專利名稱：特異促進肝細胞cyp2e1基因高表達的慢病毒表達載體及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，尤其涉及特異促進肝細胞CYP2E1基因高表達的慢病毒表達載體及其構建方法與應用。
背景技術：
細胞色素P450酶(Cytochrome P450，CYP450)是一類重要的混合功能氧化酶系統，主要分布在生物體的內質網上和線粒體中，參與許多內源性和外源性物質的生物轉化過程。CYP2E1屬于CYP450家族中的CYP2E亞族，由CYP2E1基因編碼，主要存在于肝臟中，約占肝臟CYP酶總量的7%，主要代謝小分子物質。目前，已經確定為CYP2E1的底物有70多種，參與亞硝胺、異煙臍、四氯化碳、氯哇沙宗、醋氨酚、茶堿等化合物的代謝，CYP2E1可使這些藥物轉化為毒性更強的中間產物。 現有技術中，徐田雪將CYP2E1基因cDNA片段連接到了 pFastBac載體上，并將其包裝成桿狀病毒后感染sf9細胞，得到了能表達CYP2E1基因的sf9細胞，該細胞能夠用于體外研究藥物代謝，但因不是人源細胞不適用于外源物質對人毒理的相關研究。黃鶴將CYP2E1基因克隆到PYES2/CT載體上，導入釀酒酵母中，從而構建出能表達CYP2EI基因的釀酒酵母，該細胞也是可以用于體外研究藥物代謝以及篩選藥物，但因非人源細胞也不適用于外源物質對人毒理的相關研究。現有技術中尚無可在人源細胞中持續、穩定且高效表達CYP2E1基因的載體。

發明內容
為解決現有技術中存在的問題，發明人在載體的選擇、重組構建方法等方面進行了大量的探索研究，預料不到地發現，將包含Xho I酶切位點和EcoR I酶切位點的CYP2E1基因cDNA序列插入pLVX-AcGFPl-Cl表達載體的多克隆位點中可成功構建特異促進人源肝細胞CYP2E1基因高表達的慢病毒表達載體，從而完成本發明。本發明提供一種特異促進肝細胞CYP2E1基因高表達的慢病毒表達載體，包括pLVX-AcGFP-Cl表達載體的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列和CYP2E1基因cDNA序列；所述多克隆位點包括Xho I酶切位點和EcoR I酶切位點，所述CYP2E1基因cDNA序列包括Xho I酶切位點、CYP2E1基因編碼序列和EcoR I酶切位點，所述CYP2E1基因cDNA序列正向插入所述多克隆位點序列中。采用上述技術方案，本發明提供的CYP2E1基因cDNA序列插入pLVX-AcGFPl_Cl表達載體構建得到的慢病毒表達載體具有轉染效率高，用量少，可持續、高效、穩定地提高CYP2E1基因表達的優點，可作為有力工具應用于制備治療CYP2E1基因表達異常相關疾病藥物的研究和開發中。作為本發明的進一步改進，所述CYP2E1基因編碼序列通過PCR擴增獲得，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列為5’ -ACCTCGAGTCATGTCTGCCCTCGGAGTCAC-3，，即 SEQ ID NO : I，所述下游引物的序列為5 ’ -ACGAATTCTCATGAGCGGGGAATGACA-3 ’，即SEQ ID N0:2。采用上述PCR引物序列，通過PCR可以擴增出CYP2E1基因編碼序列，并可成功插入至pLVX-AcGFPl-Cl表達載體中持續表達CYP2E1基因，減少了序列合成費用，成本較低。相應的，本發明還提供特異促進肝細胞CYP2E1基因高表達的慢病毒表達載體的構建方法，包括如下步驟
A)CYP2E1基因引物設計根據CYP2E1基因編碼序列，使用Oligo 7分析后選取5’ -ACCTCGAGTCATGTCTGCCCTCGGAGTCAC-3’，即 SEQ ID NO : I 作為上游引物，選取 5’_ACGAATTCTCATGAGCGGGGAATGACA-3’，即SEQ ID NO :2作為下游引物，然后合成所述上游引物和所述下游引物；所述上游引物和所述下游引物無引物二聚體，且退火溫度差距較小；
