專利名稱：抗—cd33抗體和使用其治療急性髓性白血病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)合CD33的抗體。更特別地是，本發(fā)明涉及抗CD33抗體，所述抗體的片段和同源物，所述抗體的人源化和表面重整(resurfaced)形式，抗體的功能等價(jià)物和改良形式，含有所述抗體的免疫偶聯(lián)物(immunoconjugate)和組合物，以及其在診斷、研究和治療中的應(yīng)用。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及編碼該抗體的多核苷酸，含有該多核苷酸的載體，用多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和產(chǎn)生該抗體的方法。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞分化抗原(leukocytedifferentiation antigen)CD33 是一個(gè)具有 364 個(gè)氨基酸的跨膜糖蛋白，其與唾液酸粘附素家族的成員具有序列同源性，包括髓鞘相關(guān)糖蛋白和CD22，以及唾液酸粘附素本身(S. Peiper, 2002, Leucocyte Typing VII，White Cell Differentiation, Antigens, Proceedings of the Seventh International Workshop and Conference, Oxford University Press,p.777)。0)33的表達(dá)似乎對(duì)造血區(qū)室(hematopoietic compartment)有高度的特異性，由骨髓前體細(xì)胞進(jìn)行強(qiáng)表達(dá)(S. Peiper，2002)。它可被下列細(xì)胞表達(dá)，骨髓祖細(xì)胞(myeloidprogenitor cells)，如 CFU_GEMM、CFU-GM、CFU_G 和 BFU-E，單核細(xì)胞 / 巨噬細(xì)胞，粒細(xì)胞前體如前髓細(xì)胞和髓細(xì)胞細(xì)胞，盡管在成熟和分化過程中表達(dá)降低，以及可被成熟的粒細(xì)胞表達(dá)，盡管其表達(dá)水平低(S. Peiper, 2002)。相反，在體外產(chǎn)生“胚細(xì)胞集落(blastcolonies)” (Leary, A. G. et al.，1987，Blood 69:953)、并誘導(dǎo)造血骨髓長期培養(yǎng)(Andrews R. G. et al. , 1989, J. Exp.Med. 169:1721 Sutherland, H. J.等人，1989，Blood 74:1563)的多能造血干細(xì)胞似乎缺乏⑶33的表達(dá)。盡管CD33的特殊功能還不清楚，但其與唾液酸粘附素的同源性提示其在凝集素家族的碳水化合物結(jié)合特性中的作用，這種作用隨后被證實(shí)(S. Peiper, 2002)。重要的是，抗-⑶33單克隆抗體已經(jīng)顯示⑶33可在超過80%的人類病例的克隆發(fā)生性，急性骨髓性白血病(AML)細(xì)胞上表達(dá)(LaRussa, VF. et al.，1992，Exp.Hematol. 20:442-448)。由于CD33的選擇性表達(dá)，結(jié)合細(xì)胞毒類藥物的免疫偶聯(lián)物，能特異識(shí)別和結(jié)合CD33的單克隆抗體，已經(jīng)被建議用于選擇性靶向AML細(xì)胞。這種治療法期望可使干細(xì)胞和原始的造血祖細(xì)胞不受影響。使用抗CD33抗體的免疫偶聯(lián)物，包括抗-CD33-蓖麻毒素免疫偶聯(lián)物，其已經(jīng)顯示對(duì)AML細(xì)胞是高度致死性的(Roy, D. C. et al.，1991，Blood 77:2404 ；Lambert, J. M. et al. , 1991, Biochemistry 30:3234),然而卻不傷害支持正常的造血作用和造血系統(tǒng)重建的干細(xì)胞(LaRussa, V F. et al.，1992，Exp. Hemato. 20:442-448)。使用免疫偶聯(lián)物的其他研究顯示當(dāng)靜脈給藥時(shí)，放射性標(biāo)記的抗CD33抗體可迅速革巴向外周血和骨髓中的白血病母細(xì)胞(Scheinberg, D. A. et al.，1991, J. Clin.Oncol. 9:478-490 ； Schwartz, M. A. et al. , 1993, J. Clin. Oncol. 11:294-303)。在體外研究中也觀察到祀細(xì)胞對(duì)抗體的迅速內(nèi)化(Tanimot, M. et al. , 1989, Leukemia 3:339-348 ；Divgi, C. R. et al. , 1989, Cancer Res. Suppl. Vol. 30:404a) 在臨床前研究中，對(duì)與強(qiáng)力抗腫瘤抗生素卡奇霉素(卡奇霉素吉妥組單抗(Gemtuzumab ozogamicin))偶聯(lián)的人源化抗-CD33抗體的評(píng)價(jià)表明了對(duì)HL-60細(xì)胞培養(yǎng)物、小鼠HL-60腫瘤異種移植物和AML患者的骨髓樣品中的白血病細(xì)胞的特異性殺傷作用(Hamann, P. R. et al. , 2002, BioconjugateChem. 13:47-58)。基于這些臨床前研究的陽性結(jié)果，卡奇霉素吉妥組單抗在I期和II期臨床研究 中被進(jìn)行評(píng)價(jià)。在臨床I期研究中，觀察到的主要毒性是骨髓抑制(myelosuppression)，其原因是骨髓祖細(xì)胞上 CD33 的表達(dá)(Sievers，E. L. et al.，1999，Blood 93:3678-3684 ；Sievers E. L. et al.，2001，J. Clin. Oncol. 19:3244—3254)。在 II 期臨床研究中，靜脈給藥劑量為9mg/m2，超過4小時(shí)，14天后重復(fù)，產(chǎn)生的響應(yīng)率為30%。FDA于2000年5月批準(zhǔn)了卡奇霉素吉妥組單抗的市場(chǎng)準(zhǔn)入，適應(yīng)征是治療首次復(fù)發(fā)的⑶33陽性AML患者，年齡在60歲或60歲以上并被認(rèn)為不能進(jìn)行細(xì)胞毒性化療的候選人。進(jìn)入市場(chǎng)后的研究報(bào)告表明其可能具有顯著的毒性，特別是靜脈閉塞性疾病(VOD)，這已經(jīng)導(dǎo)致標(biāo)簽修正，并啟動(dòng)患者監(jiān)控程序。大多數(shù)這種毒性涉及藥物組分卡奇霉素，其顯示可在臨床前模型中引起肝毒性，因此不是靶向CD33的直接結(jié)果。盡管上述討論的結(jié)果表明含有抗CD33抗體和細(xì)胞毒類藥物的免疫偶聯(lián)物可成功地用于治療AML，但仍需要既安全又有效的免疫偶聯(lián)物。本發(fā)明就是涉及這些和其他重要的目標(biāo)。發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供可特異性結(jié)合⑶33和可用于治療AML的抗體。因此，在第一種實(shí)施方案中，提供了抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段(epitope-binding fragment),它們具有結(jié)合⑶33的能力。在第二種實(shí)施方案中，提供了鼠抗體My9_6，就它的輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，針對(duì)該輕鏈和重鏈可變區(qū)的基因的cDNA序列，它的CDRs (互補(bǔ)決定區(qū))的鑒定，它的表面氨基酸的鑒定，以及它的以重組形式的表達(dá)手段在本文已充分描述。在第三種實(shí)施方案中，提供了 My9_6抗體的人源化或表面重整版本。其中My9_6抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段的表面暴露殘基(surface-exposed residues)在輕鏈和重鏈中都被替換，以與已知的人抗體表面更相似。這種人源化抗體與鼠My9_6相比，作為治療性或診斷性試劑，其效用增加。