專利名稱：新的抑癌基因unc5d及其編碼蛋白的新應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一個新的潛在抑癌基因及其編碼蛋白的新應用，具體地說，本發明涉及UNCro作為一個新的潛在抑癌基因及其編碼蛋白的應用。
背景技術：
UNC5D屬于UNC5受體家族成員。UNC5受體家族在1997年被報到是神經生長因子netrin-1的受體，該家族中除UNCOT外，其它成員還包括UNC5A、UNC5B、UNC5C。而UNCOT在UNC5家族中是發現最晚的。Netrin-1及其受體最初是被發現在神經經系統發育中起重要作用，因其能夠調控神經纖維的定向遷移。近年來，Netrin-1及其受體在腫瘤發生中的作用越來越受到重視。Netrin-1及UNC5家族中的UNC5A、UNC5B和UNC5C在腫瘤發生發展中的作用都相繼有了報道。目前關于UNCro基因的腫瘤生物學功能仍未有任何報道。

發明內容
本發明的一個目的在于研究UNCro在腫瘤特別是腎癌中的表達特點和其表達調控的機制、研究UNCro的新功能并提供UNCro的新應用。在本發明中，所述UNCro包括UNCro基因或UNCro蛋白等。所述UNCOT蛋白為如SEQ ID N0.2所 示氨基酸序列組成的蛋白，或在SEQ ID N0.2所示氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且與SEQ ID N0.2所示氨基酸序列組成的蛋白具有相同功能的衍生蛋白。所述UNCro基因為編碼本發明的UNCro蛋白的多核苷酸序列，優選為編碼SEQID NO:2所示氨基酸序列的多核苷酸序列，或者除了上述氨基酸序列的編碼序列之外，還可以包括非編碼序列，例如內含子、編碼序列5'或3'端的非編碼序列等。其中優選的UNCro基因為SEQ ID N0.1所示的多核苷酸序列，其為在GenBank的登記號為匪080872.2的基因。或者，更優選的UNCro基因為一種分離的核苷酸序列，其只包含編碼UNCro蛋白序列，例如SEQ ID N0.1所示的編碼序列:第329 3190位核苷酸序列。本領域普通技術人員已知，本發明的UNCro基因的核苷酸序列可以完全相同于如SEQ ID NO:1所示的編碼序列，也可以由于遺傳密碼的簡并性，不完全等同于上述核苷酸的編碼序列。本發明研究了 UNCro在人類多種正常組織中的表達情況，及在多種組織來源的腫瘤細胞系、配對的腎癌和癌旁組織中的表達特點，發現UNCro在多種組織來源的腫瘤細胞系中表達下調或缺失，其在腎癌組織中的表達明顯低于癌旁組織。本發明還進一步通過免疫組化實驗，證實UNCro蛋白在腎癌組織中表達下調。本發明通過分析臨床信息資料，發現UNCro在腎癌組織中的表達下調程度與腎癌的Fuhrman分級呈相關性。本發明進一步揭示了 UNCro表達下調的機制，發現染色體上的雜合性缺失(LOH)及UNCro基因啟動子區CpG島的甲基化是導致UNCro在多種腫瘤細胞系及腎癌組織中表達下調的重要機制。本發明通過實驗證實:在UNCro表達下調或缺失的腎癌細胞系(786-0及A498)中恢復UNCro的表達，可抑制腫瘤細胞增殖、細胞遷移和腫瘤細胞的克隆形成率。通過分析腎癌細胞系786-0表達UNCro前后細胞周期的變化，發現UNCro抑制細胞增殖是通過減緩G2/M的釋放實現的。本發明通過在人胚腎細胞(HEK293T)中過表達UNCOT發現，UNC5D可以誘導HEK293T的凋亡，通過western blot證實UNCro所誘導的凋亡是caspase依賴的。根據以上結果，可認為UNCro是一個抑癌基因，并可作為癌癥的臨床診斷和/或預后判斷的輔助指標，而且UNCro基因或UNCro蛋白在治療和/或抑制腫瘤中具有重要應用價值。根據本發明的實驗研究發現，本發明提供了 UNCro基因或其編碼的蛋白(UNCOT蛋白)在制備治療癌癥的藥物中的應用?？蓪⒈景l明的UNCro序列利用任何已知的轉導、轉化或轉染的方法施用于患病個體的腫瘤部位，在UNCro表達下調或缺失的腫瘤細胞系及癌組織中恢復UNCro的表達，通過抑制細胞周期進程從而抑制細胞生長，抑制腫瘤細胞增殖、細胞遷移或腫瘤細胞的克隆形成率，可以用于治療癌癥。根據本發明的實驗研究發現，本發明還提供了檢測UNCro基因或其編碼的蛋白的試劑在制備用于癌癥的輔助診斷和/或預后判斷的組合物中的應用?？蓪⑺龅腢NCro作為癌癥診斷和/或預后判斷的一個新指標，通過檢測樣品中UNCro的表達或表達水平，從而為癌癥的輔助診斷和/或預后判斷提供新的依據?？梢岳帽绢I域已知的任何方法檢測本發明的UNCro在核酸水平的表達，也可在蛋白質水平檢測本發明UNCro的表達水平。所述檢測UNCro基因或其編碼的蛋白的試劑包括:用于在PCR中合成UNCro基因DNA鏈和/或其cDNA鏈的PCR引物、或抗UNCro蛋白的抗體等。