專利名稱：L-抗壞血酸在制備拮抗發形霞水母毒素細胞毒性效應藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，具體是指L-抗壞血酸在制備預防或治療發形霞水母蜇傷藥物中的應用，進一步地，L-抗壞血酸在制備拮抗發形霞水母毒素細胞毒性效應藥物中的應用。
背景技術：
水母種類多，種間差異大，生物多樣性豐富。水母一詞是個泛稱，不具嚴格的分類學意義，泛指具水母型(鐘形或碟形)的刺胞動物，是一類非常原始的海洋無脊椎浮游動物，分類學上隸屬刺胞動物門(亦稱腔腸動物門)。水母種類超過200種，在長達5 7億年的進化過程中形成了至少四個大類，即水螅綱(Hydrozoa)、十字水母綱(Staurozoa)、立方水母
綱(Cubozoa)以及缽水母綱(Scyphozoa)。我國東南沿海的主要致傷水母-缽水母綱的
發形霞水母(Cyanea capillata)屬于大型水母,傘部直徑100-850毫米,扁平呈圓盤狀,夕卜傘中央具許多刺胞。8個感覺器位于8個淺凹緣之間的底部，感覺棒梭形，其遠端具一豆形平衡囊，沒有眼點。下傘的縱輻位上，有8束排列U字形的觸手，每束觸手數目很多，通常較粗大的觸手近于傘中，細小的靠近傘緣，下傘具輻肌束與環肌束。口腕發達，其長度超過傘半徑。活體呈乳白色或褐色。在全世界各沿海海域均廣泛分布。水母蜇傷是世界上最常見的海洋生物傷，近年來隨著水母爆發性增長而不斷增多，每年被水母蜇傷的患者數以十萬計。水母蜇傷的中毒癥狀差異明顯。以心血管系統毒性為例，不同水母蜇傷后會導致不同的心血管中毒癥狀，比如部分立方水母綱水母如Carybdea rastonii、Carukia barnesi等蜇傷后可以引起血管收縮、心率增加、血壓升高，嚴重蜇傷者導致心衰、休克甚至死亡，而另一些立方水母綱水母Chironex fleckeri、Chiropsella bronzie>Chiropsalmus quadrigatus等則可以引起心動過緩、血壓下降甚至休克死亡等嚴重癥狀。而發形霞水母毒素可以引起血管收縮、心動過緩等心血管毒性癥狀(參見文獻Xiao L, Liu GS, Wang QQ, He Q, Liu SH, Li Y, Zhang J, Zhang LM:The lethalityoftentacle-only extract from jellyfish Cyanea capillata is primarily attributedto cardiotoxicity in anaesthetized SD rats[J]. Toxicon 2010，55(4):838-845. X水母毒素是一類結構新穎、毒性極強的肽類毒素，含有損傷心血管、神經和呼吸等系統功能的多種生物活性組分，其中細胞毒性組分被認為是水母毒素發揮毒性作用的主要物質基礎，所報道的水母毒素都可產生細胞毒性效應。水母毒素的細胞毒性組分可以造成實驗動物和人體廣泛的非特異性損傷。如溶血反應、體內水電解質酸堿平衡的紊亂以及心、肝、腎等重要臟器的功能與器質性損傷等(參見文獻Xiao L1LiuS，He Q, et al. The acute toxicity and hematological characterization of theeffects of tentacle-only extract from the jellyfish Cyanea capillata[J].Mar Drugs, 2011，9:526-534;Xiao L, Zhang J, Wang Q, et al. In vitro and in vivohaemolytic studies of tentacle-only extract from jellyfish Cyanea capillata[J].Toxicol In Vitro, 2010，24:1203-1207.)。除了非特異性的細胞毒性組分外，水母毒素中還存在著特異性作用于心臟等靶器官的毒性組分。當去除細胞毒性組分后，水母毒素導致的心臟損傷程度明顯減輕，說明非特異性的細胞毒性組分與特異性的作用于特定臟器的毒性組分之間具有協同效應，共同造成了某些特定臟器的損傷(參見文獻Xiao L, Wang B, Li Y, et al. Cardiovascular effect is independent of hemolytictoxicity of tentacle-only extract from the jellyfish Cyanea capillata[J]. PloSone,2012, 7:e43096.)