專利名稱：人源化抗egfl7抗體及其使用方法
技術領域：
一般而言，本發明涉及分子生物學領域。更具體地，本發明關注抗EGFL7抗體及其用途。發明背景·維管聯結(vascular supply)的發育是許多生理性和病理性過程的基本要求。活躍生長中的組織諸如胚胎和腫瘤要求充足的血液供應。它們通過生成促血管發生因子來滿足這一需要，所述促血管發生因子經由稱為血管發生(angiogenesis)的過程促進自已有的血管形成新血管；或經由稱為維管發生(vasculogenesis)的過程自祖細胞形成新血管。管發生(tubulogenesis)是血管發育中一個至關重要的步驟。血管的管形成是復雜但有序的生物學事件，涉及所有或許多以下步驟a)自已有的內皮細胞(EC)增殖出EC或自祖細胞分化出EC ;b)EC遷移；c)EC接合以形成索樣結構；d)血管索然后發生管發生以形成具有中央內腔的血管；e)已有的索或血管伸出芽以形成次生血管(血管發生)；f)初級血管叢發生進一步重塑(remodeling)和整形(reshaping);及g)內皮周細胞(peri-endothelial cell)被募集來包圍內皮管，為血管提供維持和調控功能，此類細胞包括用于小毛細血管的周細胞、用于大血管的平滑肌細胞、和心臟中的心肌細胞。Hanahan, D.Science 277,48-50 (1997);Hogan, B. L. &Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics. 3, 51
3-23 (2002) ; Lubarsky, B. &Krasnow, M. A. Cell. 112, 19-28(2003)。現在完全確立了涉及自已有的內皮形成新血管的血管發生參與多種病癥的發病機理。這些包括實體瘤和轉移、動脈粥樣硬化、晶狀體后纖維組織增生、血管瘤、慢性炎癥、眼內新血管綜合征諸如增殖性視網膜病例如糖尿病性視網膜病、老年性黃斑變性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜組織和其它組織的免疫排斥、類風濕性關節炎、和銀屑病。Folkman et al. , J. Biol. Chem. , 267:10931-10934(1992);Klagsbrun et al. , Annu. Rev.Physiol.，53:217-239(1991);及 Garner A.，"Vascular diseases", In:Pathobiologyof Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A.,Klintworth GK, eds. , 2ndEdition(Marcel Dekker, NY,1994), pp 1625-1710。在腫瘤生長的情況中，血管發生對于自增生至瘤形成的轉換，及為腫瘤的生長和轉移提供營養似乎是至關重要的。Folkman et al.，Nature, 339:58 (1989)。新血管形成(neovascularization)讓腫瘤細胞獲得了與正常細胞相比的生長優勢和增殖自治。腫瘤通常開始于單個異常細胞，由于與可利用毛細管床的距離，該細胞只能增殖至幾立方毫米的尺寸，而且它能在較長的一段時間里保持“休眠”狀態而不進一步生長和傳播。有些腫瘤細胞然后轉向血管發生表型以激活內皮細胞，所述內皮細胞增殖并成熟成新的毛細血管。這些新形成的血管不僅讓原發性腫瘤繼續生長，而且讓轉移性腫瘤細胞傳播并再建群(recolonization)。因而，在腫瘤切片中的微血管密度與乳腺癌及數種其它腫瘤的患者存活之間觀察到了相關性。Weidner et al. , N. Engl. J. Med, 324:1-6 (1991) ;Horak et al. , Lancet, 340:1120-1124(1992) ;Macchiarini et al.，Lancet, 340:145-146 (1992)。尚未完全了解控制血管發生轉換的精確機制，但是認為腫瘤塊的新血管形成源自眾多血管發生刺激物與抑制物的凈平衡(Folkman, 1995, Nat Med I (I) :27-31)。血管發育過程受到嚴密調節。迄今為止，多種分子，多為由周圍細胞生成的分泌性因子，已顯示出調節EC分化、增殖、遷移和接合成索樣結構。例如，血管內皮生長因子(VEGF)已鑒定為涉及刺激血 發生和誘導血管通透性的關鍵因子。Ferrara etal.，Endocr. Rev.，18:4-25(1997)。甚至單個VEGF等位基因的遺失導致胚胎致死的發現指向此因子在血管系統的發育和分化中所發揮的不可代替的作用。此外，VEGF已顯示為與腫瘤和眼內病癥有關的新血管形成的關鍵介導物。Ferrara et al.，Endocr.Rev.,見上文。VEGF mRNA在多數所檢查的人腫瘤中過表達。Berkman et al. , J. Clin.Invest. , 91:153-159 (1993);Brown et aI. , Human Pathol. , 26:86-91 (1995);Brown etal., Cancer Res.，53:4727-4735(1993);Mattern et al., Brit. J. Cancer, 73:931-934(199