鼠抗體My9_6的人源化版本在本文中從以下方面進(jìn)行了詳盡描述它們各自的輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，輕鏈和重鏈可變區(qū)基因的cDNA序列，CDRs(互補(bǔ)決定區(qū))的鑒定，表面氨基酸的鑒定，以及以重組形式表達(dá)的方法的公開。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了包括至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，其中互補(bǔ)決定區(qū)具有選自SEQ ID NO :1-6中的氨基酸序列SYYIH(SEQ ID NO: I),VIYPGNDDISYNQKFXG (SEQ ID NO: 2)，其中 X 是 K 或 Q，EVRLRYFDV(SEQ ID NO:3)，KSSQSVFFSSSQKNYLA (SEQ ID NO:4)，WASTRES(SEQ ID NO:5)，HQYLSSRT(SEQ ID NO:6)，并具有與⑶33結(jié)合的能力。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了包括至少一個(gè)重鏈可變區(qū)和至少一個(gè)輕鏈可變區(qū)的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，其中所述重鏈可變區(qū)含有三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)，其分別具有由SEQ ID NO :1-3表示的氨基酸序列，SYYIH(SEQ ID NO: I),VIYPGNDDISYNQKFXG (SEQ ID NO: 2)，其中 X 是 K 或 Q，EVRLRYFDV(SEQ ID NO:3),和其中所述輕鏈可變區(qū)含有三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)，其分別具有由SEQ IDN0:4_6表示的氨基酸序列，KSSQSVFFSSSQKNYLA (SEQ ID NO:4)，WASTRES(SEQ ID NO:5)，HQYLSSRT(SEQ ID NO:6)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了具有一個(gè)重鏈可變區(qū)的抗體，其中該重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO:7所表示的氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLJADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYY CAREVRLRYFDVffGAGTTVTVSS 具有至少 90% 的序列同一性，更優(yōu)選與SEQ ID NO:7具有95%的序列同一性，最優(yōu)選與SEQ IDN0:7具有100%的序列同一'I"生。類似地，提供了含有一個(gè)輕鏈可變區(qū)的抗體，其中該輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO:8所表不的氣基酸序列NIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIP GQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKR 具有至少 90% 的序列同一性，更優(yōu)選與SEQ ID NO:8具有95%的序列同一性，最優(yōu)選與SEQ IDN0:8具有100%的序列同一'I"生。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了具有人源化或表面重整的重鏈可變區(qū)的抗體，其中該人源化或表面重整的重鏈可變區(qū)與SEQ ID NO:9所表示的氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYY CAREVRLRYFDVffGQGTTVTVSS 具有至少 90% 的序列同一性，更優(yōu)選與SEQ ID NO:9具有95%的序列同一性，最優(yōu)選與SEQ IDN0:9具有100%的序列同一'I"生。類似地，提供了具有一個(gè)人源化或表面重整的輕鏈可變區(qū)的抗體，該人源化或表面重整的輕鏈可變區(qū)與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 10的氨基酸序列
EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKR,具有至少90%的序列同一性，更優(yōu)選與SEQ ID NO: 10具有95%的序列同一性，最優(yōu)選與SEQ ID NO: 10具有100%的序列同一性。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了免疫偶聯(lián)物，該免疫偶聯(lián)物含有與本發(fā)明的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段共價(jià)連接的藥物或前體藥物，直接或通過可切割或非切割性連接子共價(jià)連接。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物或前體藥物是細(xì)胞毒性藥物或前體藥物，如美登木素生物堿(maytansinoid)、紫杉醇(taxoid)、CC-1065、CC-1065類似物，海兔毒肽和海兔毒肽類似物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，包括本發(fā)明的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段和藥物或前體藥物的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括藥物組合物，該藥物組合物包括本發(fā)明的抗·體、其抗原決定簇結(jié)合片段或免疫偶聯(lián)物，或者單獨(dú)，或者與藥物或前體藥物或其他治療劑組合，在存在一種或多種藥學(xué)上可接受試劑的情況下。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段，被標(biāo)記用于研究或診斷應(yīng)用中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)記是生物素標(biāo)記，酶標(biāo)記，放射性標(biāo)記，熒光基團(tuán)，發(fā)色基團(tuán)，顯像劑或金屬離子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制表達(dá)CD33的細(xì)胞的生長的方法，該方法通過使用本發(fā)明的抗體、其抗原決定簇結(jié)合片段或免疫偶聯(lián)物，或者單獨(dú)，或者與藥物或前體藥物或其他治療劑組合，進(jìn)一步地，單獨(dú)或在存在一種或多種藥學(xué)上可接受試劑的情況下。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療患有表達(dá)CD33的疾病的患者的方法，包括給予本發(fā)明的抗體、其抗原決定簇結(jié)合片段或免疫偶聯(lián)物，或者單獨(dú)或者與藥物或前體藥物或其他治療劑組合，進(jìn)一步地，單獨(dú)或在存在一種或多種藥學(xué)上可接受試劑的情況下。所述疾病可以是一種或多種，例如骨髓增生異常綜合征(MDS)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)和前髓細(xì)胞性白血病(PML)，或其他被確定其中表達(dá)CD33的疾病。治療方法，包括體內(nèi)、離體和體外應(yīng)用本發(fā)明的抗體、抗體片段和免疫偶聯(lián)物，或者單獨(dú)使用或者與藥物或前體藥物或其他治療藥劑組合使用，進(jìn)一步地，單獨(dú)地或在存在一種或多種藥學(xué)上可接受試劑的情況下使用。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了確定生物學(xué)樣品中是否含有骨髓性癌細(xì)胞的方法，其中，生物學(xué)樣品與診斷試劑，如標(biāo)記的本發(fā)明的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段相接觸，并檢測(cè)該試劑在樣品中的分布。