專利名稱：組織原位高表達ilk蛋白載體的制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥領域，具體而言涉及外源性基因的組織原位表達，及利用外源基因的表達起到治療慢性心力衰竭疾病的作用，特別涉及組織原位高表達ILK蛋白載體的制備方法及其應用。
背景技術：
慢性心力衰竭主要以心肌細胞丟失，殘留心肌細胞的功能惡化、心肌肥厚與血管新生的不協調為特征。而治療慢性心力衰竭疾病一直是現在醫療中一個比較棘手的問題，它的治療主要涉及到緩解癥狀、抑制心臟重構、改善長期預后等方面。然而目前我國有癥狀心衰病人的生存率很低，預后比大多數進展期惡性腫瘤還差，隨著人口老齡化進程的加快和聞血壓、冠心病等常見心血管病發病率的上升,其患病率仍在不斷上升。整合素連接激酶(ILK)是一有功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它能自我磷酸化， 并磷酸化許多外源底物，如髓鞘堿性蛋白、整合素β I胞漿區、蛋白激酶B(PKB/Akt)和糖原合成酶激酶3 β (GSK-3 β )。心臟中的ILK主要集中在肋狀體(costamere)和Z板。肋狀體是心肌肌纖維膜和心臟橫紋肌Z板相連的區域，它由細胞骨架蛋白和信號激酶的復雜蛋白網絡組成，可以連接胞內收縮裝置和胞外環境，感受機械牽拉刺激并轉導下游信號。研究表明，ILK通過N末端錨蛋白重復序列與PINCH蛋白結合，通過激酶區與β整合素胞漿區以及parvin蛋白結合,從而形成ILK-PINCH-parvin復合體,這一復合體是粘著斑復合體(FAK)的關鍵成分，在心臟機械感應、機械傳導和維持心臟功能方面起著極為重要的作用。在脊椎動物的研究中，Bendig等發現斑馬魚的ILK基因純合錯義突變將導致心臟收縮能力的進行性降低和牽拉一應答基因ANF、VEGF的嚴重下調，引起斑馬魚在胚胎期即發生心衰。在哺乳動物中，White等證實小鼠ILK對正常心功能是必需的ILK缺失的純合子小鼠死于圍著床期；特異性消除心臟ILK基因將導致小鼠在出生后數周內發生自發性擴張型心肌病，左心室普遍擴大伴纖維化。因此，作為ILK-PINCH-parvin復合體的樞紐，ILK在維持心臟結構和功能方面起著舉足輕重的作用。在本發明之前，治療慢性心力衰竭疾病的藥物主要包括有利尿劑、洋地黃等緩解癥狀的藥物以及β受體阻滯劑、ACE抑制劑、醛固酮拮抗劑等改善預后類藥物；近些年，植入CRT進行心臟再同步化治療也在一小部分心力衰竭患者中開始運用。目前，藥物治療療效有限，很多患者盡管給予了最佳的藥物治療，仍然不可避免地進展到終末期心力衰竭；而CRT治療極為昂貴，且只對左右心室收縮不同步的患者有效，對大部分心室收縮同步的心力衰竭患者無效。綜上所述，盡管已有多類藥物被應用來治療慢性心力衰竭，但總體治療效果仍然有限，因此，心衰治療領域迫切需要開發出新的治療藥物和方法。

發明內容
本發明的一個目的就在于克服上述缺陷，提供一種組織原位高表達ILK蛋白載體。本發明的技術方案是組織原位高表達ILK蛋白載體，其主要技術特征在于所述表達載體包含編碼人類ILK蛋白的基因。其中所述的編碼人類ILK蛋白的基因在人類染色體上具體位置為位于Chromosome 11 ;NC_000011. 9，該基因具體的核苷酸序列在人類基因組數據庫(NCBI和Ensebl genomic)中其基因名稱為ILK，該基因在NCBI基因庫中的ID號為3611 ;在Ensebl 基因庫中的 ID 號為ENSG00000166333。其中NCBI基因庫ID號為3611的基因序列在本發明中以SEQ ID No. I表不；Ensebl基因庫中ID號為ENSG00000166333的基因序列在本發明中以SEQ IDNo. 2表示。