。總之，拮抗水母毒素中細胞毒性組分產生的非特異損傷效應是預防和治療水母蜇傷中毒的重要策略。水母毒素細胞毒性組分的作用機理尚不明確，有研究表明細胞毒性組分可能通過破壞細胞膜，引起細胞內外環境失衡而發揮毒性效應，提出了磷脂酶活性與孔道形成等機制(參見文獻 Edwards L P, Whitter E, Hessinger D A. Apparent membrane
pore-formation by Portuguese Man-of-war(Physalia physalis)venom in intactcultured cells [J].Toxicon, 2002, 40:1299-1305;Helmholz H,Ruhnau C, SchuttC, Prange A. Comparative study on the cell toxicity and enzymatic activity of twonorthern scyphozoan species Cyanea capillata(L. ) and Cyanea lamarckii (Peron &Leslieur)[J]· Toxicon 2007, 50, 53—64.)。申請人:一直致力于水母毒素細胞毒性以及拮抗水母毒素細胞毒性藥物的研究，已于2011年6月30日申請了中國發明專利CN201110180871. 2，發明名稱為“鈣通道阻斷劑在制備拮抗水母毒素心臟毒性藥物中的應用”，公開號為CN102228692A。L-抗壞血酸，即維生素C，是一種高效抗氧化劑，可以通過清除自由基而發揮抑制脂質過氧化的作用。此外，L-抗壞血酸參加體內的氨基酸代謝，可以增強機體抗病能力，降低毛細血管的通透性，加速血液凝固，促進鐵在腸內的吸收，促進膽固醇的轉化，使血脂下降。常用于各種急、慢性感染性疾病，如過敏性皮膚病、紫癜、濕疹、尋麻疹、帶狀皰疹，急慢性肝炎、肝硬化等肝功能損壞，還可促進傷口的愈合以及高血脂、癌癥、感冒的輔助治療。至今未見有關L-抗壞血酸拮抗發形霞水母毒素細胞毒性效應相關的報道。

發明內容
本發明的目的在于提供L-抗壞血酸的新的適應癥，具體是指是指L-抗壞血酸在制備預防或治療發形霞水母蜇傷藥物中的應用，進一步地，L-抗壞血酸在制備拮抗發形霞水母毒素細胞毒性效應藥物中的應用。申請人:經研究發現，發形霞水母(Cyanea capillata)觸手提取物(tentacle extract, TE)可以引起心臟、血液以及紅細胞中脂質過氧化產物丙二醒(malondialdehyde, MDA)的顯著升高,提示水母毒素還可能通過脂質過氧化作用破壞細胞膜而發揮細胞毒性效應。申請人大膽推測抗氧化劑可能對水母毒素的細胞毒性效應具有拮抗作用，從而減輕水母蟄傷后其毒素引起的體內非特異損傷作用，可以作為預防和治療水母蜇傷的有效藥物。L-抗壞血酸，即維生素C，是一種高效抗氧化劑，可以通過清除自由基而發揮抑制脂質過氧化的作用。此外，L-抗壞血酸參加體內的氨基酸代謝，可以增強機體抗病能力，降低毛細血管的通透性，加速血液凝固，促進鐵在腸內的吸收，促進膽固醇的轉化，使血脂下降。常用于各種急、慢性感染性疾病，如過敏性皮膚病、紫癜、濕疹、尋麻疹、帶狀皰疹，急慢性肝炎、肝硬化等肝功能損壞，還可促進傷口的愈合以及高血脂、癌癥、感冒的輔助治療。本發明提供了 L-抗壞血酸在制備預防或治療發形霞水母蜇傷藥物中的應用。進一步地，本發明提供了 L-抗壞血酸在制備拮抗發形霞水母毒素細胞毒性效應藥物中的應用。本發明的具體技術方案如下I.制備發形霞水母粗毒提取液I)采樣采集鮮活發形霞水母，迅速剪下其觸手，立即將觸手干冰冷凍，運回后置于_70°C超低溫冰箱凍存備用。 2)制備發形霞水母粗毒提取液將凍存觸手用自配海水于4°C自溶4天，磁力攪拌器攪拌，收集觸手自溶液體，4°C下IOOOOXg離心15min，上清液即發形霞水母粗毒提取液。2. L-抗壞血酸拮抗發形霞水母毒素溶血效應實驗I)在離體紅細胞水平，L-抗壞血酸拮抗發形霞水母毒素溶血效應，結果表明，預先加入L-抗壞血酸孵育的干預組溶血程度顯著低于不加L-抗壞血酸的對照組，說明在離體紅細胞水平，L-抗壞血酸可以拮抗發形霞水母毒素的溶血效應。