6);Dvorak et al. , Am. J. Pathol. , 146:1029-1039(1995)。血管形成過程中的有些步驟仍然不是很清楚。具體而言，關于管發生如何受到調節一血管索如何進展而變成管，和什么因子調節這種轉換知道的很少。鑒于維管發生和血管發生在許多疾病和病癥中的作用，希望有降低或抑制一種或多種引起這些過程的生物學效應的手段。通過述及完整收錄本文中引用的所有參考文獻，包括專利申請和出版物。發明概述本發明部分基于多種針對EGFL7的抗體。EGFL7作為一種重要且有利的治療靶，而且本發明提供抗體，作為治療劑和診斷劑，供靶向與EGFL7表達和/或活性有關的病理狀況中使用。因而，本發明提供涉及EGFL7的方法、組合物、試劑盒和制品。例如，在一些實施方案中，本發明提供抗EGFL7抗體。在一些實施方案中，本發明提供一種抗EGFL7抗體，其包含可變域，該可變域包含至少一種、兩種、三種、四種或五種選自下組的高變區(HVR)序列(i)包含KxiSx2Sx3DYx4OTSYx5S的HVR-Ll，其中X1為A或R ;X2為 H或Q ;X3SG或V ;X4選自 D，L，R，S，和 W;且 X5SM或V (SEQ ID NO :210) ;(ii)包含GASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1為N或Y;X2選自 L，R 和 Y ;且 X3 為 Q 或 S (SEQ ID NO :211);(iii)包含 Qqnnex1Px2I^Ahvr-LS,其中 X1S D 或E ;且X2 Sf 或 y(seq id no :212);(iv)包含 GX1X2X3X4TYGX5S 的 HVR-Hl，其中 X1 為 H 或 V ;X2 為 R 或 T ;X3 選自 F，G，R，和 S ;X4 選自 D，G，R，和 T ;且 X5 為 M 或 Y (SEQ ID NO :213) ； (v)包含 GffINX1X2SGVPTX3AX4X5X6X7X8 的HVR-H2，其中X1選自1，皿，1'，和1;\為!1或1 而選自I，M，T，和Y ;X4為D或H ;X5選自D，M和 T ;X6 為 F 或 Y ;X7 為 K 或 S ;且 X8 為 G 或 R(SEQ ID NO :214)，和(vi )包含 AxiLGSX2AVDX3的HVR-H3，其中X1為N或R;X2選自C，S，和Y ;且X3為A或Y (SEQ ID NO :215)。在一些實施方案中，該抗EGFL7抗體包含所有六種上述HVR。在一些實施方案中，HVR-Ll包含選自SEQ ID NO :31和37-43的氨基酸序列，HVR-L2包含選自SEQ ID NO 32和44-47的氨基酸序列，HVR-L3包含選自SEQ ID NO 33和48的氨基酸序列，HVR-Hl包含選自SEQ IDNO 34和49-57的氨基酸序列，HVR-H2包含選自SEQ ID NO 35和58-73的氨基酸序列，且HVR-H3包含選自SEQ ID NO : 36和74-77的氨基酸序列。在一些實施方案中，重鏈包含下述框架序列包含 Ex1Qlvesggglvqpggslrlscaas 的 fr-hi，其中 X1 為 I 或 v (seq id no 216);包含 WvrqapgkgleWx1 的 FR-H2，其中 X1 為 I 或 v (seq id no :217);包含 Rftx1Sx2DX3SX4X5TX6YLQMNSLRAEDTAVYX7CAR 的 FR-H3,其中 X1 為 F 或 I ;X2 為 L 或 R ;X3 為 N 或 T ;X4選自 A，E，K 和 T ;X5 為 N 或 S ;X6 選自 A，L，M，T 和 V ;且 X7 為 F 或 Y (SEQ ID NO :218);和包含WGQGTLVTVSS的FR-H4 (SEQ ID NO :219)。在一些實施方案中，重鏈包含下述框架序列包含 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 的 FR-Hl (SEQ ID NO :197);包含 WVRQAPGKGLEWV的 FR-H2 (SEQ ID NO :198);包含 RFTISxiDNSKNTX2YLQMNSLRAEDTAVYYCAR 的 FR-H3，其中