本發明的UNCro基因或UNCro蛋白均可以通過常規方法獲得。例如，UNC5D基因的多核苷酸序列可以依據標準的PCR擴增技術將cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，并選取合適的寡核苷酸引物擴增得到。這樣得到的核苷酸可以克隆進合適的載體中，并用DNA分析技術進行序列描述。也可以通過標準DNA合成技術得到。本發明的UNCro蛋白可用各種已知的方法通過轉化宿主細胞并在被轉化的宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用適當的方法誘導啟動子，然后繼續培養，培養完成后，回收和純化本發明的UNCro蛋白。本發明中，作為重組UNCro蛋白，可帶有或未帶有標簽。本發明的檢測UNCro基因或UNCro蛋白的試劑也可通過本領域普通技術人員已知的各種方法來制備。具體而言,所述癌癥為腎癌。本發明還提供了 UNCro基因或其編碼的蛋白在抑制腫瘤細胞的生長和/或增殖、抑制腫瘤細胞的克隆形成、和/或腫瘤細胞遷移中的應用。本發明通過實驗證實，UNCro基因或其編碼的蛋白能夠抑制腫瘤細胞的生長和增殖、抑制腫瘤細胞的克隆形成并能抑制腫瘤細胞遷移。具體而言，所述腫瘤細胞為腎癌細胞。在本發明的一個具體實施方案中，所述細胞遷移為纖粘連蛋白誘導的腎癌細胞的遷移。根據本發明的具體實施方案，本發明所述的UNCro在具體應用時，可以是包含于載體中。所述載體可以為真核表達載體或病毒，優選為腺病毒。例如，在本發明的一個具體實施方案中，是通過腺病毒Ad-UNCOT而明顯抑制腫瘤細胞的增殖或遷移。另一方面，本發明還提供了一種用于治療癌癥、抑制腫瘤細胞的生長、抑制腫瘤細胞的遷移、抑制腫瘤細胞的成瘤性、 和/或誘導細胞凋亡的藥物組合物，該藥物組合物含有:UNC5D基因和/或其編碼的蛋白，以及一種或多種藥用賦形劑或藥用載體。具體地，本領域的技術人員可根據其所掌握的現有技術知識選用適當的藥用賦形劑或藥用載體，例如可以包括生理鹽水、等滲葡萄糖溶液、緩沖鹽水、甘油、乙醇及上述溶液的組合等。所述藥物組合物可以采用適當的制劑形式并通過適當的給藥途徑來施用，這些對于本領域的技術人員而言在其知識范圍內無需創造性勞動就可確定最佳的方式。根據本發明的具體實施方案，所述癌癥為腎癌，所述腫瘤細胞為腎癌細胞。另一方面，本發明還提供了一種用于癌癥特別是腎癌診斷和/或預后判斷的試劑盒，所述試劑盒含有用于檢測UNCro基因或其編碼的蛋白的試劑，例如:用于在PCR中合成UNC5D基因DNA鏈和/或其cDNA鏈的PCR引物，或抗UNCOT蛋白的抗體等。綜上所述，本發明研究發現UNCro是一種新的潛在抑癌基因，特別是在腎癌的發生、發展過程中具有重要作用。


圖1A顯示PCR檢測UNCro在人的16種正常組織的表達情況，從圖中可見，UNC5D在人的腦、腎、前列腺、睪丸、小腸及結腸組織中均檢測到了較強的表達。圖1B顯示PCR檢測UNCro在多種組織來源的腫瘤細胞系中的表達情況，從圖中可見，UNCro的表達在多種組織來源的腫瘤細胞系中普遍呈下調趨勢。UNCro在非惡性的人胚腎細胞系J1EK293中有很強的表達。圖1C顯示本發明通過在線軟件預測到UNCro基因啟動子區的存在CpG島，本發明設計的MSP弓丨物及BGS引物的位置已在圖中標出。圖1D (左圖片)顯示通過MS-PCR檢測的13種細胞系中UNCro啟動子區CpG島的甲基化情況，UNCro啟動子區的CpG島在多數腫瘤細胞系中呈甲基化狀態，人胚腎細胞系HEK293則呈非甲基化狀態；圖1D (右圖片)顯示通過甲基化測序技術進一步證實在MS-PCR檢測陽性的幾種細胞系中UNCro啟動子區的CpG島確實呈甲基化狀態，而HEK293細胞確實呈非甲基化狀態。圖1E顯示用去甲基化藥物5-aza處理UNCOT低表達或表達陰性的786-0、Hela,SW480、SW620及A549五種細胞系，然后檢測UNCOT的表達情況，可見在用5_aza處理一定時間后，UNC5D的表達均上調。通過甲基化測序進一步證實UNCro啟動子區的CpG島已被
去甲基化。圖2A是Basic-PCR分析中的凝膠電泳照片，通過針對UNCOT特異性引物，對腎癌以及癌旁組織cDNA進行檢測，說明UNCro mRNA在配對的腎癌組織中表達下調。GAPDH為系統內參。圖2B顯示實時定量PCR分析結果，通過對UNCro與GAPDH的檢測值之比進行比較，說明UNCro mRNA在配對的腎癌組織中表達下調。圖2C是免疫組化分析中的組織染色照片，用UNCro的抗體分別對腎癌以及癌旁組織進行染色，進一步證明UNCro蛋白在配對的腎癌組織中表達下調。箭頭所指的就是UNCro陽性區，本發明發現在正常以及癌旁組織中，UNCro主要分別于腎小管胞質中。圖2D顯示UNCro在癌旁組織與配對癌組織中的表達比例(N/T ratio)與相應腫瘤組織的臨床Fuhrman分級之間的統計分析結果?？