該兩段基因序列均能表達人類ILK蛋白(含452個氨基酸)，所表達的ILK蛋白其結構和功 能均無差別。本發明的另一技術方案是組織原位高表達ILK蛋白載體的應用，其主要技術特征在于組織原位高表達ILK蛋白載體采用血管內注射制劑、皮下注射制劑以及病灶器官局部組織注射制劑。其中所述的生物病毒(virus)載體系統選自腺病毒、腺相關病毒以及慢病毒載體系統，優選腺病毒載體系統。上述病毒載體系統均可通過商業購買獲得。例如本發明中優選的腺病毒載體系統可以選用求必精生物化學公司(Qbiogene. inc)的AdEasy 。本發明還有一技術方案是組織原位高表達ILK蛋白載體制備方法，其主要技術步驟在于(I)通過人cDNA文庫擴增野生型ILK cDNA,并在ILK cDNA上下游引物分別引入ScaI和XhoI位點以亞克隆至pShuttle，形成穿梭質粒pShuttle-ILK，PCR產物經DNA測序確認；(2)挑選I. Og陽性重組質粒pShuttle-ILK，經Pme I線性化后轉化入含pAdEasy-Ι高效感受態大腸桿菌BJ5183，在含卡那霉素LB瓊脂培養基中37°C孵育過夜；(3)經同源重組，BJ5183內產生重組的AdEasy質粒；(4)同源重組質粒pAd-ILK確認挑選部分克隆置于3_5ml含卡那霉素的LB培養基中37°C，225-250rpm振蕩培養過夜，小量提取pAd-ILK。pAd-ILK的鑒定采用Pac I酶切法，pAd-ILK經Pac I酶切后0. 8%瓊脂糖-TAE膠電泳；(5)將7X106HEK293A細胞鋪于IOOmm培養皿，轉染時細胞匯合率達80% ；(6)先用OptiMEM培養基沖洗一次細胞，每個培養皿內加入5ml OptiMEM培養基；(7)取15 μ g重組質粒pAd-ILK，經Pac I酶切線性化后轉染入HEK293A細胞，轉染試劑米用 Lipofectamine2000 (Invitrogen 公司);(8)通過觀察轉染細胞的細胞病理效應了解感染進程，在轉染7-10天后收集細胞，經干冰反復凍融3次獲得Ad-ILK病毒保存液；(9)空載腺病毒Ad-null用相似方法，通過空載穿梭質粒pShuttle_CMV與pAdeasy-Ι重組制備,得組織原位高表達ILK蛋白載體。本發明的再一個目的是提供了一種攜帶編碼人類ILK的基因序列的質粒載體系統以及該質粒載體系統在制備治療心血管疾病藥物中的應用。所述的質粒(plasmid)載體系統選自PBR322、PUC、PGEM或Minicycle系列，其中優選minicycle ;上述質粒系統均可通過商業購買獲得。例如本發明中優選的Minicycle系列質粒可以購自系統生物科學公司(System Biosciences, Inc)。本發明還提供了一種攜帶編碼人類ILK的基因序列的生物病毒載體系統的制備方法。具體而言該方法包括如下步驟I、通過人類基因組數據庫(Ensebl genomic和NCBI)查找ILK基因所在位置(Chromosome 11 ;NC_000011. 9)，基因名稱為ILK，該基因在NCBI基因庫中的ID號為3611 ;在 Ensebl 基因庫中的 ID 號為:ENSG00000166333。2、利用人源性的基因文庫克隆出ILK基因的mRNA片段，并經測序鑒定。3、通過本領域熟知的三載體方法制備病毒顆粒。4、經鑒定病毒重組成功后再經擴增和純化最后得到帶有ILK基因的重組病毒載 體系統。本發明所記載的心血管疾病是指各種原因引起的慢性心力衰竭。本發明的優點和效果在于藥物在病灶組織內特異性轉染，轉染效率高，同時對感染的細胞毒性極小，操作較簡單，并發癥少等。本發明的其他具體優點和效果將在下面繼續說明。