X1為 L 或 R ;X2 選自 A，L，M，T 和 V (SEQ ID NO :220);和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR-H4 (SEQID NO 200)o在一些實施方案中，輕鏈包含下述框架序列包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC的 FR-Ll (SEQ ID NO :201 )，包含 WYQQKPGKAPKLLIY 的 FR-L2 (SEQ ID NO :202)，包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 的 FR-L3 (SEQ ID NO :203)，包含 FGQGTKVEIK (SEQID NO :221)或FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO :204)的FR-L4。在一些實施方案中，輕鏈包含圖 15 (SEQ ID N0:82和83)所示4F11.V17或4F11.V22的可變域序列。在一些實施方案中，重鏈包含

圖16 (SEQ ID N0:84和85)所示4F11.V17或4F11.V22的可變域序列。在一些實施方案中，本發明提供一種抗體，其中輕鏈包含圖15 (SEQ ID NO :82)所示4F11. vl7的可變域序列且重鏈包含圖16 (SEQ ID NO :84)所示4F11. vl7的可變域序列。在一些實施方案中，本發明提供一種抗體，其中輕鏈包含圖15 (SEQ ID N0:83)所示4F11.V22的可變域序列且重鏈包含圖16 (SEQ ID N0:85)所示4F11.V22的可變域序列。在一些實施方案中，本發明提供一種抗EGFL7抗體，其包含可變域，該可變域包含至少一種、兩種、三種、四種或五種選自下組的HVR序列(i)包含X1X2X3X4X5X6VX7X8X9X101TYLX1!的 HVR-L 1，其中 X1 選自 L，Q，R，S，和 T ;X2 選自 P，T，和 W ；X3 為H或S ;X4為D或Q ;X5為G或S ;X6為L或V ;X7為H或P ;X8選自I，L，P，T，和Y ;X9選自N，Q或 S ;X10 選自 A，G，和 S ;且 X11 為 G 或 H (SEQ ID NO :222); (ii)包含 RVSNX1X2S 的 HVR-L2，其中父1為0或1 ;且父2選自六，6，卩，1，和了 (SEQ ID NO :223)包含X1QSX2X3VPLT的
HVR-L3，其中 X1 選自 A，G，I，K，L，N，S，TJPV;X2 為 C 或 T ;且 X3 為 F 或 H( SEQ ID NO :224);(iv)包含 GYX1X2X3DX4YX5N 的 HVR-Hl，其中 X1 為 N 或 T ;X2 為 F 或 V ;X3 選自 I，M，R，和 S ;X4選自 Y，Q，和 K ;且 X5 為 I 或M (SEQ ID NO :225); (v)包含 GDINX1X2X3X4X5X6HX7X8X9XiciX11X12X13的HVR-H2，其中X1選自A，L，N，和P ;X2選自D，L，和R ;X3選自G，K，N，R，S，和Y ;X4為G或S ;父5選自6，1，1(，1 ，5，1'，和￥;父6選自6，1和1'而選自I，V，和Y ;X8為N或S ;X9選自A，N，和 Q ;X1Q 為 K或 V5X11 為 F 或Q5X12S K或 T ;且 X13選自 G，H，RjPS (SEQ ID N0:226)，和(Vi )包含 X1Regvyhx2YDDYAx3DY 的 HVR-H3，其中 X1 選自 A，N，和 T ;X2 為 D 或 P ;且 X3 為 M 或 W(SEQ ID N0:227)。在一些實施方案中，該抗EGFL7抗體包含所有六種上述HVR。在一些實施方案中，HVR-Ll包含選自SEQ ID NO : 100和106-124的氨基酸序列，HVR-L2包含選自SEQID NO :101和125-129的氨基酸序列，HVR-L3包含選自SEQ ID NO :102和130-145的氨基酸序列，HVR-Hl包含選自SEQ ID NO :103和146-153的氨基酸序列，HVR-H2包含選自SEQID NO :104和154-187的氨基酸序列，且HVR-H3包含選自SEQID NO :105和188-192的氨基酸序列。