這種方法可用來診斷如急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)和前髓細(xì)胞性白血病(PML)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了具有改良特性的本發(fā)明的抗體或抗原決定簇結(jié)合片段。例如，可通過采用動(dòng)物免疫、雜交瘤形成和選擇具有特殊特性的抗體的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，來制備與CD33親和性提高的抗體或抗原決定簇結(jié)合片段。改良的抗體也可通過本發(fā)明的抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段的親合力成熟來制備，例如通過使用寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變、盒式誘變、易錯(cuò)PCR，DNA改組和應(yīng)用大腸桿菌增變菌。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段的多核苷酸，包含該多核苷酸的重組載體，用該重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，和通過培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生所述抗體和其抗原決定簇結(jié)合片段的方法。在最后一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種通過使用本發(fā)明抗體或其抗原決定簇結(jié)合片段從生物學(xué)材料中獲得CD33的方法。


圖I顯示了競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果，其中，在存在濃度不斷增加的My9抗體或My9_6抗體下，測(cè)定了 125I-標(biāo)記的My9-6抗體(3X 10_9M)與⑶33陽性U-937細(xì)胞的結(jié)合作用。
圖2顯示了用于輕鏈信號(hào)序列的My9_6簡(jiǎn)并引物。圖3顯示了來自Brookhaven數(shù)據(jù)庫的127個(gè)抗體結(jié)構(gòu)的文件名，其可被用來預(yù)測(cè)muMy9-6可變區(qū)的表面。圖4顯示了用來構(gòu)建該16個(gè)表面重整My9_6版本以及嵌合My9_6抗體的PCR引物。圖5顯示了用來構(gòu)建和表達(dá)人源化抗體的質(zhì)粒。(A):輕鏈克隆質(zhì)粒。(B):重鏈克隆質(zhì)粒。(C):哺乳動(dòng)物抗體表達(dá)質(zhì)粒。圖6A顯示了 muMy9-6輕鏈的Edman測(cè)序結(jié)果，與由RT-PCR產(chǎn)生的cDNA克隆所得的的氨基酸序列進(jìn)行比較。圖6B顯示了 1319Da和1122Da肽片段的MS-MS序列分析結(jié)果，其中所述1319Da和1122Da肽片段分別含有⑶Rl和CFR2序列的。⑶R序列以粗體表示。圖7顯示了 1788Da肽和來自兩個(gè)cDNA克隆的相應(yīng)序列的MS-MS序列分析結(jié)果。圖8A顯示了鼠My9_6抗體的cDNA序列和推算的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。三個(gè)⑶R用下劃線表示。圖8B顯示了鼠My9_6抗體的cDNA序列和推算的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。三個(gè)⑶R用下劃線表示。圖9顯示了由Kabat定義所確定的輕鏈和重鏈⑶R。圖10顯示了鼠My9_6抗體的輕鏈和重鏈氨基酸序列，與8_27和V102基因的胚系序列進(jìn)行比對(duì)。點(diǎn)(.)表示序列同一性。圖11A&B顯示了與muMy9_6序列最同源的10個(gè)輕鏈(A)和重鏈⑶抗體序列，在Brookhaven數(shù)據(jù)庫中有解答文件(solved file)。序列以同源性從最大至最小的順序進(jìn)行排列。圖12A&B顯示了 muMy9_6抗體輕鏈(A)和重鏈(B)的每個(gè)Kabat位點(diǎn)的平均可及性(accessibility)。10個(gè)最同源的輕鏈和重鏈序列的每個(gè)Kabat位點(diǎn)的相對(duì)溶劑可及性(solvent accessibilities)被平均，并沿 χ 軸顯不。圖13Α顯示了 10個(gè)最同源的輕鏈結(jié)構(gòu)的殘基溶劑可及性，用MC軟件計(jì)算，并顯示了每個(gè)Kabat位點(diǎn)的平均值，用Excel制表。本表顯示了平均溶劑可及性超過25%的非CDR位點(diǎn)的數(shù)據(jù)。表面殘基被規(guī)定為具有超過30%平均溶劑可及性的殘基。進(jìn)一步分析具有25%-35%平均可及性的位點(diǎn)，是可通過計(jì)算僅在該位點(diǎn)以及其兩側(cè)側(cè)向位點(diǎn)具有相同殘基的結(jié)構(gòu)的平均可及性而進(jìn)行。NA是指沒有相同的側(cè)向位點(diǎn)。位點(diǎn)15和70需要進(jìn)一步的計(jì)算，以獲得在最后一列中給定的最終的表面預(yù)測(cè)值。圖13B顯示了 10個(gè)最同源的重鏈結(jié)構(gòu)的殘基溶劑可及性，用MC軟件計(jì)算，并顯示了每個(gè)Kabat位點(diǎn)的平均值，用Excel制表。本表顯示了平均溶劑可及性超過25%的非CDR位點(diǎn)的數(shù)據(jù)。表面殘基被規(guī)定為具有超過30%平均溶劑可及性的殘基。進(jìn)一步分析具有25%-35%平均可及性的位點(diǎn)，是通過計(jì)算僅在該位點(diǎn)以及其兩側(cè)側(cè)向位點(diǎn)具有相同殘基的結(jié)構(gòu)的平均可及性而進(jìn)行。NA是指沒有相同的側(cè)向位點(diǎn)。圖14 顯不了 My9_6 框架表面殘基(framework surface residues)，其落在 CDR殘基5 A之內(nèi)。圖15顯示了從Kabat數(shù)據(jù)庫中獲取的前5個(gè)人抗體序列。通過SR生成對(duì)比(Pedersen, 1993)。進(jìn)入Q)R的5人范圍內(nèi)的muMy9_6殘基用下劃線表示。圖16A&B顯示了 16個(gè)人源化My9_6輕鏈可變區(qū)序列(A)和16個(gè)人源化My9_6重 鏈可變區(qū)序列(B)，是與鼠My9-6比對(duì)的。點(diǎn)(.)表示相對(duì)于人源化版本I. O的序列同一性。在鼠和人My9-6之間有差異的表面殘基，用下劃線標(biāo)出。圖17顯示了 My9_6KD值，是通過在HL-60膜和HL-60全細(xì)胞上的直接結(jié)合測(cè)定(direct binding assay)、以及在HL-60膜上的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定計(jì)算得到。除了 *處N=2以外，N=3。圖18顯示了 huMy9-6Vl. O的結(jié)合曲線。(A):在HL-60膜上的直接結(jié)合。(B):在HL-60全細(xì)胞上的直接結(jié)合。(C):在HL-60膜上的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。圖19顯示了 My9-6_DM1與My9_6抗體結(jié)合的比較，在HL-60細(xì)胞上進(jìn)行。圖20顯示了 My9-6_DM1對(duì)于表達(dá)⑶33的人腫瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性。圖21顯示了 My9-6_DM1在攜帶HL-60異種移植物的SCID小鼠中的效能試驗(yàn)結(jié)果。My9-6-DMl (A)和未修飾My9_6抗體(C)對(duì)HL-60腫瘤生長的作用被評(píng)價(jià)。小鼠的體重作為毒性的指征(indication)被監(jiān)測(cè)(B，D)。圖22顯示了 My9-6_DM1與游離藥物美登素在攜帶HL-60異種移植物的SCID小鼠中的效能比較(A)。小鼠的體重作為毒性的一個(gè)指征被監(jiān)測(cè)(B)。在兩個(gè)被治療小鼠中復(fù)發(fā)的腫瘤用第二個(gè)療程的My9-6-DMl治療。