2)在整體動物水平，L-抗壞血酸拮抗發形霞水母毒素溶血效應，結果表明，水母毒素注射IOmin后，中劑量和高劑量L-抗壞血酸干預組的大鼠血清吸光度顯著低于對照組。另外一個實驗中，18只雄性SD大鼠(230±20g)經腹腔注射烏拉坦(I. 2g/kg)麻醉后，隨機分成三組，分別為空白對照組、中毒組、L-抗壞血酸干預組。結果表明，與中毒組相比，L-抗壞血酸干預組大鼠血清中Lac和K+上升幅度顯著降低。以上結果表明，在整體動物水平，L-抗壞血酸可以拮抗發形霞水母毒素的細胞毒性效應。申請人:認為，L-抗壞血酸通過抑制發形霞水母毒素對細胞膜(紅細胞)的脂質過氧化作用，從而達到拮抗發形霞水母毒素所造成的細胞毒性效應的目的。在離體的紅細胞懸液中預先加入5mM的L-抗壞血酸，發形霞水母毒素造成的溶血效應顯著降低；在預先腹腔注射L-抗壞血酸的干預組大鼠，發形霞水母毒素產生的體內溶血效應顯著低于腹腔注射磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)的對照組。發形霞水母毒素還可以引起大鼠體內電解質和乳酸的紊亂，而L-抗壞血酸可以減輕這種紊亂，尤其是可以顯著拮抗血清K+和乳酸的升高幅度。這些結果說明L-抗壞血酸在離體細胞和整體動物水平都可以對發形霞水母毒素的細胞毒性效應產生拮抗作用。本發明在離體的紅細胞以及整體動物兩個層面驗證了 L-抗壞血酸可以拮抗發形霞水母毒素造成的細胞毒性效應，說明L-抗壞血酸適用于開發發形霞水母蜇傷的預防或治療藥物。另外，同樣作為高效抗氧化劑的谷胱甘肽(glutathione, GSH),實驗證明在離體的紅細胞層面也可以拮抗發形霞水母毒素造成的細胞毒性效應，但效果不如L-抗壞血酸。本發明為開發發形霞水母蜇傷的預防或治療藥物提供了一種有效的候選藥物。


圖I是在離體細胞水平，L-抗壞血酸拮抗發形霞水母毒素細胞毒性效應；
其中ΔΡ〈0. 05vs.單純毒素組，AP〈0. 05vs. L-抗壞血酸干預組。圖2是在整體動物水平，L-抗壞血酸拮抗發形霞水母毒素細胞毒性效應。
具體實施例方式下面結合本發明的實施例和附圖對本發明的實施作詳細說明，以下實施例是在以本發明技術方案為前提 下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例I.制備發形霞水母粗毒提取液發形霞水母(Cyanea capillata)于2010年8月采自浙江省三門灣海域，取觸手10g，加入等體積3. 34%自配海水10ml，自溶4天，磁力攪拌器每日攪拌2次，每次lOmin。100目細胞篩網過濾3次，濾液IOOOOXg離心3次，每次15min，收集上清即發形霞水母粗毒提取液(tentacle extract, TE)。米用Bradford法測定蛋白濃度為I. 2mg/ml。自配海水配方NaCl 28g, MgCl2 · 6H205g, KCl O. 8g, CaCl2 I. 033g，加水至 1000ml。所有操作都在冰水或4°C條件下進行。粗毒提取液使用前采用O. 01mol/L、pH7. 4PBS 透析 8h。實施例2.在離體紅細胞及整體動物兩個層面，L-抗壞血酸拮抗發形霞水母毒素細胞毒性效應實驗I)在離體紅細胞水平，L-抗壞血酸能夠拮抗發形霞水母毒素細胞毒性效應雄性SD大鼠(230±20g)腹腔注射烏拉坦(I. 2g/kg)麻醉，經眼球內眥后靜脈叢取血，新鮮血液懸浮于PBS中，4°C下1000 Xg離心IOmin,小心吸去上層液體,將沉淀的紅細胞重新懸浮于PBS中，如此三次，最終制成0. 5%紅細胞懸液。將0. 5%紅細胞懸液等體積分成五份，即空白對照組、單純毒素組、L-抗壞血酸干預組、還原型谷胱甘肽干預組、溶血對照組，其中L-抗壞血酸干預組為含有5mM L-抗壞血酸的0. 5%紅細胞懸液，還原型谷胱甘肽干預組為含有50 μ M還原型谷胱甘肽的0. 5%紅細胞懸液，空白對照組、單純毒素組及溶血對照組為加入少量PBS以調節體積與L-抗壞血酸干預組和還原型谷胱甘肽干預組一致的0. 5%紅細胞懸液。37°C水浴中孵育30min，單純毒素組、還原型谷胱甘肽干預組和L-抗壞血酸干預組加入發形霞水母毒素(300μ g/ml)，空白對照組加入等體積PBS，溶血對照組加入SDS (40μ g/ml)，37°C水浴中孵育30min，4°C下1000 Xg離心lOmin，取上清，于415nm波長下檢測吸光度。