在一些實施方案中，重鏈包含下述框架序列包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS的 FR-Hl (SEQ ID NO :197);包含 WVRQAPGKGLEWXi 的 FR-H2，其中 X1 為 I 或 V (SEQ ID NO 228);包含 RXJX2SX3DX4SX5X6TX7YX8QMNSLRAEDTAVYYC 的 FR-H3，其中 X1 為 F 或 V ;X2 為 I 或L ;X3選自L，R，和V ;X4為K或N ；X5選自K，N，R，和S ;X6為N或S ；X7選自A，L，和V ;且X8為 L 或 M (SEQ ID NO :229);和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR-H4 (SEQ ID NO :200)。在一些實施方案中，重鏈包含下述框架序列包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS的FR-Hl (SEQ IDNO :197);包含 WVRQAPGKGLEWV 的 FR-H2 (SEQ ID NO : 198);包含 RFTISRDXjKNTXJLQMNSLRAEDTAVYYCAR 的 FR-H3，其中 X1 為 N 或 K ;且 X2 選自 A，L，和 V (SEQ ID NO :230);和包含WGQGTLVTVSS的FR-H4 (SEQ ID NO :200)。在一些實施方案中，輕鏈包含下述框架序列包含 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 的 FR-L1(SEQ ID NO :201 )，包含 WYQQKPGKAPKLLIY 的 FR-L2(SEQ ID NO :202)，包含 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 的 FR-L3 (SEQ ID NO 203),包含 FGQGTKVEIK (SEQ ID NO :221)或 FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO :204)的 FR-L4。在一些實施方案中，輕鏈包含圖27 (SEQ ID NO :193和194)所示18F7. v6或18F7. v6k的可變域序列。在一些實施方案中，重鏈包含圖28 (SEQ ID NO :195和196)所示18F7. v6或18F7v6k的可變域序列。在一些實施方案中，本發明提供一種抗體，其中輕鏈包含圖27(SEQ ID NO:193)所示18F7. v6的可變域序列且重鏈包含圖28 (SEQ ID NO :195)所示18F7. v6的可變 域序列。在一些實施方案中，本發明提供一種抗體，其中輕鏈包含圖27 (SEQ ID NO 194)所示18F7. v6k的可變域序列且重鏈包含圖28 (SEQ ID NO : 196)所示18F7. v6k的可變域序列。在一些實施方案中，本發明提供一種抗體，其中框架序列的至少一部分為人共有框架序列。在一些實施方案中，該抗體包含人κ亞組I共有框架序列。在一些實施方案中，該抗體包含重鏈人亞組III共有框架序列。在一些實施方案中，本發明提供一種抗EGFL7抗體，其為雙特異性抗體。在一些實施方案中，該雙特異性抗體結合血管內皮生長因子(VEGF)，例如與bevacizumab或ranibizumab結合相同VEGF表位。在一些實施方案中，本發明提供編碼本發明抗體的核酸。在一些實施方案中，本發明提供包含此類核酸的載體。在一些實施方案中，本發明提供包含該核酸或載體的宿主細胞。在一些實施方案中，本發明提供包含本發明抗體的組合物。在一些實施方案中，該組合物包含載體。在一些實施方案中，該組合物為藥物組合物。在一些實施方案中，本發明提供一種用于制備抗EGFL7抗體的方法，其通過在合適宿主細胞中表達包含編碼本發明抗體的核酸的載體并回收該抗體來進行。在一些實施方案中，該宿主細胞是原核的。在一些實施方案中，該宿主細胞是真核的。在一些實施方案中，本發明提供一種用于治療腫瘤、癌癥、或細胞增殖性病癥的方法，該方法包括將有效量的本發明抗EGFL7抗體施用于需要此類治療的個體。在一些實施方案中，本發明提供一種抗EGFL7抗體，其用于治療腫瘤、癌癥、或細胞增殖性病癥。在一些實施方案中，該癌癥選自下組乳腺癌，結腸直腸癌，肺癌，食管癌，膀胱癌，卵巢癌，胰腺癌，和肝細胞癌。在一些實施方案中，該癌癥為乳腺癌、結腸直腸癌或肺癌。在一些實施方案中，該細胞增殖性病癥為癌癥。在一些實施方案中，該治療還包括有效量的第二藥物，其中抗EGFL7抗體為第一藥物。