圖23A&B顯示了 My9_6_DMl和標(biāo)準(zhǔn)化療在攜帶HL-60異種移植物的SCID小鼠中的抗腫瘤效能比較(A)。小鼠的體重作為毒性的一個(gè)指征被監(jiān)測(cè)(B)。在兩個(gè)被治療的小鼠中的復(fù)發(fā)腫瘤用第二個(gè)療程的My9-6-DMl治療。圖24A&B顯示了 My9_6_DMl與卡奇霉素吉妥組單抗和標(biāo)準(zhǔn)化療在HL-60生存模型(survival model)中的抗腫瘤功效的比較。HL-60細(xì)胞被靜脈注射進(jìn)SCID小鼠中。指示治療在注射細(xì)胞之后11天開始。除了卡奇霉素吉妥組單抗(Q4DX3)以外，治療為靜脈注射每天X5。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了新型鼠抗-CD33抗體和該抗體的人源化版本。進(jìn)一步提供的是含有一種或多種鼠抗CD33抗體或其人源化版本的CDR的抗體，其特異地識(shí)別和結(jié)合CD33。鼠My9_6 抗體本發(fā)明的鼠抗-⑶33抗體(murine anti-Q)33 antibody),在本文中有許多名稱，稱為“My9-6”，“鼠My9-6 (murine My9_6)”和“muMy9_6”，就其輕鏈和重鏈可變區(qū)的推斷的胚系氨基酸序列(germline amino acid sequence)(圖10),輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(圖8A&B)，⑶R的鑒定(圖9)，表面氨基酸的鑒定(圖13A & B)和其以重組版本表達(dá)的方法而言，已被充分描述。My9-6抗體的功能已經(jīng)進(jìn)一步被描述，顯示與存在于⑶33陽性U-937細(xì)胞的表面上的⑶33具有很高的結(jié)合親和性(圖I)。125I-標(biāo)記的My9-6結(jié)合U-937細(xì)胞，它可被未標(biāo)記的My9-6和以前描述的抗CD33抗體My9從細(xì)胞上競(jìng)爭(zhēng)下來(BioGenex，cat. no. 267M)。術(shù)語“可變區(qū)(variable region)”在此用來描述抗體重鏈和輕鏈的某些部分,它們?cè)诳贵w之間序列不同，且協(xié)同決定每個(gè)特定抗體對(duì)其抗原的結(jié)合和特異性。可變性并不經(jīng)常均勻地分布在抗體可變區(qū)。其通常集中在稱為互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)或超變區(qū)的可變區(qū)的三個(gè)片段內(nèi)，均在輕鏈和重鏈可變區(qū)內(nèi)。可變區(qū)的更高度保守部分稱為框架區(qū)。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包括四個(gè)框架區(qū)，主要采用β -片層構(gòu)型，每個(gè)框架區(qū)連接三個(gè)CDR，形成與β-片層結(jié)構(gòu)連接的環(huán)，在一些情況下形成β_片層結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈中的⑶R被框架區(qū)固定緊靠其他鏈的⑶R，這樣形成了抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(E.A. Kabatet al. , Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第五版，1991，NIH)。 “恒定(constant region)區(qū)”不直接參與抗體與抗原的結(jié)合,但顯示多種效應(yīng)子功能，如抗體參與的抗體依賴性細(xì)胞毒性。人源化My9_6抗體My9_6的人源化版本(Humanized versions of My9_6),在本文中有不同名稱“huMy9-6”，和“人源化My9-6”，也已制備得到。人源化的目標(biāo)是減少異種抗體如鼠抗體的免疫原性，用于導(dǎo)入進(jìn)人體內(nèi)后，在保持抗體的全部抗原結(jié)合親和性和特異性的同時(shí)減少免疫原性。人源化抗體可采用若干技術(shù)來產(chǎn)生,如表面重整(resurfacing)和⑶R嫁接(⑶Rgrafting)技術(shù)。如在此所使用的，表面重整技術(shù)綜合使用分子建模，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和誘變，以便改變抗體可變區(qū)的非CDR表面，從而模擬目標(biāo)宿主的已知抗體的表面。抗體的表面重整的策略和方法，和在不同的宿主中減少抗體免疫原性的其他方法，公開在美國專利5，639，641 (Pedersen等人)中，在此整體引入，作為參考。簡(jiǎn)言之，在一個(gè)優(yōu)選方法中，(I)生成許多抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的位點(diǎn)對(duì)比，得到一組重鏈和輕鏈可變區(qū)框架表面暴露位點(diǎn)，其中所有可變區(qū)的對(duì)比位點(diǎn)至少大約98%是相同的；(2)針對(duì)嚙齒類抗體(或其片段)確定一組重鏈和輕鏈可變區(qū)框架表面暴露的氨基酸殘基；(3)鑒定與該組嚙齒類表面暴露氨基酸殘基最相似的一組重鏈和輕鏈可變區(qū)框架表面暴露氨基酸殘基；
(4)步驟(2)中確定的該組重鏈和輕鏈可變區(qū)框架表面暴露氨基酸殘基被步驟(3)中鑒定的該組重鏈和輕鏈可變區(qū)框架表面暴露氨基酸殘基替代，除了那些位于該嚙齒類抗體的互補(bǔ)決定區(qū)的任何殘基的任何原子的5A范圍內(nèi)的氨基酸殘基；和(5)產(chǎn)生具有結(jié)合特異性的人源化嚙齒類抗體。可以使用多種其他的技術(shù)對(duì)抗體進(jìn)行人源化，包括CDR嫁接(EP0239400 ；WO 91/09967 ;美國專利 5，530，101 ;和 5，585，089)，鑲飾(veneering)或表面重整(EP0592106 ；EP 0519596 ；Padlan E.A. , 1991, Molecular Immnunology 28 (4/5):489-498 ；Studnicka G. M. et al. ,1994, Protein Engineering 7(6):805-814 ;Roguska M.A.etal.，1994，PNAS 91:969-973)，和鏈改組(chain shuffling)(美國專利 No. 5，565，332)。人抗體可通過本領(lǐng)域中已知的多種方法來制備，包括噬菌體展示法。也參見美國專利 No. 4，444，887 ;4，716，111 ;5，545，806 和 5，814，318 ;和國際專利申請(qǐng)公開號(hào) WO98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735 和 W91/10741 (所述文獻(xiàn)整體參考并入,作為參考)。如本文中進(jìn)一步描述地，通過建模鑒定My9_6的⑶R，并預(yù)測(cè)它的分子結(jié)構(gòu)。然后制備人源化My9-6抗體,其序列已經(jīng)被完全表征。許多huMy9-6抗體的輕鏈和重鏈的氨基酸序列，被顯示在圖16A和16B中。鼠和人源化My9-6抗體的比較結(jié)合值，被提供在圖17中。抗體的結(jié)合曲線顯示在圖18中。My9-6抗體的抗原決定簇結(jié)合片段盡管鼠My9_6抗體和人源化My9_6抗體的抗原決定簇結(jié)合片段在此與鼠My9_6抗 體和人源化版本分別進(jìn)行討論，但要理解的是本發(fā)明的術(shù)語“抗體(antibody)”或“多種抗體(antibodies)”可包含全長的muMy9_6和huMy9_6抗體，以及這些抗體的抗原決定簇結(jié)合片段。如本文中所使用的，“抗體片段”包括保留了與CD33結(jié)合的能力的抗體的任何部分，通常稱為“抗原決定簇結(jié)合片段”。抗體片段的實(shí)例優(yōu)選包括但不限于，F(xiàn)ab、Fab’和F(ab' )2、Fd、單鏈Fvs (scFv)、單鏈抗體,二硫鍵連接的Fv(sdFv)和含有\(zhòng)或Vh結(jié)構(gòu)域的片段。抗原決定簇結(jié)合片段，包括單鏈抗體，可單獨(dú)包含可變區(qū)或組合了下列的一部分或全部結(jié)構(gòu)域。這種片段可含有一個(gè)或兩個(gè)Fab片段或F (ab’)2片段。