構，均接近于正常的神經組織結構，使得植入脊髄或周圍神經組織缺損處，既能防止增生結締組織長入缺損部位造成神經再生阻礙，又能有效物理引導再生神經纖維的定向生長，同時支持再生神經組織營養物質交換和代謝。廣泛用于人體周圍神經或脊髓節段性損傷的臨床治療和動物周圍神經或脊髓節段性損傷的實驗研究中。
權利要求
1. 一種高仿真組織工程神經修復材料，其特征是該神經修復材料包括I型膠原蛋白、殼聚糖、明膠中的ー種或兩種或三種原料混合制成；所述的神經修復材料是按照下述重量份數的原料制成1型膠原蛋白1-10份，明膠I份；其制備方法按以下步驟進行 1)按上述重量份數稱取1-10份的I型膠原蛋白按放入相同重量的醋酸溶液中溶解24小時； 2)在4°C恒溫環境中，以15000r/min攪拌速度攪拌90min,制成懸池液； 3)稱取明膠I份，加入相同重量的醋酸溶液進行溶解24小時； 4)在4°C恒溫條件下，以15000r/min攪拌速度攪拌90min制成懸池液； 5)混合步驟2)、4)兩種懸濁液并保持4°C恒溫，再以15000r/min攪拌速度攪拌90min，制成膠原蛋白和明膠的懸濁液，抽真空靜置12小時； 6)將制備好的步驟5)的懸濁液注入硅膠管中密封兩端，沿管軸方向緩慢放入深低溫冷凝劑液氮中，進入速度控制為IOX 10-7m · s-1至10X 10-5 m · s_l ； 7)將懸濁液-硅膠管冷凍物放入預冷好的鋁盤中，于_60°C、IOOmtorr條件中凍干24小時； 8)真空狀態下升溫至(TC保持6h，再繼續升溫至22°C保持30 60min，解除真空，升至常溫； 9)將材料用lwt%京尼平浸泡48h交聯，對雙蒸水反復透析； 10)將材料無菌密封包裝并置于20kGyC060環境中照射消毒24小時。
全文摘要
本發明涉及一種高仿真組織工程神經修復材料及其制備方法，其特征是該材料包括I型膠原蛋白、殼聚糖、明膠中的一種或兩種或三種原料混合制成。該材料是按照下述重量份數的原料制成I型膠原蛋白1-10份，明膠1份。它既可用于神經損傷修復的基礎研究，也可用于臨床人體脊髓和周圍神經損傷或缺損的橋接修復。有利于神經再生纖維的生長，可用于脊髓、周圍神經損傷的修復。
文檔編號A61L27/24GK102671237SQ20121018800
公開日2012年9月19日 申請日期2009年1月16日 優先權日2009年1月16日
發明者羅卓荊, 胡學昱, 黃景輝 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學