在一些實施方案中，該第二藥物為另一種抗體、化療劑、細胞毒劑、抗血管發生齊U、免疫抑制劑、前藥、細胞因子、細胞因子拮抗劑、細胞毒性放療劑、皮質類固醇、止吐劑、癌癥疫苗、止痛劑、或生長抑制劑。在一些實施方案中，該第二藥物為抗VEGF抗體，例如bevacizumab。在一些實施方案中，該第二藥物在施用抗EGFL7抗體之前或之后施用。在一些實施方案中，該第二藥物與抗EGFL7抗體同時施用。在一些實施方案中，本發明提供一種在具有與血管發生有關的病理狀況的受試者中降低或抑制血管發生的方法，包括對受試者施用本發明的抗體，由此在受試者中降低或抑制血管發生。在一些實施方案中，本發明提供本發明的一種抗體，其用于治療與血管發生有關的病理狀況。在一些實施方案中，該病理狀況為新生物狀況。在一些實施方案中，該病理狀況為非新生物狀況。在一些實施方案中，該非新生物狀況選自下組糖尿病性和其它增殖性視網膜病，早產兒視網膜病，新生血管性青光眼，老年性黃斑變性，糖尿病性黃斑水腫，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，視網膜/脈絡膜新血管形成。在一些實施方案中，本發明提供一種在具有與血管發生有關的病理狀況的受試者中增強抗血管發生劑的功效的方法，包括對受試者施用與抗血管發生劑組合的有效量的本·發明抗體，由此增強所述抗血管發生劑的抑制活性。在一些實施方案中，本發明提供本發明的一種抗體，其用于在具有與血管發生有關的病理狀況的受試者中增強抗血管發生劑的功效。在一些實施方案中，該與血管發生有關的病理狀況為腫瘤、癌癥或細胞增殖性病癥。在一些實施方案中，該與血管發生有關的病理狀況為非新生物狀況。在一些實施方案中，該非新生物狀況選自下組糖尿病性和其它增殖性視網膜病，早產兒視網膜病，新生血管性青光目艮，老年性黃斑變性，糖尿病性黃斑水腫，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，視網膜/脈絡膜新血管形成。在一些實施方案中，該抗血管發生劑在施用抗EGFL7抗體之前或之后施用。在一些實施方案中，該抗血管發生劑與抗EGFL7抗體同時施用。在一些實施方案中，該抗血管發生劑為抗VEGF劑,抗VEGF抗體,例如bevacizumab或ranibizumab。在一些實施方案中，本發明提供一種在受試者中降低或抑制腫瘤灌注和滲透性的方法，包括對受試者施用本發明的抗體。在一些實施方案中，本發明提供本發明的一種抗體，其用于在受試者中降低或抑制腫瘤灌注和滲透性。在一些實施方案中，該方法或用途進一步包括施用抗血管發生劑，例如抗VEGF劑(例如抗VEGF抗體,諸如bevacizumab)。本發明涉及下述各項。I. 一種抗EGFL7抗體,其包含可變域,該可變域包含至少一種、兩種、三種、四種或五種選自下組的高變區(HVR)序列(i )包含 KxiSx2Sx3DYx4GDSYx5S 的 HVR-Ll，其中 X1 為 A 或 R ;X2 為 H 或 Q ;X3 為 G 或V;x4 選自 0，1^，1 ，5，和胃；且父5為]\1或￥ (SEQ ID NO :210);(ii )包含 GASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1 SN或Y ;X2選自 L，R 和 Y;且X3 為 Q或S(SEQ ID NO :211)；(iii)包含 QQNNeX1PX2T 的 HVR-L3，其中 X1 為 D 或 E ;且 X2 為 F 或 Y (SEQ ID NO 212)；(iv)包含 GX1X2X3X4TYGX5S 的 HVR-Hl，其中 X1 為 H 或 V ;X2 為 R 或 T ;X3 選自 F，G，R，和 S ;X4 選自 D，G，R，和 T ;且 X5 為 M 或 Y (SEQ ID NO :213)；(V)包含 GffINX1X2SGVPTX3AX4X5X6X7X8 的 HVR-H2，其中 X1 選自 I, M，T，和 W ;X2 為 H或R ;X3選自I，M，T，和Y ;X4為D或H ;X5選自D，M和T ;X6為F或Y ;X7為K或S ;且X8為G或 R (SEQ ID NO :214，和(vi)包含Ax1Lgsx2Avdx3 的HVR-H3，其中 X1 Sn或r;x2選自 C，S，和 Y;且X3為A或 Y (SEQ ID NO :215)。2.