梢钥闯觯S著Fuhrman分級的增高,N/T ratio呈下調趨勢。圖2E顯示檢測的腎癌組織與配對癌旁組織中UNCro啟動子區CpG島的甲基化水平，與上述表達譜及細胞系中的甲基化情況一致，腎癌組織中UNCro啟動子區CpG島普遍呈高度甲基化狀態，而相應的癌旁組織則呈非甲基化或低度甲基化狀態。圖2F顯示甲基化測序分析結果，進一步證實圖2E中顯示的結果。圖2G顯示對腎癌與配對癌旁組織進行的染色體雜合性缺失(LOH)檢測的結果，如圖，本發明在所選擇的分別位于UNCro編碼區上游、中游及下游的三個微衛星微點D8S1083、D8S505及D8S1750中均檢測到了缺失的情況，圖2G是三個位點發生LOH的圖例。圖2H是本發明對44份配對腎癌與癌旁組織進行LOH檢測結果的統計圖，在44對標本中，本發明檢測到有14對發生了雜合性缺失。以上結果說明，除了甲基化外，LOH也是導致UNCro在腎癌組織中發生表達下降的重要原因。圖3為本發明實施例3中UNCro載體的酶切鑒定圖譜。圖4A顯示在UNCro表達下調或缺失的腎癌細胞系786_0及A498中恢復UNCOT的表達，然后用cck-8試劑檢測不同時間點的細胞增殖情況，UNC5D可以明顯抑制腫瘤細胞系786-0及A498的細胞增殖。圖4B顯示分析的腎癌細胞系786-0表達UNCOT前后細胞周期的變化情況，發現過表達UNCro的786-0細胞系無論是否用Nocodazole進行阻滯，處于G2/M期的細胞數量都明顯多于對照組，這說明UNCro對786-0細胞系的增殖抑制是通過將細胞組織在G2/M期實現的。圖4C顯示平板克隆 形成實驗結果，說明786-0細胞在過表達UNCro后，在單細胞clone生長過程中存在著差異。圖4D顯示軟瓊脂克隆形成實驗結果，是研究腫瘤形成的體外實驗，說明UNCro對腎癌細胞系786-0的克隆形成能力具有抑制性作用。圖4E顯示劃痕試驗結果，說明UNCro對腎癌細胞系786-0的遷移能力具有抑制性作用。圖4F顯示對劃痕試驗進一步的定量試驗分析結果，通過測量不同時間點用腺病毒過表達UNCro的786-0及對照組細胞的劃痕寬度，以顯示UNCro對腎癌細胞系786-0的遷移能力所具有的抑制性作用。圖4G顯示Transwell小室遷移實驗的結果，說明UNCOT能夠抑制腎癌細胞系的遷移。圖4H顯示Transwell小室侵襲實驗結果，用以研究腫瘤細胞在體內的侵襲轉移過程，結果說明UNCro能夠抑制腎癌細胞系的侵襲能力。圖5A顯示用細胞核形態學的方法所做的細胞凋亡實驗結果，過表達UNCro的HEK293T細胞系與對照組相比顯示出更多的核碎裂和凋亡小體，說明UNCOT能夠誘導HEK293T細胞的凋亡。圖5B顯示用Annexin V-7AAD雙染色的方法來證實UNCOT對HEK293T細胞所誘導的凋亡實驗結果，從流式圖來看，無論是早期凋亡還是晚期凋亡，實驗組都明顯多于對照組。
圖5C是用PI染色的方法來檢測由于凋亡所形成的DNA定量檢測時所出現的亞二倍體峰，UNCro過表達的HEK293T中出現了明顯的亞二倍體峰。同時發現，加入caspase的廣泛抑制劑Z-VAD-FMK后，亞二倍體峰消失，說明UNCro所誘導的HEK293T細胞的凋亡是caspase依賴的。圖顯示Western blot的實驗結果，UNC5D過表達的HEK293T中能夠檢測到明顯的PAPR剪切，而且這種剪切時UNCro劑量依賴的。同樣，加入caspase的廣泛抑制劑Z-VAD-FMK后，PAPR剪切消失，進一步說明UNCOT所誘導的HEK293T細胞的凋亡是caspase依賴的。
具體實施例方式下面結合具體實施例進一步闡明本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，《分子克隆實驗指南》(第三版)(Cold Spring HarborLaboratory (CSHL) Press, 2001)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。以下實施例中，所用原始試劑和材料均可商購獲得，主要試劑和材料為:實驗用到以下細胞系:五·種腎癌細胞系包括786-0，A498，ACHN, Cak1-1和0S-RC-2 ;兩種膀胱癌細胞系包括RT-4和MGH-ul ;五種肝癌細胞系包括H印G2，Bel-7402,SMMC-7721, HLE 和 HCC-LM3 ;五種肺癌細胞系包括 NC1-H446，NC1-H460，pAa, A549 和NC1-H1299 ;四種消化道腫瘤細胞系包括SW480，SW620, HT-29和MKN-45 ;五種白血病細胞系包括U937，K562，Jurkat,Daudi和D341MED ;—種前列腺腫瘤細胞系為PC-3 ;—種乳腺癌細胞系為MCF-7 ;宮頸癌細胞系Hela ;—種卵巢癌細胞系SK-0V6 ;兩種黑色素細胞瘤細胞系WM-451和SK-Mel-37 ；以及骨腫瘤細胞系Saos_2。