B)CYP2E1基因cDNA序列的獲得用所述上游引物和所述下游引物進行PCR擴增，獲 得大量CYP2E1基因編碼序列，然后將該序列進行加A尾反應后，用T4 DNA連接酶連接到pGM-T載體上得到連接產物，將該連接產物轉化到感受態大腸桿菌DH5 α中，均勻涂布到含氨芐青霉素LB培養基平板上，挑取陽性單克隆菌落培養保存菌液并進行PCR初步鑒定，將初步鑒定結果說明CYP2E1基因cDNA序列插入成功的菌液進行測序鑒定；用液體LB培養基培養測序鑒定正確的大腸桿菌，并抽提其中帶CYP2E1基因cDNA序列的pGM_T載體，用限制性內切酶Xho I酶切回收后再用EcoR I酶切，電泳、切膠回收1499 bp大小的片段，此片段即為CYP2E1基因cDNA序列；
C)特異促進肝細胞CYP2E1基因高表達的慢病毒載體的構建和鑒定提取質粒pLVX-AcGFPl-Cl，用限制性內切酶Xho I酶切回收后再用EcoR I酶切，電泳、切膠回收載體，再用T4 DNA Iigase將所述CYP2E1基因cDNA序列連接到pLVX-AcGFPl-Cl表達載體中，得到連接產物，將該連接產物轉化到感受態大腸桿菌DH5 α中，均勻涂布到含氨芐青霉素LB培養基平板上，挑取陽性單克隆菌落培養保存菌液并進行PCR初步鑒定，將初步鑒定結果說明CYP2E1基因cDNA序列插入成功的菌液進行測序鑒定；
D)特異促進肝細胞CYP2E1基因高表達的慢病毒載體的抽提將測序結果證實CYP2E1基因cDNA序列插入成功的菌液擴增培養，對重組質粒進行抽提，得到特異促進肝細胞CYP2E1基因高表達的慢病毒表達載體。本發明利用基因工程技術構建特異促進肝細胞CYP2E1基因高表達的慢病毒表達載體，經鑒定構建成功后，包裝成病毒感染L-02肝細胞，嘌呤霉素篩選細胞后，使用實時熒光定量PCR和Western Blot技術分別從mRNA和蛋白水平驗證CYP2E1基因表達的變化，實驗結果證明本發明提供的CYP2E1基因cDNA序列成功插入至pLVX-AcGFPl-Cl表達載體中，能特異、持續、高效、穩定地促進CYP2E1基因高表達。本發明還提供特異促進肝細胞CYP2E1基因高表達的慢病毒表達載體在制備治療CYP2E1基因表達異常相關疾病的藥物中的用途。與現有技術相比，本發明的有益效果如下本發明提供的特異促進肝細胞CYP2E1基因高表達的慢病毒表達載體具有轉染效率高，用量少，能特異、持續、高效、穩定地促進CYP2E1基因高表達的優點，可作為有力工具應用于與CYP2E1相關的藥物研究和開發中；本發明還提供了特異促進肝細胞CYP2E1基因高表達的慢病毒表達載體的構建方法，操作效果好，減少了序列合成費用，成本較低。


圖I為pLVX-AcGFPl-Cl表達載體的質粒圖譜。圖2為2E1-T載體菌液PCR的結果示意圖。圖3為pLVX-CYP2El載體菌液PCR的結果示意圖。圖4為PLVX-CYP2E1載體測序結果示意圖。圖5為嘌呤霉素篩選細胞后熒光定量PCR檢測結果示意圖。圖6為嘌呤霉素篩選細胞后Western blot檢測結果示意圖。圖7為嘌呤霉素篩選細胞連續培養20代后Western blot檢測結果示意圖。
具體實施例方式下面結合附圖與具體實施例對本發明做進一步的說明。L-02肝細胞購自上海生命科學院細胞資源中心，293FT細胞購自Invitrogen公司，Premix PrimeSTAR HS酶、慢病毒表達載體pLVX-AcGFPl-Cl、病毒包裝輔助試劑盒、Lenti-X GoStix 試劑盒均購自 Takara 公司，RNeasy Mini Kit 購自 Qiagen 公司，pGM_T載體購自天根公司，Endo-Free Plasmid Mini Kit II 購自 Omega bio-tek 公司。實施例一 CYP2E1基因引物的設計。根據CYP2E1基因編碼序列(GenBank NM_000773. 3)，使用01igo7對其進行分析，尋找上游引物和下游引物(要求盡可能無引物二聚體且退火溫度差距較小)，然后在上游引物和下游引物的5’端分別加入保護堿基與酶切位點Xho I和EcoR I，設計得到的引物序列如表I所示。設計的PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
權利要求
1.一種特異促進肝細胞CYP2E1基因高表達的慢病毒表達載體，其特征在于包括pLVX-AcGFP-CI表達載體的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列和CYP2E1基因cDNA序列；所述多克隆位點包括Xho I酶切位點和EcoR I酶切位點，所述CYP2E1基因cDNA序列包括Xho I酶切位點、CYP2E1基因編碼序列和EcoR I酶切位點，所述CYP2E1基因cDNA序列正向插入所述多克隆位點序 列中。