優(yōu)選地，抗體片段含有整個(gè)抗體的所有6個(gè)⑶R，盡管含有少于所有這些區(qū)域的片段，如三個(gè)，四個(gè)或5個(gè)⑶R，也是有功能的。更進(jìn)一步，功能等價(jià)物可能是下列任何一種免疫球蛋白類型的成員或它們的組合IgG、IgM、IgA、IgD、或 IgE,及其亞型。Fab和F (ab’) 2片段可通過使用酶進(jìn)行蛋白水解裂解而產(chǎn)生，使用的酶如木瓜蛋白酶(Fab片段)或胃蛋白酶(F(ab’)2片段)。單鏈FV(scFv)片段是抗原決定簇結(jié)合片段，其含有與抗體輕鏈可變區(qū)的至少一個(gè)片段連接的抗體重鏈可變區(qū)(Vh)的至少一個(gè)片段。連接子可以選擇短的，柔性的肽，以保證和(Vh)區(qū)域一旦連接就形成合適的三維折疊，以維持全抗體的靶分子結(jié)合特異性，而單鏈抗體片段來源于該全抗體。或(Vh)序列的羧基末端可通過連接子共價(jià)連接于互補(bǔ)的和(Vh)序列的氨基酸末端。單鏈抗體片段可通過分子克隆，抗體噬菌體展示文庫或?qū)I(yè)技術(shù)人員熟知的類似技術(shù)來產(chǎn)生。這些蛋白可在例如真核細(xì)胞或原核細(xì)胞，包括細(xì)菌中產(chǎn)生。本發(fā)明的抗原決定簇結(jié)合片段也可使用本領(lǐng)域中已知的多種噬菌體展示法來產(chǎn)生。在噬菌體展示方法中，功能性抗體結(jié)構(gòu)區(qū)被展示在攜帶編碼它們的多核苷酸序列的噬菌體顆粒的表面上。特別的是，這種卩遼菌體可用來展示從抗體譜(repertoire)或組合抗體文庫(例如，人或鼠)表達(dá)的抗原決定簇結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)。表達(dá)可結(jié)合目的抗原的抗原決定簇結(jié)合結(jié)構(gòu)域的噬菌體可用抗原選擇或鑒定，例如使用標(biāo)記的CD33或被結(jié)合或俘獲到固體表面或珠上的⑶33。用于這些方法中的噬菌體通常的是絲狀噬菌體，包括fd和M13，結(jié)合結(jié)構(gòu)域由具有重組融合到噬菌體基因III或基因VIII蛋白的Fab、Fv或二硫鍵固定的Fv抗體結(jié)構(gòu)域的噬菌體表達(dá)。
可用來制備本發(fā)明的抗原決定簇結(jié)合片段的噬菌體展示方法的實(shí)例包括在下列文獻(xiàn)中公開的方法Brinkmanet al.，1995, J. Immunol. Methodsl82:41-50 ；Ameset al. ,1995,J. Tmmunol. Methods 184:177-186 ;Kettleboroughet al. ,1994,Eur.J. Immunol.24:952-958 ；Persicet al. , 1997,Gene 187:9-18 ；Burtonet al.,1994, Advances in Immunology 57:191-280 ;PCT 申請(qǐng) No. PCT/GB91/01134 ;PCT 公布WO 90/02809 ；W0 91/10737 ；W0 92/01047 ；W0 92/18619 ；W0 93/11236 ；W0 95/15982 ；W095/20401 ;和美國專利 No. 5，698，426 ；5, 223，409 ；5, 403，484 ；5, 580，717 ；5, 427，908 ；5，750，753 ；5, 821，047 ；5, 571，698 ；5, 427，908 ；5, 516，637 ；5, 780，225 ；5, 658，727 ；5，733，743和5,969，108，每一篇文獻(xiàn)整體引入本文，作為參考。噬菌體篩選后，編碼片段的噬菌體的 區(qū)域可被分離，并通過使用重組DNA技術(shù)，例如在下面所詳述的，在被選擇的宿主中表達(dá)來產(chǎn)生抗原決定簇結(jié)合片段，宿主包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母和細(xì)菌，。例如，重組產(chǎn)生Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技術(shù)也可應(yīng)用，使用本領(lǐng)域已知的方法，如在PCT公布WO 92/22324 ；Mullinaxet al.，1992,BioTechniques 12 (6):864-869 ;Sawaiet al.,1995, AJRI 34:26-34;和 Betteretal.，1988，Science 240:1041-1043中所公開的方法；所述文獻(xiàn)整體引入本文，作為參考。用來產(chǎn)生單鏈Fv和抗體的技術(shù)的例子包括那些在美國專利No. 4，946，778和5, 258, 498 ；Hustonet al. ,1991, Methods in Enzymology203:46-88 ；Shuet al. ,1993,PNAS 90:7995-7999 ；Skerraet al.，1988，Science240:1038-1040 中所描述的。功能等價(jià)物(functionalequivalents)也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是My9_6抗體和人源化My9_6抗體的功能等價(jià)物(functional equivalent)。術(shù)語“功能等價(jià)物”包括具有同源序列的抗體,嵌合的抗體，修飾抗體和人工抗體，例如，其中規(guī)定了每個(gè)功能等價(jià)物具有結(jié)合CD33的能力。專業(yè)技術(shù)人員將會(huì)理解在稱為“抗體片段(antibody fragments)”的一組分子和稱為“功能等價(jià)物”的
一組分子中是有重疊的。具有同源序列的抗體是具有與本發(fā)明的鼠My9-6和人源化My9_6抗體的氨基酸序列具有序列同一性或同源性的氨基酸序列的抗體。優(yōu)選與本發(fā)明的鼠My9-6和人源化My9-6抗體的可變區(qū)氨基酸序列具有同一'丨生。“序列同一'丨生(sequence identity)”和“序列同源性(sequence homology)”當(dāng)用于本文的氨基酸序列時(shí)，被規(guī)定為與另一條氨基酸序列具有至少大約90%、91%、92%、93%或94%的序列同一性，更優(yōu)選至少大約95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的序列，同一性例如根據(jù)Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 85, 2444-2448(1988)通過 FASTA 搜索法測(cè)定。如本文中所使用的，嵌合抗體是其中抗體的不同部分來自不同動(dòng)物種的抗體。例如，含有來自鼠單克隆抗體的可變區(qū)的抗體與人免疫球蛋白恒定區(qū)配對(duì)。產(chǎn)生嵌合抗體的方法在本領(lǐng)域中是已知的。見，例如，Morrison, 1985，Science 229:1202 ；0iet al.,1986, BioTechniques 4:214 ；Gillieset al. , 1989,J.Tmmunol. Methods 125:191-202 ;美國專利No. 5，807，715 ；4, 816，567 ;和4，816，397，在此整體引入本文，作為參考。人工抗體包括scFv片段、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體和mru (見Winter, G.and Milstein,C. , 1991, Nature 349:293-299 ；Hudson,P. J. , 1999, Current Opinion inImmunology 11:548-557的綜述)，每種都具有抗原結(jié)合能力。在單鏈Fv片段(scFv)中，抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)區(qū)被一個(gè)可變形肽連接。一般這種連接子肽大約15個(gè)氨基酸殘基長。如果該連接子更小，例如，5個(gè)氨基酸,可形成雙鏈抗體，其是二價(jià)scFv 二聚體。如果連接子減少到少于3個(gè)氨基酸殘基，可形成三聚和四聚體結(jié)構(gòu)，稱為三鏈抗體和四鏈抗體。抗體的最小結(jié)合單位是CDR，一般是具有足夠特異性識(shí)別和結(jié)合能力的重鏈CDR2，其可單獨(dú)使用。這樣一個(gè)片段被稱為分子識(shí)別單位或mru。幾個(gè)這種mru可用短的連接肽連接在一起，因而形成了具有較單個(gè)mru更高親和力的人工結(jié)合蛋白。本申請(qǐng)的功能等價(jià)物也包括修飾抗體，例如通過任何類型的分子共價(jià)附著于抗體上而對(duì)抗體進(jìn)行修飾的抗體。例如,修飾的抗體包括已經(jīng)被下述方法修飾的抗體例如被糖基化，乙酰化，聚乙二醇化(pegylation)，磷酸化，酰胺化，通過已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)衍生作用，蛋白水解裂解，與細(xì)胞配體或其他蛋白連接，等等。共價(jià)附著不會(huì)阻止抗體產(chǎn)生抗獨(dú)特型(anti-idiotypic)應(yīng)答。這些修飾作用可通過已知的技術(shù)來完成,包括但不限于，特異化學(xué)性裂解，乙酰化，甲酰化，衣霉素的代謝合成，等等。另外，被修飾的抗體可含有I個(gè)或更多個(gè)非典型氨基酸(non-classical amino acids)。