這些細胞系購自ATCC或北京協和醫學院細胞庫。以上細胞系使用10% FBS/RPM1-DMEM(4.5g/L 葡萄糖，4mM L-谷氨酸，100U/ml 青霉素，IOOy g/ml 鏈霉素)或 10% FBS/RPM1-1640(4.5g/L 葡萄糖，4mM L-谷氨酸，100U/ml青霉素，100 u g/ml鏈霉素)培養。44例人原發腎癌和癌旁配對組織由北京大學第三醫院泌尿外科提供。組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司；引物(包括LOH檢測所用的熒光引物)合成及測序委托北京擎科生物技術有限公司完成;Cell Counting Kit~8 (CCK-8)購自 Dojindo 公司；5-氮雜-2-脫氧胞苷(5_aza_2’ -deoxycytidine)、亞硫酸氫鈉(sodiumbisulfite)、染料 33258 (Hoechst33258)、Nocodazole、碘化丙唆(Propidium iodide)以及核糖核酸酶A (RNase A)購自Sigma-Aldrich公司；TRIZ0LTM 試劑、Lipofectamine 2000 購自 Invitrogen 公司；正常組織cDNA panel (Normal tissue cDNA panel)購自 Clontech 公司；實時定量PCR 試劑 Power SYBR Green PCR master mix 購自 Bio-Rad 公司；Wizard Plus Miniprep DNA Purification System、Reverse TranscriptionSystem、pGEM-TEasy vector、T4DNA ligase、pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK、限制性內切酶BglI1、EcoR1、NheI以及高保真DNAGo Taq聚合酶購自Promega公司；KOD DNA polymerase 酶購自 TOYOBO 公司；抗UNCro抗體購自Santa Cruz公司；HRP標記山羊抗兔的二抗購自Promega公司；抗GAPDH抗體購自Proteintech公司；抗Flag抗體購自Sigma-Aldrich公司；抗PARP購自Cell Signaling 公司；Fibronectin、matrigel、FITC 標記的 Annexin V 及 7-AAD 凋亡染色試劑盒購自BDBiosciences 公司。實施例1、UNCro在腫瘤細胞系中表達下調及其表觀遺傳學機制1.UNC5D在正常組織中的表達譜PCR檢測人16種正常組織中UNCro的表達情況，反應中所用引物序列如表I中SEQID Nos.3和4所示，反應條件參見表2，用GAPDH作為系統內參(內參引物見SEQ IDNos.5 和 6)。2.細胞或組織的RNA提取按照TRIZOLTM(InVitix)gen)試劑的說明書，分別提取細胞或組織總RNA，并將其用紫外分光光度計定量。取 I U g 總 RNA,利用 Reverse Transcription System(Promega)通過Oligo dT合成第一鏈cDNA。3.RT-PCR 反應體 系取I ill上述cDNA產物作模板進行PCR擴增。反應中所用引物序列如表I中SEQIDNos.7和8所示，反應條件參見表2，用GAPDH作為系統內參。本實施例從32例腎癌以及癌旁配對組織中提取RNA，制備cDNA。利用BIO-RAD熒光定量PCR系統進行實時定量PCR檢測。其中擴增GAPDH作為內參。4.細胞或組織的基因組DNA提取按照DNA extraction kit (Promega)的說明書提取細胞或組織的基因組DNA并將其用紫外分光光度計定量。5.UNC5D啟動子區CpG島預測通過軟件(http://www.urogene.0rg/methprimer/.)進行預測，并分別設計甲基化特異性引物(SEQ ID Nos.9和10)、非甲基化特異性引物(SEQ ID Nos.11和12)及甲基化測序引物(SEQ IDNos.13和14)(如表I所示，反應條件參見表2)。6.使用bisulfite處理檢測DNA甲基化水平將提取的基因組DNA使用BglII限制性內切酶酶切；使用不針對目的片段的限制性內切酶，酶切不多于700ng的基因組DNA ;通過沸水水煮10分鐘以終止反應；加入2MNa0H至終濃度為0.3M，50°C放置15分鐘以使DNA變性；對于每一個樣品，準備6個EP管，裝入300微升石蠟油，冰上放置，預冷。加入2倍體積的2%低熔點瓊脂糖溶解溶液(用水溶解)到DNA溶液中，用“槍”反復吹勻；形成瓊脂糖珠子:吸取10微升的DNA/瓊脂糖混合物，加入到預冷的石蠟油中；(一個Ep管中只放一個珠子)將管子放置于冰上30分鐘，以形成堅實的珠子；向每一個管子加入200-500微升2.5M Sodium Metabisulfite ;在暗室中，50°C放置4-12小時；用ImlTE (pH 8.0)洗珠子3遍，每次15分鐘，以除去剩余的SodiumMetabisulfite ;用500微升0.2M NaOH洗珠子2遍，每次15分鐘，以結束修飾；用ImlTE (pH