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例I :攜帶ILK基因的腺病毒轉染體系的制備通過人cDNA文庫擴增野生型ILK cDNA,并在ILK cDNA上下游引物分別引入ScaI和XhoI位點以亞克隆至pShuttle，形成穿梭質粒pShuttle-ILK，PCR產物經DNA測序確認(上海英駿生物技術有限公司)。挑選I. Og陽性重組質粒pShuttle-ILK,經PmeI線性化后轉化入含pAdEasy-Ι高效感受態大腸桿菌BJ5183，在含卡那霉素LB瓊脂培養基中37°C孵育過夜。經同源重組,BJ5183內產生重組的AdEasy質粒(pAd-ILK)。為確認是同源重組質粒pAd-ILK，挑選部分克隆置于3-5ml含卡那霉素的LB培養基中37°C，225_250rpm振蕩培養過夜。小量提取pAd-ILK。pAd-ILK的鑒定采用PacI酶切法，pAd-ILK經PacI酶切后0.8%瓊脂糖-TAE膠電泳。將大約7X106HEK293A細胞鋪于IOOmm培養皿，轉染時細胞匯合率達80 %。先用OptiMEM培養基沖洗一次細胞，每個培養皿內加入5ml OptiMEM培養基。取15 μ g重組質粒pAd-ILK，經PacI酶切線性化后轉染入HEK293A細胞，轉染試劑采用Lipofectamine2000 (Invitrogen公司)。通過觀察轉染細胞的細胞病理效應了解感染進程。轉染7-10天后收集細胞，經干冰反復凍融3次獲得Ad-ILK病毒保存液。空載腺病毒Ad-null用相似方法,通過空載穿梭質粒pShuttle-CMV與pAdeasy-Ι重組制備。為了鑒定ILK重組腺病毒是否能表達ILK蛋白，取少量Ad-ILK或Ad-null腺病毒保存液轉染293細胞，48小時后采用細胞裂解液裂解細胞、提取細胞蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，Western blot法檢測ILK蛋白表達情況。將4xT-75培養瓶的ΗΕΚ293Α細胞培養至單層90-100 %匯合率，加入足夠的Ad-ILK或Ad-null感染細胞，48小時內細胞呈現CPE。當CPE幾近完成時，收集感染的細胞，經3次反復凍融使病毒釋放入上清液中。收集上清，經ViraBind腺病毒純化試劑盒提純Ad-ILK或Ad-null。純化后腺病毒滴度的測算采用0D260法。0D260法即測定病毒顆粒在260nm處的吸光度，通過DNA量來表示病毒滴度，I個OD值相當于I. I X IO12個病毒顆粒。實施例2:動物實驗50只SD大鼠經腹腔注射阿霉素導致心力衰竭后，分別開胸心肌內注射含有ILK基因的腺病毒或空載腺病毒。在25只注射含有ILK基因的腺病毒的大鼠中，有10只在4周內發生死亡，而25只注射含有空載腺病毒的大鼠，有16只發生死亡。四周后，通過超聲心動圖我們發現，通過超聲心動圖我們發現，治療組大鼠的心臟射血分數(EF)、左室短軸縮短率 (FS)均顯著優于未治療大鼠，左室收縮、舒張末期內徑明顯小于未治療組，提示左室重構得到明顯改善。同時我們檢測了左室dp/dt、左室舒張末期壓力以及血清BNP，均發現治療組大鼠顯著優于未治療組大鼠(表I)。進一步的病理學檢查發現ILK腺病毒轉染組心臟膠原沉積較對照組明顯減少；Tunel凋亡檢測提示ILK治療組心臟中凋亡的心肌細胞明顯減少；使用Ki_67和H3P染色，可以檢測到心梗周圍區增殖的心肌細胞顯著增多(表2);透射電鏡觀察發現ILK治療組中發生自噬的心肌細胞亦明顯減少；同時我們觀察到ILK治療組心肌中⑶45陽性細胞明顯減少，提示高表達ILK可以抑制炎癥細胞向局部組織浸潤。另外，我們對ILK腺病毒治療組大鼠的心、肝、腎、肺、肌肉等組織進行了病理學檢測，未發現特異性的損傷及腫瘤形成；孕鼠進行ILK腺病毒治療后，對其子鼠進行檢測，亦未發現畸形存在，進一步證明了我們的治療是安全的、無毒的。