通過在不同的框架內(nèi)、不同的鏈上互相交換不同的⑶R產(chǎn)生功能等同物。因此，例如，對(duì)于指定組的CDR可通過取代不同的重鏈可能形成不同類型的抗體，由此，例如IgG^IgM、IgA"、IgD、IgE抗體類型和同型抗體可被產(chǎn)生。同樣，在本發(fā)明范圍內(nèi)的人工抗體可通過將給定的一組⑶R嵌入進(jìn)整個(gè)合成框架區(qū)中而產(chǎn)生。功能等價(jià)物很容易在特定組CDR側(cè)向的可變區(qū)和/或恒定區(qū)序列內(nèi)使用本領(lǐng)域中已知的多種方法通過突變，刪除和/或插入來產(chǎn)生。本發(fā)明的抗體片段和功能等價(jià)物包括與鼠My9_6抗體相比，與⑶33的結(jié)合達(dá)到可檢測(cè)程度的分子。結(jié)合的可檢測(cè)程度包括鼠My9-6抗體與⑶33結(jié)合能力的至少10-100%范圍內(nèi)的所有值，優(yōu)選至少50%、60%或70%，更優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%、95%或99%。改良抗體(improvedantibodies)⑶R對(duì)抗原決定簇識(shí)別和抗體結(jié)合具有首要的重要性。但是，對(duì)于包括⑶R的殘基可進(jìn)行一些改變，而影響抗體識(shí)別和結(jié)合其同類抗原決定簇的能力。例如，可以制造不影響抗原決定簇識(shí)別，但增加抗體與抗原決定簇的結(jié)合親和性的改變。因此，也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的是改良形式的鼠和人源化抗體，它們也特異性識(shí)別和結(jié)合CD33，優(yōu)選具有增加的親和性。幾個(gè)研究已經(jīng)調(diào)查了抗體序列中不同位點(diǎn)上引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變的影響，這基于對(duì)原始抗體序列和其特性如結(jié)合和表達(dá)水平的了解(Yang，W. P. et al.,1995，J. Mol. Biol.，254，392-403 ；Rader, C. et al.，1998，Proc. Natl. Acad. Sci.USA，95，8910-8915 ；Vaughan, T. J. et al.，1998，Nature Biotechnology, 16，535-539)。在這些研究中，已經(jīng)通過改變⑶R1、⑶R2、⑶R3或框架區(qū)內(nèi)重鏈和輕鏈基因序列產(chǎn)生了原始抗體的等價(jià)物，使用的方法如寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變、盒式誘變、易錯(cuò)PCR、DNA改組或大腸桿菌的突變株(Vaughan, T. J. et al. , 1998, NatureBiotechnology, 16，535-539 ;Adey, N. B.等人·，1996，第 16 章，277-291 頁，見“肽類和蛋白的曬菌體展示”，主編，Kay, B. K.等人，Academic Press)。改變?cè)伎贵w序列的這些方法已使二級(jí)抗體的親和性改善(Gram, H. et al.，1992, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 89，3576-3580 ；Boder, E. T. et al.，2000，Proc. Natl. Acad Sci. USA,97，10701-10705 ；Davies, J. and Riechmannj L.，1996，Immuno techno Igy, 2，169-179 ；Thompson, J. et al.，1996，J. Mol. Biol.，256，77-88 ；Short, M. K. etal.，2002，J. Biol. Chem.，277，16365-16370 ；Furukawaj K. et al.，2001，J Biol. Chem.，276，27622-27628)。通過改變抗體的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的類似的定向策略，在此描述的抗體序列可用來開發(fā)具有改進(jìn)功能，包括與CD33改進(jìn)的親和性，的抗CD33抗體。改良的抗體也包括具有改良特性的抗體，其可通過標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物免疫，雜交瘤形成和具有特殊特性的抗體的選擇技術(shù)來制備。免疫偶聯(lián)物(immunoconjugates)
本發(fā)明也涉及免疫偶聯(lián)物，包括本文中所公開的與藥物或前體藥物連接的抗體、抗體片段、功能等價(jià)物、改良抗體及其類似物。優(yōu)選的藥物或前體藥物是細(xì)胞毒性劑，并包括例如美登木素生物堿和美登木素生物堿類似物、紫杉醇、CC-1065和CC-1065類似物，海兔毒肽和海兔毒肽類似物。免疫偶聯(lián)物可通過體外方法制備。為了將藥物或前體藥物與抗體連接，可使用連接基團(tuán)。合適的連接基團(tuán)在本領(lǐng)域中是為人所熟知的，包括二硫化物基團(tuán)、硫醚基團(tuán)、酸不穩(wěn)定基團(tuán)、光不穩(wěn)定基團(tuán)、肽酶不穩(wěn)定基團(tuán)和酯酶不穩(wěn)定基團(tuán)。優(yōu)選的連接基團(tuán)是二硫化物基團(tuán)和硫醚基團(tuán)。例如,可使用二硫化物交換反應(yīng)(disulfide exchange reaction)或通過在抗體和藥物或前體藥物之間形成硫醚鍵構(gòu)建偶聯(lián)物。美登木素生物堿和美登木素生物堿類似物是優(yōu)選的細(xì)胞毒劑之一。合適的美登木素生物堿的例子包括美登木醇和美登木醇類似物。合適的美登木素生物堿公開在美國專利 No. 4，424，219 ;4，256，746 ;4，294，757 ;4，307，016 ;4，313，946 ;4，315，929 ;4，331，598 ；4，361，650 ;4，362，663 ;4，364，866 ;4，450，254 ;4，322，348 ;4，371，533 ;6，333，410 ；5，475，092 ;5，585，499 ;和 5，846，545 中。關(guān)于美登木素生物堿，連接基團(tuán)可包含反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)可通過一個(gè)二硫鍵連接部分與美登木素生物堿共價(jià)結(jié)合。特別優(yōu)選的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)是N-琥拍酰亞胺酯(N-succinimidyl ester)和N-磺基玻拍酸亞胺酯(N-sulfosuccinimidyl ester)。特別優(yōu)選的包含連接基團(tuán)的美登木素生物堿是美登木醇的C-3酯及其類似物，上述連接基團(tuán)中含有反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)，其中連接部分含有二硫鍵，化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)包括N-琥珀酰亞胺酯或N-磺基琥珀酰亞胺酯。美登木素生物堿上的許多位點(diǎn)可作為化學(xué)性連接連接部分的位點(diǎn)。例如，具有羥基基團(tuán)的C-3位點(diǎn)、用羥甲基修飾的C-14位點(diǎn)、用羥基修飾的C-15位點(diǎn)和具有羥基的C-20位點(diǎn)均被認(rèn)為是有用的。但C-3位點(diǎn)是優(yōu)選的，美登木醇的C-3位點(diǎn)是特別優(yōu)選的。其他的化學(xué)鍵包括酸不穩(wěn)定鍵，光不穩(wěn)定鍵，肽酶不穩(wěn)定鍵和酯酶不穩(wěn)定鍵。并入本文的美國專利No. 5，208，020的公開內(nèi)容，教導(dǎo)了攜帶這些鍵的美登木素生物堿的生產(chǎn)。如在下面所詳述的，免疫偶聯(lián)物My9-6_DM1使用含硫醇的美登木素生物堿(DMl)。DMl由下面的結(jié)構(gòu)分子式(I)表示