2.根據權利要求I所述的特異促進肝細胞CYP2E1基因高表達的慢病毒表達載體，其特征在于所述CYP2E1基因編碼序列通過PCR擴增獲得，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列為5’ -ACCTCGAGTCATGTCTGCCCTCGGAGTCAC-3’，即 SEQ ID N0:1，所述下游引物的序列為5’ -ACGAATTCTCATGAGCGGGGAATGACA-3’，即 SEQ ID NO :2。
3.根據權利要求2所述的特異促進肝細胞CYP2E1基因高表達的慢病毒表達載體的構建方法，其特征在于包括如下步驟 A)CYP2E1基因引物設計根據CYP2E1基因編碼序列，使用Oligo7分析后選取5’-ACCTCGAGTCATGTCTGCCCTCGGAGTCAC-3’，即 SEQ ID NO : I 作為上游引物，選取 5’-ACGAATTCTCATGAGCGGGGAATGACA-3 ’，即SEQ ID NO : 2作為下游引物，然后合成所述上游弓I物和所述下游引物； B)CYP2E1基因cDNA序列的獲得用所述上游引物和所述下游引物進行PCR擴增，獲得大量CYP2E1基因編碼序列，然后將該序列進行加A尾反應后，用T4 DNA連接酶連接到pGM-T載體上得到連接產物，將該連接產物轉化到感受態大腸桿菌DH5 α中，均勻涂布到含氨芐青霉素LB培養基平板上，挑取陽性單克隆菌落培養保存菌液并進行PCR初步鑒定，將初步鑒定結果說明CYP2E1基因cDNA序列插入成功的菌液進行測序鑒定；用液體LB培養基培養測序鑒定正確的大腸桿菌，并抽提其中帶CYP2E1基因cDNA序列的pGM_T載體，用限制性內切酶Xho I酶切回收后再用EcoR I酶切，電泳、切膠回收1499 bp大小的片段，此片段即為CYP2E1基因cDNA序列； C)特異促進肝細胞CYP2E1基因高表達的慢病毒載體的構建和鑒定提取質粒pLVX-AcGFPl-Cl，用限制性內切酶Xho I酶切回收后再用EcoR I酶切，電泳、切膠回收載體，再用T4 DNA Iigase將所述CYP2E1基因cDNA序列連接到pLVX-AcGFPl-Cl表達載體中，得到連接產物，將該連接產物轉化到感受態大腸桿菌DH5 α中，均勻涂布到含氨芐青霉素LB培養基平板上，挑取陽性單克隆菌落培養保存菌液并進行PCR初步鑒定，將初步鑒定結果說明CYP2E1基因cDNA序列插入成功的菌液進行測序鑒定； D)特異促進肝細胞CYP2E1基因高表達的慢病毒載體的抽提將測序結果證實CYP2E1基因cDNA序列插入成功的菌液擴增培養，對重組質粒進行抽提，得到特異促進肝細胞CYP2E1基因高表達的慢病毒表達載體。
4.根據權利要求I至3中任一項所述的特異促進肝細胞CYP2E1基因高表達的慢病毒表達載體在制備治療CYP2E1基因表達異常相關疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發明提供一種特異促進肝細胞CYP2E1基因高表達的慢病毒表達載體，包括pLVX-AcGFP-C1表達載體的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列和CYP2E1基因cDNA序列；所述多克隆位點包括XhoI酶切位點和EcoRI酶切位點，所述CYP2E1基因cDNA序列包括XhoI酶切位點、CYP2E1基因編碼序列和EcoRI酶切位點，所述CYP2E1基因cDNA序列正向插入所述多克隆位點序列中。本發明提供的慢病毒表達載體具有轉染效率高、用量少、可特異、持續、高效、穩定地表達CYP2E1基因的優點，可作為有力工具應用于與CYP2E1相關的藥物研究與開發。
文檔編號A61K48/00GK102876716SQ20121036674
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月28日 優先權日2012年9月28日
發明者徐新云, 毛侃瑯, 程錦泉, 彭朝瓊 申請人:深圳市疾病預防控制中心