項I的抗EGFL7抗體，其包含可變域，該可變域包含下述HVR序列(i )包含 KxiSx2Sx3DYx4GDSYx5S 的 HVR-Ll，其中 X1 為 A 或 R ;X2 為 H 或 Q ;X3 為 G 或V;x4 選自 0，1^，1 ，5，和胃；且父5為]\1或￥ (SEQ ID NO :210);(ii )包含 GASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1 SN或Y ;X2選自 L，R 和 Y;且X3 為 Q或S(SEQ ID NO :211)；(iii)包含 QQNNeX1PX2T 的 HVR-L3，其中 X1 為 D 或 E ;且 X2 為 F 或 Y (SEQ ID NO 212)； (iv)包含 GX1X2X3X4TYGX5S 的 HVR-Hl，其中 X1 為 H 或 V ;X2 為 R 或 T ;X3 選自 F，G，R，和 S ;X4 選自 D，G，R，和 T ;且 X5 為 M 或 Y (SEQ ID NO :213)；(V)包含 GffINX1X2SGVPTX3AX4X5X6X7X8 的 HVR-H2，其中 X1 選自 I, M，T，和 W ;X2 為 H或R ;X3選自I，M，T，和Y ;X4為D或H ;X5選自D，M和T ;X6為F或Y ;X7為K或S ;且X8為G或 R (SEQ ID NO :214，和(vi)包含Ax1Lgsx2Avdx3 的HVR-H3，其中 X1 Sn或r;x2選自 C，S，和 Y;且X3為A或 Y (SEQ ID NO :215)。3.項I或2的抗體，其中HVR-Ll包含選自SEQ ID NO 31和37-43的氨基酸序列，HVR-L2包含選自SEQ ID NO : 32和44-47的氨基酸序列，HVR-L3包含選自SEQ ID NO: 33和48的氨基酸序列，HVR-Hl包含選自SEQ ID NO 34和49-57的氨基酸序列，HVR-H2包含選自SEQ ID NO 35和58-73的氨基酸序列，且HVR-H3包含選自SEQ ID NO 36和74-77的氨
基酸序列。4.項1-3任一項的抗體，其中重鏈包含下述框架序列包含EXiQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 的 FR-H1，其中 X1 為 I 或 V (SEQ ID NO :216)；包含WVRQAPGKGLEffX1 的 FR-H2，其中 X1 為 I 或 V (SEQID NO :217);包含 RftxiSx2DX3SX4X5TX6YLQMnslraedtavyx7car 的 FR-H3，其中 X1 為 F 或 ι ;x2 為 L 或 r ;x3 為 N 或 t，X4 選自 α，ε，K 和 τ ;X5為N或S;X6選自A，L，M，T和V;且X7為F或Y (SEQ ID NO :218);和包含 WGQGTLVTVSS的 FR-H4 (SEQ ID NO :219)。5.項4的抗體，其中重鏈包含下述框架序列包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS的 FR-Hl (SEQ ID 勵197);包含叭1^^61 1^驟的？1 -!12 (SEQ ID NO : 198);包含 RFTISX^NSKNTx2YLQMNSLRAEDTAVYYCAR 的 FR-H3，其中 X1 為 L 或 R ;X2 選自 A，L，M，T 和 V (SEQ IDNO :220);和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR-H4 (SEQ ID NO :200)。6.項4或5的抗體，其中輕鏈包含下述框架序列包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC的 FR-Ll (SEQ ID NO :201 )，包含 WYQQKPGKAPKLLIY 的 FR-L2 (SEQ ID N0:202)，包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 的 FR-L3 (SEQ ID NO :203)，包含 FGQGTKVEIK (SEQID NO :221)或 FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO :204)的 FR-L4。7.項I的抗體，其中輕鏈包含圖15 (SEQ ID NO 82)所示4F11. vl7的可變域序列。