權(quán)利要求
1.一種分離的抗體或其抗原決定簇-結(jié)合片段，包括至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)，所述互補(bǔ)決定區(qū)具有選自SEQ ID NO :1-6中的氨基酸序列，并具有與⑶33結(jié)合的能力。
2.一種免疫-偶聯(lián)物，包括與藥物或前體藥物連接的權(quán)利要求I所述的抗體或其抗原決定簇-結(jié)合片段。
3.權(quán)利要求2的免疫-偶聯(lián)物，其中所述的藥物或前體藥物選自美登木素生物堿、紫杉醇、CC-1065、CC-1065類似物、海兔毒肽、海兔毒肽類似物、氨甲喋呤、道諾紅菌素、阿霉素、長春花新堿、長春花堿、苯丙氨酸氮芥、絲裂霉素C、苯丁酸氮芥、加利車霉素及它們的衍生物。
4.一種組合物，包括權(quán)利要求I所述的抗體或其抗原決定簇-結(jié)合片段和藥物或前體藥物。
5.一種藥學(xué)組合物，包括權(quán)利要求I所述的抗體或其抗原決定簇-結(jié)合片段，以及藥學(xué)上可接受試劑。
6.一種藥學(xué)組合物，包括權(quán)利要求2所述的免疫-偶聯(lián)物，以及藥學(xué)上可接受試劑。
7.—種藥學(xué)組合物，包括權(quán)利要求4所述的組合物，以及藥學(xué)上可接受試劑。
8.—種診斷試劑，包括權(quán)利要求I所述的抗體，其中所述的抗體或抗體片段是被標(biāo)記的。
9.權(quán)利要求8的診斷試劑，其中所述的標(biāo)記選自生物素標(biāo)記，酶標(biāo)記，放射性標(biāo)記，熒光基團(tuán)，發(fā)色團(tuán)，顯影劑和金屬離子。
10.一種體外抑制表達(dá)CD33的細(xì)胞之生長的方法，包括將所述的細(xì)胞與權(quán)利要求I所述的抗體或其抗原決定簇-結(jié)合片段接觸。
11.一種體外抑制表達(dá)CD33的細(xì)胞之生長的方法，包括將所述的細(xì)胞與權(quán)利要求2所述的免疫-偶聯(lián)物接觸。
12.—種體外抑制表達(dá)CD33的細(xì)胞之生長的方法，包括將所述的細(xì)胞與權(quán)利要求4所述的組合物接觸。
13.—種體外抑制表達(dá)CD33的細(xì)胞之生長的方法，包括將所述的細(xì)胞與選自權(quán)利要求5、6、或7其中之一所述藥學(xué)組合物接觸。
14.權(quán)利要求I所述的抗體或其抗原決定簇-結(jié)合片段在制備用于治療患有其中表達(dá)CD33的疾病的受試對(duì)象的藥物中的用途。
15.權(quán)利要求2所述的免疫-偶聯(lián)物在制備用于治療患有其中表達(dá)CD33的疾病的受試對(duì)象的藥物中的用途。
16.權(quán)利要求4所述的組合物在制備用于治療患有其中表達(dá)⑶33的疾病的受試對(duì)象的藥物中的用途。
17.權(quán)利要求5所述的藥學(xué)組合物在制備用于治療患有其中表達(dá)⑶33的疾病的受試對(duì)象的藥物中的用途。
18.權(quán)利要求6所述的藥學(xué)組合物在制備用于治療患有其中表達(dá)⑶33的疾病的受試對(duì)象的藥物中的用途。
19.權(quán)利要求7所述的藥學(xué)組合物在制備用于治療患有其中表達(dá)⑶33的疾病的受試對(duì)象的藥物中的用途。
20.權(quán)利要求I所述的抗體或其抗原決定簇-結(jié)合片段在制備用于治療患有其中表達(dá)CD33的疾病的受試對(duì)象的藥物中的用途，其中所述藥物被離體使用，包括將所述受試對(duì)象的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞離體接觸有效量的所述藥物。
21.權(quán)利要求2所述的免疫-偶聯(lián)物在制備用于治療患有其中表達(dá)CD33的疾病的受試對(duì)象的藥物中的用途，其中所述藥物被離體使用，包括將所述受試對(duì)象的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞離體接觸有效量的所述藥物。
22.權(quán)利要求4所述的組合物在制備用于治療患有其中表達(dá)⑶33的疾病的受試對(duì)象的藥物中的用途，其中所述藥物被離體使用，包括將所述受試對(duì)象的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞離體接觸有效量的所述藥物。
23.選自權(quán)利要求5、6、或7其中之一所述的藥學(xué)組合物在制備用于治療患有其中表達(dá)CD33的疾病的受試對(duì)象的藥物中的用途，其中所述藥物被離體使用，包括將所述受試對(duì)象的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞離體接觸有效量的所述藥物。
24.權(quán)利要求14中的用途，其中所述疾病選自骨髓增生異常綜合癥(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細(xì)胞性白血病(PML)。
25.權(quán)利要求15中的用途，其中所述的疾病選自骨髓增生異常綜合癥(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細(xì)胞性白血病(PML)。
26.權(quán)利要求16中的用途，其中所述的疾病選自骨髓增生異常綜合癥(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細(xì)胞性白血病(PML)。
27.權(quán)利要求17中的用途，其中所述的疾病選自骨髓增生異常綜合癥(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細(xì)胞性白血病(PML)。
28.權(quán)利要求18中的用途，其中所述的疾病選自骨髓增生異常綜合癥(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細(xì)胞性白血病(PML)。
29.權(quán)利要求19中的用途，其中所述的疾病選自骨髓增生異常綜合癥(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細(xì)胞性白血病(PML)。
30.權(quán)利要求20中的用途，其中所述的疾病選自骨髓增生異常綜合癥(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細(xì)胞性白血病(PML)。
31.權(quán)利要求21中的用途，其中所述的疾病選自骨髓增生異常綜合癥(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細(xì)胞性白血病(PML)。
32.權(quán)利要求22中的用途，其中所述的疾病選自骨髓增生異常綜合癥(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細(xì)胞性白血病(PML)。
33.權(quán)利要求23中的用途，其中所述的疾病選自骨髓增生異常綜合癥(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細(xì)胞性白血病(PML)。
34.權(quán)利要求8所述的診斷試劑在制備用于測(cè)定生物樣品中是否含有骨髓性癌細(xì)胞的藥物中的用途。
35.權(quán)利要求34的用途，其中所述癌癥選自急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓細(xì)胞性白血病(PML)。
36.一種分離的多核苷酸，編碼權(quán)利要求I所述的抗體或其抗原決定簇-結(jié)合片段。