8.0)洗珠子3遍，每次10分鐘；用小體積的TE (pH8.0)保存珠子于4°C ；(珠子可以存放數周)PCR檢測前用Iml雙蒸水洗珠子；以處理后得到的珠子為模板，使用GoTaq DNA合成酶(Promega),在touchdown的條件下,進行PCR擴增；DNA電泳檢測結果。7.亞硫酸氫鹽-基因組DNA測序以處理后得到的珠子為模板,使用GoTaq DNA合成酶,在touchdown的條件下,進行PCR擴增；DNA電泳及膠回收、純化擴增片段；以膠回收得到的片段連接至pGEM-T easy載體；轉化并進行藍白斑篩選；挑取白色菌落(10個)進行接種到LA培養基中；送菌液進行測序；根據測序結果比對NCBI提供的正常DNA序列。 8.5-aza處理細胞系用終濃度為10 U mol/L 的 5_aza_2’-deoxycytidine (Sigma-Aldrich)處理 786-0、Hela, SW480、SW620及A549五種細胞系，然后檢測UNCOT啟動子區的甲基化水平。結果顯示:本實施例用PCR檢測UNCro在人的16種正常組織的表達情況，發現UNCOT在人的腦、腎、前列腺、睪丸、小腸及結腸組織中均檢測到了較強的表達(圖1A)。PCR檢測UNCro在多種組織來源的腫瘤細胞系中的表達情況，發現UNCro的表達在多種組織來源的腫瘤細胞系中普遍呈下調趨勢。UNC5D在非惡性的人胚腎細胞系HEK293中有很強的表達(圖1B)。本實施例中，通過在線軟件預測到UNCro基因啟動子區的存在CpG島，所設計的MSP引物及BGS引物的位置參見圖1C中所標示。MS-PCR檢測了 13種細胞系中UNCOT啟動子區CpG島的甲基化情況，發現UNCro啟動子區的CpG島在多數腫瘤細胞系中呈甲基化狀態，人胚腎細胞系HEK293則呈非甲基化狀態(圖1D-左)；甲基化測序技術進一步證實在MS-PCR檢測陽性的幾種細胞系中UN`Cro啟動子區的CpG島確實呈甲基化狀態，而HEK293細胞確實呈非甲基化狀態(圖1D-右)。用去甲基化藥物5-aza處理UNCOT低表達或表達陰性的786-0、Hela, SW480、SW620及A549五種細胞系，然后檢測UNCOT的表達情況，可見在用5-aza處理一定時間后，UNC5D的表達均上調。通過甲基化測序進一步證實UNCOT啟動子區的CpG島已被去甲基化(圖1E)。實施例2、UNC5D在腎癌組織中表達下調及其相關機制1.細胞或組織的RNA及RT-PCR反應體系和基因組DNA提取如實施例1中所述本實施例從32例腎癌以及癌旁配對組織中提取RNA，制備cDNA。利用BIO-RAD熒光定量PCR系統進行實時定量PCR檢測。其中擴增GAPDH作為內參。所用引物如表I所示，反應條件參見表2。2.免疫組化分析組織芯片經過脫蠟，梯度酒精水化，在檸檬酸鈉緩沖液中煮沸15min進行抗原修復，用3% H2O2室溫避光孵育20min去除內源性過氧化物酶，用正常羊血清工作液室溫封閉30min，然后滴加兔抗人UNCro多克隆抗體(Santa)至終濃度1: 100，于37°C反應lh。用同樣濃度的正常兔源IgG作為陰性對照。用PBS充分洗滌后滴加HRP標記的羊抗兔小鼠抗山羊二抗室溫反應30分鐘，用PBS洗滌三次，DAB顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水，最后中型樹膠封片于顯微鏡下觀察并記錄結果。3.UNC5D表達相關的統計分析UNCro在癌旁組織與配對癌組織中的表達比例(N/T ratio)與相應腫瘤組織的臨床Fuhrman分級之間的統計分析。本發明將Fuhrman級別分為三組,1/1_11、11/11_111和III/II1-1V，分別有11、37、12份病例對應。4.檢測DNA甲基化水平及亞硫酸氫鹽-基因組DNA測序方法如實施例1所述。共檢測病例標本44份，每份均包括腎癌與配對的癌旁組織。5.雜合性缺失檢測本發明選擇了分別位于UNCro編碼區上游、中游及下游的三個微衛星微點，即:D8S1083、D8S505及D8S1750,并合成相應地的熒光引物(見表I中SEQ ID Nos.15和16、SEQ ID Nos.17和18、SEQ ID Nos.19和20)，反應條件參見表2，通過分析PCR產物的大小來確定是否發生了 L0H。共檢測病例標本44份，每份均包括腎癌與配對的癌旁組織。結果顯示:根據前面的生物信息學分析及細胞系結果的提示，本發明把注意力轉向臨床標本，本發明選擇了腎透明細胞癌。