8.項I的抗體，其中輕鏈包含圖15 (SEQ ID NO 83)所示4F11. v22的可變域序列。9.項I的抗體，其中重鏈包含圖16 (SEQ ID NO 84)所示4F11. vl7的可變域序列。10.項I的抗體，其中重鏈包含圖16 (SEQ ID NO :85)所示4F1L v22的可變域序列。11.項I的抗體，其中輕鏈包含圖15 (SEQ ID NO :82)所示4F11. vl7的可變域序列且重鏈包含圖16 (SEQ ID NO 84)所示4F11. vl7的可變域序列。12.項I的抗體，其中輕鏈包含圖15 (SEQ ID NO :83)所示4F11. v22的可變域序列且重鏈包含圖16 (SEQ ID NO 85)所示4F11. v22的可變域序列。13.項1-3任一項的抗體，其中框架序列的至少一部分為人共有框架序列。 14.項13的抗體，其包含人κ亞組I共有框架序列。15.項13的抗體，其包含重鏈人亞組III共有框架序列。16. 一種抗EGFL7抗體,其包含可變域,該可變域包含至少一種、兩種、三種、四種或五種選自下組的HVR序列(i)包含 X1X2X3X4X5X6VX7X8X9XiciITYLX11 的 HVR-Ll，其中 X1 選自 L，Q，R，S，和 T ；X2 選自P，T，和W ;X3為H或S ;X4為D或Q ;X5為G或S ;X6為L或V ;X7為H或P ;X8選自I，L，P，T，和 Y ;X9 選自 N，Q 或 S ;X10 選自 A，G，和 S ;且 X11 為 G 或 H (SEQ ID NO :222)；(ii)包含 RVSNX1X2S 的 HVR-L2，其中 X1 為 D 或 R ;且 X2 選自 A，G，F，I，和 T (SEQID NO :223)；(iii)包含 X1QSX2X3VPLT 的 HVR-L3，其中 X1 選自 A，G，I，K，L, N, S，T，和 V ;X2 為 C或 T ;且 X3 為 F 或 H (SEQ ID NO :224)；(iv)包含 GYX1X2X3DX4YX5N 的 HVR-Hl，其中 X1 為 N 或 T ;X2 為 F 或 V ;X3 選自 I，M，R，和 S ;X4 選自 Y，Q，和 K ;且 X5 為 I 或M (SEQ ID NO :225)；(V)包含 GDINX1X2X3X4X5X6HX7X8X9XiciX11X12X13 的 HVR—H2，其中 X1 選自 A, L，N，和 P ；X2選自 D，L，和 R ；X3 選自 G，K，N，R，S，和 Y ;X4 為 G 或 S ;X5 選自 G，I，K，R，S，T，和 V ;X6 選自G，R，和T ;X7選自I，V，和Y ;X8為N或S ；X9選自A，N，和Q ；X10為K或V ；Xn為F或Q ；X12為K 或 T ;且 X13 選自 G，H，RJPS (SEQ ID NO :226);和(vi )包含 X1Regvyhx2YDDYAx3DY 的 HVR-H3，其中 X1 選自 A，N，和 T ;X2 為 D 或 P ;且X3 為 M 或 W (SEQ ID NO :227)。17.項16的抗EGFL7抗體，其包含可變域，該可變域包含下述HVR序列(i)包含 X1X2X3X4X5X6VX7X8X9XiciITYLX11 的 HVR-Ll，其中 X1 選自 L，Q，R，S，和 T ；X2 選自P，T，和W ;X3為H或S ;X4為D或Q ;X5為G或S ;X6為L或V ;X7為H或P ;X8選自I，L，P，T，和 Y ;X9 選自 N，Q 或 S ;X10 選自 A，G，和 S ;且 X11 為 G 或 H (SEQ ID NO :222)；(ii)包含 RVSNX1X2S 的 HVR-L2，其中 X1 為 D 或 R ;且 X2 選自 A，G，F，I，和 T (SEQID NO :223)；(iii)包含 X1QSX2X3VPLT 的 HVR-L3，其中 X1 選自 A，G，I，K，L, N, S，T，和 V ;X2 為 C或 T ;且 X3 為 F 或 H (SEQ ID NO :224)；(iv)包含 GYX1X2X3DX4YX5N 的 HVR-Hl，其中 X1 為 N 或 T ;X2 為 F 或 V ;X3 選自 I，M，R，和 S ;X4 選自 Y，Q，和 K ;且 X5 為 I 或M (SEQ ID NO :225)；(V)包含 GDINX1X2X3X4X5X6HX7X8X9XiciX11X12X13 的 HVR—H2，其中 X1 選自 A, L，N，和 P ；X2選自 D，L，和 R ；X3 選自 G，K，N，R，S，和 Y ;X4 為 G 或 S ;X5 選自 G，I，K，R，S，T，和 V ;X6 選自G，R，和T ;X7選自I，V，和Y ;X8為N或S ；X9選自A，N，和Q ；X10為K或V ；Xn為F或Q ；X12為K 或 T ;且 X13 選自 G，H，RJPS (SEQ ID NO :226);和(vi )包含 X1Regvyhx2YDDYAx3DY 的 HVR-H3，其中 X1 選自 A，N，和 T ;X2 為 D 或 P ;且X3 為 M 或 W (SEQ ID NO :227)。