37.一種分離的多核苷酸，編碼權(quán)利要求I所述的抗體或其抗原決定簇-結(jié)合片段的輕鏈或重鏈。
38.一種重組載體,含有權(quán)利要求36所述的多核苷酸。
39.一種重組載體,含有權(quán)利要求37所述的多核苷酸。
40.一種宿主細(xì)胞，用權(quán)利要求38所述的重組載體轉(zhuǎn)化。
41.一種宿主細(xì)胞，用權(quán)利要求39所述的重組載體轉(zhuǎn)化。
42.一種用于產(chǎn)生具有結(jié)合CD33能力的抗體或其抗原決定簇-結(jié)合片段的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)一種權(quán)利要求40所要求保護(hù)的宿主細(xì)胞，在所述宿主細(xì)胞表達(dá)抗體或抗原決定簇-結(jié)合片段的條件下，和(b)收集如此表達(dá)的抗體或抗原決定簇-結(jié)合片段。
43.一種用于產(chǎn)生具有結(jié)合CD33能力的抗體或其抗原決定簇-結(jié)合片段的方法，所述的方法包括(a)培養(yǎng)權(quán)利要求41的宿主細(xì)胞，在所述宿主細(xì)胞表達(dá)抗體或抗原決定簇-結(jié)合片段的條件下，和(b)收集如此表達(dá)的抗體或抗原決定簇-結(jié)合片段。
44.一種用于從生物材料中獲得⑶33的方法，所述方法包括 (a)將生物材料與權(quán)利要求I所述的抗體或抗原決定簇-結(jié)合片段接觸， (b)允許權(quán)利要求I所述的抗體或抗原決定簇-結(jié)合片段與所述生物材料中的CD33結(jié)合，和 (c)從該生物材料中分離與CD33結(jié)合的抗體或抗原決定簇-結(jié)合片段，從而從生物材料中獲得CD33。
45.一種藥學(xué)組合物，包括抗體以及藥學(xué)上可接受試劑，其中所述抗體具有與⑶33結(jié)合的能力，包括至少一個(gè)重鏈可變區(qū)和至少一個(gè)輕鏈可變區(qū)， 其中所述重鏈可變區(qū)由SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :9所示的氨基酸序列組成，和 其中所述輕鏈可變區(qū)由SEQ ID NO :8或SEQ ID NO : 10所示的氨基酸序列組成。
46.一種體外抑制表達(dá)CD33的細(xì)胞之生長的方法，包括將所述的細(xì)胞與權(quán)利要求45所述的抗體接觸。
47.一種體外抑制表達(dá)CD33的細(xì)胞之生長的方法，包括將所述的細(xì)胞與權(quán)利要求45所述藥學(xué)組合物接觸。
48.一種特異性結(jié)合CD33的改良抗體，所述的改良抗體或抗體片段如下制備 (a)提供DNA，其編碼抗體或其抗原決定簇-結(jié)合片段，其包括SEQID NO: 7和SEQ IDNO:8中的至少一個(gè)； (b)將至少一個(gè)核苷酸突變、刪除、插入或添加引入到所述DNA中，以致由所述DNA編碼的所述抗體或抗原決定簇-結(jié)合片段的氨基酸序列被改變； (c)表達(dá)所述抗體或抗原決定簇-結(jié)合片段； (d)篩選所述被表達(dá)抗體或抗原決定簇-結(jié)合片段的所述改良，從而制備改良抗體或抗原決定簇-結(jié)合片段。
49.一種特異性結(jié)合CD33的改良抗體，所述的改良抗體或抗體片段如下制備 (a)提供DNA，其編碼抗體或其抗原決定簇-結(jié)合片段，其包括SEQID NO:9和SEQ IDNO: 10中的至少一個(gè)， (b)將至少一個(gè)核苷酸突變、刪除、插入或添加引入到所述的DNA中，以致由所述DNA編碼的所述抗體或抗原決定簇-結(jié)合片段的氨基酸序列被改變； (c)表達(dá)所述抗體或抗原決定簇-結(jié)合片段； (d)篩選所述被表達(dá)抗體或抗原決定簇-結(jié)合片段的所述改良，從而制備改良抗體或抗原決定簇-結(jié)合片段。
50.權(quán)利要求48或49的改良抗體或抗體片段，其中所述的改良是對(duì)CD33的親和性增加。
51.權(quán)利要求48或49的改良抗體或抗體片段，其中所述的至少一個(gè)核苷酸突變、刪除、插入或添加可通過選自下列的方法來完成寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變、盒式誘變、易錯(cuò)PCR、DNA改組和應(yīng)用大腸桿菌增變株。
52.一種抗體，其具有與⑶33結(jié)合的能力，包括至少一個(gè)重鏈可變區(qū)和至少一個(gè)輕鏈可變區(qū)，其中所述的重鏈可變區(qū)包括三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)，所述互補(bǔ)決定區(qū)分別具有SEQ IDNO :1-3所示的氨基酸序列， 并且其中所述的輕鏈可變區(qū)包括三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)，所述互補(bǔ)決定區(qū)分別具有SEQ IDNO :4-6所示的氨基酸序列， 其中所述抗體具有與選自muMy9-6、人源化My9_6和huMy9_6Vl. O至huMy9_6Vl. 15的My9-6抗體具有相同的結(jié)合特異性。
53.權(quán)利要求52的抗體，其中所述的重鏈可變區(qū)與SEQID NO :7所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性，并具有與⑶33結(jié)合的能力。
54.權(quán)利要求52的抗體，其中所述的重鏈可變區(qū)與SEQID NO :7所示的所述氨基酸序列具有至少95%的序列同一性，并具有與CD33結(jié)合的能力。
55.權(quán)利要求52的抗體，其中所述的重鏈可變區(qū)具有SEQIDNO 7所示的氨基酸序列。
56.權(quán)利要求52的抗體，其中所述的輕鏈可變區(qū)與SEQID NO :8所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性，并具有與⑶33結(jié)合的能力。
57.權(quán)利要求52的抗體，其中所述的輕鏈可變區(qū)與SEQID NO :8所示的所述氨基酸序列具有至少95%的序列同一性，并具有與CD33結(jié)合的能力。
58.權(quán)利要求52的抗體，其中所述的輕鏈可變區(qū)具有SEQIDNO :8所示的氨基酸序列。
59.權(quán)利要求52的抗體，其中所述的重鏈可變區(qū)與SEQID NO :9所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
60.權(quán)利要求52的抗體，其中所述的重鏈可變區(qū)與SEQID NO:9所示的所述氨基酸序列具有至少95%的序列同一性。
61.權(quán)利要求52的抗體，其中所述的重鏈可變區(qū)具有SEQIDNO :9所示的氨基酸序列。
62.權(quán)利要求52的抗體，其中所述的輕鏈可變區(qū)與SEQID NO : 10所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
63.權(quán)利要求52的抗體，其中所述的輕鏈可變區(qū)與SEQID NO 10所示的所述氨基酸序列具有至少95%的序列同一性。
64.權(quán)利要求52的抗體，其中所述的輕鏈可變區(qū)具有SEQIDNO :10所示的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及結(jié)合CD33的抗體。更特別地是，本發(fā)明涉及抗CD33抗體，所述抗體的片段和同源物，所述抗體的人源化和表面重整形式，所述抗體的功能等價(jià)物和改良形式，含有所述抗體的免疫偶聯(lián)物和組合物，及其在診斷、研究和治療中的應(yīng)用。本發(fā)明也涉及編碼該抗體的多核苷酸，含有該多核苷酸的載體，用多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及制備該抗體的方法。
文檔編號(hào)A61K39/44GK102875680SQ20121036246
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2003年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月7日
發(fā)明者M·G·霍費(fèi), D·塔瓦雷斯, R·J·盧茨 申請(qǐng)人:伊謬諾金公司