通過普通PCR檢測發現:UNC 在四對所檢測的腎癌與配對癌旁組織中均表現為腎癌組織中表達確實或明顯下調(圖2A)。然后本發明對32對標本進行實時定量PCR檢測，通過對UNCro與GAPDH的檢測值之比進行比較，說明UNC5DmRNA在配對的腎癌組織中表 達下調(圖2B)。免疫組化結果進一步證實UNCro蛋白在配對的腎癌組織中表達下調(圖2C，圖中箭頭所指的就是UNCro陽性區，本發明發現在正常以及癌旁組織中，UNCro主要分別于腎小管胞質中)。通過UNCro在癌旁組織與配對癌組織中的表達比例(N/T ratio)與相應腫瘤組織的臨床Fuhrman分級之間進行統計分析,本發明發現一個有意思的現象=UNCOT在惡性程度越低的腎癌組織中似乎表達受抑制程度相對越低(圖2D，隨著Fuhrman分級的增高，N/Tratio呈下調趨勢)。本發明從兩方面來描述UNCro在腎癌組織中表達下調的機制，一是UNCro基因啟動子區的甲基化檢測(圖2E及圖2F)，二是染色體上UNCro區段的雜合性缺失(圖2G及圖2H)。實驗證實這兩種機制均參與了了 UNCro在腎癌組織中表達下調的調控。具體地，圖2E是檢測的腎癌組織與配對癌旁組織中UNCro啟動子區CpG島的甲基化水平，與上述表達譜及細胞系中的甲基化情況一致，腎癌組織中UNCro啟動子區CpG島普遍呈高度甲基化狀態，而相應的癌旁組織則呈非甲基化或低度甲基化狀態；圖2F是通過甲基化測序分析進一步證實圖2E的結果。圖2G是對腎癌與配對癌旁組織進行的染色體雜合性缺失(LOH)檢測的結果，如圖，本發明在所選擇的分別位于UNCro編碼區上游、中游及下游的三個微衛星微點D8S1083、D8S505及D8S1750中均檢測到了缺失的情況，圖2G是三個位點發生LOH的圖例。圖2H是本發明對44份配對腎癌與癌旁組織進行LOH檢測結果的統計圖，在44對標本中，本發明檢測到有14對發生了雜合性缺失。以上結果說明，除了甲基化外，LOH也是導致UNC5D在腎癌組織中發生表達下降的重要原因。實施例3、UNC5D對腫瘤細胞系的增殖、遷移及克隆形成能力的抑制作用1.UNCro真核表達載體的構建本發明以腦組織cDNA為模板，通過高保真Taq酶K.0.D酶進行PCR擴增(擴增引物見表I中SEQ ID Nos.21和22，反應條件參見表2)，其中上游引物帶有EcoRI酶切位點，下游引物帶有NheI酶切位點，將PCR產物及pRK空載體用EcoRI和NheI進行雙酶切處理，然后DNA電泳分離純化，用T4連接酶將產物進行連接，經過轉化-挑單克隆-小搖菌液-小提質粒等一系列操作后，最后經測序及酶切進行驗證(酶切圖譜見圖3)，測序正確。正確的質粒進行大量提取。UNCro蛋白產物的C端標有flag標簽。2.腺病毒Ad-UNCOT載體的構建和病毒的包裝Ad-UNC5D以及對照空載體病毒Achnull (Mock)、Ad-GFP委托本元正陽公司重組、包裝、純化獲得，TCID50亦由該公司測定。3.腎癌細胞系的感染以及轉染細胞在感染前一天以適宜密度接種于96孔板、12孔板、6孔板或60mm細胞培養皿中，18-22小時后進行細胞計數，用不同的MOI值感染細胞。吸去原細胞培養上清，加入半量新鮮完全培養基，而后在加入腺病毒的第一小時里每15分鐘輕輕晃動培養皿，一小時后補足培養基。待轉染的細胞提前24小時接種于6孔板中，轉染前將培養基換成Opt1-MEM培養基，將含有12ii I的lipofetamine2000的Opt1-MEM培養基2504 y I與含有4 y g質粒DNA的OptiM培養基混合，室溫30分鐘后，滴加入培養基中，4-6小時后換為普通培養基。24小時后觀察。4.CCK-8法繪制細胞的生長曲線將腺病毒感染后的細胞按照2000細胞/孔的密度接種于96孔板中，每組細胞設3個平行復孔，分別于0h、24h、48h、72h加入10 U I的CCK-8試劑，于37°C在5% CO2下孵育2小時后，用ELISA Reader 450nm測量光密度值。對各時間點不同組的結果進行統計后繪制細胞的生長曲線。5.細胞周期實驗將786-0細胞以I X 106接種于60mm培養板，80%匯合后感染。24小時后在新鮮培養液中加入nocodazole (300ng/ml ； Sigma-A I dr ich), 16小時后收集變圓的細胞，PBS洗兩遍，棄上清，培基重懸以2X10 5/well鋪入6孔板中，每兩小時為一時間點收獲細胞，PBS洗兩遍，加入Iml 70%預冷乙醇中，吹打均勻，4°C固定12小時以上。以PBS洗滌去乙醇，IOOOrpm, 5min,洗兩遍。0.5mlPBS重懸細胞，加入PI和RNaseA至終濃度50 u g/ml，37°C溫浴30min。用流式細胞儀測定周期。以FlowJo軟件(Tree Star)分析流式數據。6.