權利要求
1.組織原位高表達ILK蛋白載體，其特征在于所述表達載體包含編碼人類ILK蛋白的基因。
2.根據權利要求I所述的組織原位高表達ILK蛋白載體，其特征在于所述編碼人類ILK蛋白的基因序列具有SEQ ID No. I所示的核苷酸序列。
3.根據權利要求I所述的組織原位高表達ILK蛋白載體，其特征在于所述編碼人類ILK蛋白的基因序列具有SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。
4.根據權利要求I所述的組織原位高表達ILK蛋白載體的應用，其特征在于組織原位高表達ILK蛋白載體采用血管內注射制劑、皮下注射制劑以及病灶器官局部組織注射制劑。
5.根據權利要求4所述的組織原位高表達ILK蛋白載體的應用，其特征在于血管注射的制劑最優選是冠狀動脈注射制劑。
6.根據權利要求I所述的組織原位高表達ILK蛋白載體，其特征在于作為治療心力衰竭的藥物的應用。
7.根據權利要求I所述的組織原位高表達ILK蛋白載體制備方法，其步驟在于 (1)通過人cDNA文庫擴增野生型ILKcDNA,并在ILK cDNA上下游引物分別引入ScaI和XhoI位點以亞克隆至pShuttle，形成穿梭質粒pShuttle_ILK，PCR產物經DNA測序確認； (2)挑選LOg陽性重組質粒pShuttle-ILK,經PmeI線性化后轉化入含pAdEasy-Ι高效感受態大腸桿菌BJ5183，在含卡那霉素LB瓊脂培養基中37°C孵育過夜； (3)經同源重組，BJ5183內產生重組的AdEasy質粒； (4)同源重組質粒pAd-ILK確認挑選部分克隆置于3-5ml含卡那霉素的LB培養基中37°C，225-250rpm振蕩培養過夜，小量提取pAd-ILK。pAd-ILK的鑒定采用PacI酶切法，PAd-ILK經PacI酶切后O. 8%瓊脂糖-TAE膠電泳； (5)將7X106HEK293A細胞鋪于IOOmm培養皿，轉染時細胞匯合率達80%； (6)先用OptiMEM培養基沖洗一次細胞，每個培養皿內加入5mlOptiMEM培養基； (7)取15μ g重組質粒pAd-ILK，經PacI酶切線性化后轉染入HEK293A細胞，轉染試劑米用 Lipofectamine2000 (Invitrogen 公司)； (8)通過觀察轉染細胞的細胞病理效應了解感染進程，在轉染7-10天后收集細胞，經干冰反復凍融3次獲得Ad-ILK病毒保存液； (9)空載腺病毒Ad-null用相似方法,通過空載穿梭質粒pShuttle_CMV與pAdeasy-1重組制備，得組織原位高表達ILK蛋白載體。
全文摘要
本發明涉及組織原位高表達ILK蛋白載體的制備方法及其應用。本發明技術方案是表達載體包含編碼人類ILK蛋白的基因，涉及具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。本發明解決了治療慢性心力衰竭疾病的藥物仍然不可避免地進展到終末期心力衰竭，CRT治療極為昂貴，且只對左右心室收縮不同步的患者有效等缺陷。本發明的藥物在病灶組織內特異性轉染，轉染效率高，同時對感染的細胞毒性極小，操作較簡單，并發癥少等；ILK治療組心肌中CD45陽性細胞明顯減少，提示高表達ILK可以抑制炎癥細胞向局部組織浸潤；未發現特異性的損傷及腫瘤形成，亦未發現畸形存在，且無毒的。
文檔編號A61K48/00GK102876696SQ20121034894
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月14日 優先權日2012年5月7日
發明者徐標, 白劍, 謝峻 申請人:南京大學醫學院附屬鼓樓醫院