溶血分數(％)=樣品吸光度/陽性對照組吸光度X 100%。結果表明，L-抗壞血酸干預組和還原型谷胱甘肽干預組溶血分數顯著低于單純毒素組，且L-抗壞血酸拮抗溶血效果顯著強于還原型谷胱甘肽，如圖I所示。說明在離體的紅細胞水平，L-抗壞血酸對發形霞水母毒素的細胞毒性效應具有顯著的拮抗作用。2)在整體動物水平，L-抗壞血酸能夠拮抗發形霞水母毒素細胞毒性效應將32只雄性SD大鼠(230±20g)腹腔注射烏拉坦(I. 2g/kg)麻醉，隨機分成四組，分別為對照組、L-抗壞血酸干預低、中、高劑量組。對照組大鼠經腹腔注射Iml PBS，L-抗壞血酸干預低(125mg/kg)、中(250mg/kg)、高(500mg/kg)劑量組大鼠分別經腹腔注射等體積相應濃度的L-抗壞血酸。靜待IOmin后，各組大鼠經尾靜脈注射發型霞水母毒素(I. 25mg/kg)。各組大鼠分別于發型霞水母毒素注射前(Omin)、注射后10min、30min、60min經眼球內目此后靜脈叢取血，血液室溫下靜置2h，4°C下1000 Xg離心lOmin，取上清，于415nm波長下檢測吸光度，以吸光度值大小代表大鼠體內溶血情況。另外一個實驗中，將18只雄性SD大鼠(230±20g)腹腔注射烏拉坦(I. 2g/kg)麻醉，隨機分成三組，分別為空白對照組、中毒組和L-抗壞血酸干預組。首先，空白對照組和中毒組大鼠經腹腔注射Iml PBS, L-抗壞血酸干預組大鼠經腹腔注射等體積L-抗壞血酸(250mg/kg)，靜待IOmin后，中毒組和L-抗壞血酸干預組大鼠經尾靜脈注射發形霞水母毒素(I. 25mg/kg)，空白對照組給予等體積PBS。靜脈注射IOmin后，各組大鼠經眼球內眥后靜脈叢取血，血液室溫下靜置2h，4°C下1000 Xg離心lOmin，取上清，用于檢測Na+、K+、Ca2+、Cl—等電解質和乳酸(Lac)。結果表明，不同劑量L-抗壞血酸干預組在水母毒素注射后lOmin，體內溶血程度明顯低于對照組。250mg/kg L-抗壞血酸干預組大鼠血清中Lac和K+升高幅度較中毒組明顯降低，如圖2、表I所示。說明在整體動物水平，L-抗壞血酸可以拮抗發形霞水母毒素的 細胞毒性效應。表I :L_抗壞血酸拮抗發形霞水母觸手提取物所致體內溶血引起的電解質紊亂
Na (mM) K' (niM) Ca"' (inM) Ci"(mM) Lac (iriM)
空白對照組 139.8± 1.33 7.23 士 0.44 2.34士0.08 99.8 士 1.70 3.18 士 0.40 中毒組137.5 士 1.05A 10.65 土 1.31A 2.20±0.05& 94.7 ± 0.82^ 8.02±0.43&
L-抗壞血酸干預組 136.0 ± 1.10Δ 8.42±0.72δΑ 2.26 ± O93.7 土 0.52么 4.98 土 0.85δΑΔΡ<0. 05vs.空白對照組；▲ 〈()· 05vs.中毒組。以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等同物界定。
權利要求
1.L-抗壞血酸在制備預防或治療發形霞水母蜇傷藥物中的應用。
2.L-抗壞血酸在制備拮抗發形霞水母毒素細胞毒性效應藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及醫藥技術領域，具體是指L-抗壞血酸在制備拮抗發形霞水母(Cyanea capillata)毒素細胞毒性效應藥物中的應用。本發明在離體的紅細胞以及整體動物兩個層面驗證了L-抗壞血酸可以拮抗發形霞水母毒素造成的細胞毒性效應。本發明為開發發形霞水母蜇傷的預防或治療藥物提供了一種有效的候選藥物。
文檔編號A61K31/375GK102861009SQ20121036730
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月28日 優先權日2012年9月28日
發明者王濤, 張黎明, 肖良, 王倩倩, 王蓓蕾, 常銀龍, 阮增良, 尹慢慢, 徐鳳, 鄭杰民, 柳國艷 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學