平板克隆形成實驗分別將轉染pRK的細胞(對照組)以及pRK-UNC5CL的細胞(實驗組)按每孔1000個、2000個以及10000個細胞接種到6孔板中，24小時后將培養基換成含有G418的普通培養基培養，每三天換一次液，14天后使用預冷的甲醇固定，0.005結晶紫染色。7.軟瓊脂克隆形成實驗將腺病毒感染后的細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活細胞計數，用含20%胎牛血清的DMEM培養液調整細胞密度至IX IO6細胞/L。用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40°C中使之不凝固。按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2 X DMEM培養基(含有2 X抗生素和20 %的小牛血清)混合后，取3ml混合液注入直徑為6cm的平皿中(IOcm平皿加7 IOml),冷卻凝固，可作底層瓊脂置于CO2溫箱中備用。按1:1比例使0.7%的瓊脂糖和2XDMEM培養基在無菌試管中相混以后，再將感染Ad-GFP的細胞(對照組)以及感染Ad-UNC5CL的細胞(實驗組)分別加入1.5ml的剛剛配好的混合物中，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐漸形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37°C、5% CO2的溫箱中培養10 14天。把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞克隆數。計算形成率。
8.遷移、侵襲和劃痕以及劃痕定量實驗采用孔徑為8 ii m 的聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane)的 24-wellTranswell (Corning公司)進行趨化性遷移實驗(chemotaxis assay)。用10 % FBS置于下室，將fibronectin(纖粘連蛋白)(BD-Pharmingen公司)涂于聚碳酸酯膜的下層。收獲對數生長期的細胞，用0.1% BSA/DMEM洗細胞2遍，調整細胞密度至I X 107ml，50 yl/孔，每種細胞設3個平行復孔。于37°C在5% CO2下孵育I小時后，收膜，用甲醇固定細胞，Giemsa染色20分鐘，用棉簽輕輕刮去上層未遷移的細胞，用PBS洗3遍，光學顯微鏡下觀察。每孔隨機選取3個高倍鏡視野進行計數，對每種細胞3個平行復孔9個高倍鏡視野的計數值取算術平均數進行統計。侵襲實驗實在Transwell遷移實驗的基礎上在小室膜上面涂上30 ii g的Matrigel (BD Biosciences)。.劃痕實驗在6孔板中進行,將感染后的細胞鋪于孔中直至長滿一層，使用無菌槍頭將細胞劃痕，用PBS洗3次，孵育至相應時間點后在鏡下進行觀察照相。劃痕定量試驗中，每三個小時為一個時間點，用相差顯微鏡進行拍照記錄，然后測量劃痕的寬度并繪制曲線圖。結果顯示:在UNCro表達下調或缺失的腎癌細胞系786-0及A498中恢復UNCOT的表達，然后用cck-8試劑檢測不同時間點的細胞增殖情況，UNCro可以明顯抑制腫瘤細胞系786-0及A498的細胞增殖(圖4A)。分析的腎癌細胞系786-0表達UNCro前后細胞周期的變化，發現過表達UNCro的786-0細胞系無論是否用Nocodazole進行阻滯，處于G2/M期的細胞數量都明顯多于對照組，這說明UNCro對786-0細胞系的增殖抑制是通過將細胞組織在G2/M期實現的(圖4B)。在平板克隆形成實驗中，786-0細胞在過表達UNCro后，在單細胞clone生長過程中存在著差異(圖4C)。同樣，在軟瓊脂克隆形成實驗中，UNCro對腎癌細胞系786-0的克隆形成能力具有抑制性作用(圖4D)。劃痕試驗顯示UNCro對腎癌細胞系786-0的遷移能力具有抑制性作用(圖4E)。對劃痕試驗進一步的定量試驗，通過測量不同時間點用腺病毒過表達UNCro的786-0及對照組細胞的劃痕寬度，以顯示UNCro對腎癌細胞系786-0的遷移能力所具有的抑制性作用(圖4F)。Transwell小室遷移實驗的結果說明UNCro能夠抑制腎癌細胞系的遷移(圖4G)，T ranswell小室侵襲實驗，用以研究腫瘤細胞在體內的侵襲轉移過程，結果說明UNCro能夠抑制腎癌細胞系的侵襲能力(圖4H)。實施例4、UNC5D對人胚腎細胞HEK293T的凋亡誘導及其相關分子機制1.細胞核形態學檢測凋亡收獲UNCro過表達的293T細胞及對照組細胞，PBS洗滌兩次，以含4%福爾馬林的PBS固定細胞30分鐘，PBS洗滌兩次，以Hoechst33258 (Sigma)染色5分鐘，PBS洗滌兩次，在熒光顯微鏡的UV通道下觀察記錄，出現核碎裂和凋亡小體的細胞被認為是凋亡細胞。2.流式細胞學檢測凋亡Annexin V-7AAD雙染色的方法為收獲UNCOT過表達的293T細胞及對照組細胞，PBS洗漆兩次,按照Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences)的說明書進行檢測。在用PI染色的方法來檢測由于凋亡所形成的DNA定量檢測時所出現的亞二倍體峰的試驗中，在293T細胞中轉入UNCro及MOCK質粒，加入或不加caspase的廣泛抑制劑Z-VAD-FMK，48小時后收獲UNCro過表達的293T細胞及對照組細胞，PBS洗滌兩次，然后加入Iml 70%預冷乙醇中，吹打均勻，4°C固定12小時以上。以PBS洗滌去乙醇，1000rpm，5min，洗兩遍。0.5mlPBS重懸細胞，加入PI和RNaseA至終濃度50i! g/ml，37°C溫浴30min。用流式細胞儀測定。3.Wertern blot 檢測凋亡在293T細胞中轉入UNCro及MOCK質粒，加入或不加caspase的廣泛抑制劑Z-VAD-FMK, 48小時后收獲UNCOT過表達的293T細胞及對照組細胞，收獲相同數量的UNCOT過表達的293T細胞及對照組細胞的總細胞蛋白，Wertern blot檢測，PAPR及其剪切蛋白，GAI3DH 及 flag。結果顯示:在用細胞核形態學的方法所做的細胞凋亡實驗中，過表達UNCro的HEK293T細胞系與對照組相比顯示出更多的核碎裂和凋亡小體，說明UNCro能夠誘導HEK293T細胞的凋亡(圖5A)。用Annexin V-7AAD雙染色的方法來證實UNCOT對HEK293T細胞所誘導的凋亡，無論是早期凋亡還是晚期凋亡，實驗組都明顯多于對照組(圖5B)。用PI染色的方法來檢測由于凋亡所形成的DNA定量檢測時所出現的亞二倍體峰，UNC5D過表達的HEK293T中出現了明顯的亞二倍體峰。同時發現，加入caspase的廣泛抑制劑Z-VAD-FMK后，亞二倍體峰消失，說明UNCro所誘導的HEK293T細胞的凋亡是caspase依賴的(圖5C)。Westernblot的實驗結果中，UNCro過表達的HEK293T中能夠檢測到明顯的PAPR剪切，而且這種剪切時UNCro劑量依賴的。同樣，加入caspase的廣泛抑制劑Z-VAD-FMK后，PAPR剪切消失，進一步說明UNCro所誘導的HEK293T細胞的凋亡是caspase依賴的(圖OT)。表1-引物列表
權利要求
1.UNC5D基因和/或其編碼的蛋白在制備治療癌癥的藥物中的應用。
2.檢測UNCro基因或其編碼的蛋白的試劑在制備用于癌癥的輔助診斷和/或預后判斷的組合物中的應用； 優選地，所述檢測UNCro基因或其編碼的蛋白的試劑包括:用于在PCR中合成UNCro基因DNA鏈和/或其cDNA鏈的PCR引物、或抗UNCOT蛋白的抗體。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其中，所述癌癥為腎癌。
4.UNC5D基因和/或其編碼的蛋白在制備具有抑制腫瘤細胞的生長、抑制腫瘤細胞的遷移、抑制腫瘤細胞的成瘤性、和/或誘導細胞凋亡的效果的制劑中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其中，所述腫瘤細胞為腎癌細胞。
6.根據權利要求4所述的應用，其中，所述遷移為細胞外基質纖粘連蛋白誘導的腎癌細胞的遷移。
7.根據權利要求1或2或4或5或6所述的應用，其中，所述UNCro基因包含于載體 中； 優選地，所述載體為真核表達載體或病毒，更優選為腺病毒。
8.一種用于治療癌癥、抑制腫瘤細胞的生長、抑制腫瘤細胞的遷移、抑制腫瘤細胞的成瘤性、和/或誘導細胞凋亡的藥物組合物，該藥物組合物含有: UNC5D基因和/或其編碼的蛋白，以及一種或多種藥用賦形劑或藥用載體。
9.根據權利要求8所述的藥物組合物，其中，所述癌癥為腎癌，所述腫瘤細胞為腎癌細胞。
10.一種用于癌癥診斷和/或預后判斷的試劑盒，所述試劑盒含有:用于在PCR中合成UNC5D基因DNA鏈和/或其cDNA鏈的PCR引物，或抗UNCOT蛋白的抗體； 優選地，所述癌癥為腎癌。
全文摘要
本發明提供了新的抑癌基因UNC5D基因及其編碼蛋白的新應用，具體涉及UNC5D基因和/或其編碼的蛋白在制備治療癌癥的藥物中的應用；檢測UNC5D基因或其編碼的蛋白的試劑在制備用于癌癥的輔助診斷和/或預后判斷的組合物中的應用；UNC5D基因和/或其編碼的蛋白在制備具有抑制腫瘤細胞的生長、抑制腫瘤細胞的遷移、抑制腫瘤細胞的成瘤性、和/或誘導細胞凋亡的效果的制劑中的應用。本發明研究發現UNC5D是一種新的潛在抑癌基因，特別是在腎癌的發生、發展過程中具有重要作用。
文檔編號A61P35/00GK103157116SQ20121036209
公開日2013年6月19日 申請日期2012年9月25日 優先權日2012年9月25日
發明者張君, 張毓, 呂丹, 董冬 申請人:北京大學