18.項16或17的抗體，其中HVR-Ll包含選自SEQ ID NO :100和106-124的氨基酸序列，HVR-L2包含選自SEQ ID NO :101和125-129的氨基酸序列，HVR-L3包含選自SEQID NO :102和130-145的氨基酸序列，HVR-Hl包含選自SEQ ID NO :103和146-153的氨基酸序列，HVR-H2包含選自SEQ ID NO :104和154-187的氨基酸序列，且HVR-H3包含選自SEQ ID NO :105和188-192的氨基酸序列。·19.項16-18任一項的抗體，其中重鏈包含下述框架序列包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 的 FR-HKSEQ ID NO : 197);包含 WVRQAPGKGLEWXi 的 FR-H2，其中 X1 為 I 或 V (SEQ ID NO :228);包含 RXJX2SX3DX4SX5X6TX7YX8QMNSLRAEDTAVYYC 的 FR-H3，其中X1 SF或V5X2S I或L5X3選自L，R，和V5X4S K或N ;&選自K，N，R，和S ;X6為N或3;父7選自六，1^，和￥;且父8為1^或皿(SEQ ID NO :229);和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR-H4 (SEQID NO 200)o20.項19的抗體，其中重鏈包含下述框架序列包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS的 FR-Hl (SEQ ID NO :197);包含 WVRQAPGKGLEWV 的 FR-H2 (SEQ ID NO :198);包含 RFTISRDXiSKNTXJLQMNSLRAEDTAVYYCAR 的 FR-H3，其中 X1 為 N 或 K ;且 X2 選自 A，L，和 V (SEQ IDNO :230);和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR-H4 (SEQ ID NO :200)。21.項19或20的抗體，其中輕鏈包含下述框架序列包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 的 FR-Ll (SEQ ID NO :201 )，包含 WYQQKPGKAPKLLIY 的 FR-L2(SEQ ID NO :202)，包含 GVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYC 的 FR-L3 (SEQ ID NO:203)，包含 FGQGTKVEIK (SEQ ID NO :221)或 FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO :204)的 FR-L4。22.項16的抗體，其中輕鏈包含圖27 (SEQ ID NO :193)所示18F7. v6的可變域序列。23.項16的抗體，其中輕鏈包含圖27 (SEQ ID NO :194)所示18F7. v6k的可變域序列。24.項16的抗體，其中重鏈包含圖28 (SEQ ID NO :195)所示18F7. v6的可變域序列。25.項16的抗體，其中重鏈包含圖28 (SEQ ID NO :196)所示18F7. v6k的可變域序列。26.項16的抗體，其中輕鏈包含圖27 (SEQ ID NO :193)所示18F7. v6的可變域序列且重鏈包含圖28 (SEQ ID NO :195)所示18F7. v6的可變域序列。27.項16的抗體，其中輕鏈包含圖27 (SEQ ID NO :194)所示18F7. v6k的可變域序列且重鏈包含圖28 (SEQ ID NO :196)所示18F7. v6k的可變域序列。28.項16的抗體，其中框架序列的至少一部分為人共有框架序列。
29.項28的抗體，其包含人κ亞組I共有框架序列。30.項28的抗體，其包含重鏈人亞組III共有框架序列。31.項1-30任一項的抗體，其中所述抗體為雙特異性抗體。32.項31的雙特異性抗體，其中所述雙特異性抗體結合血管內皮生長因子(VEGF)033.項32的雙特異性抗體，其中所述雙特異性抗體與bevacizumab或ranibizumab結合相同VEGF表位。34.編碼項1-33任一項的抗體的核酸。35.包含項34的核酸的載體。
36.包含項34的核酸或項35的載體的宿主細胞。37.包含項1-33任一項的抗體的組合物。38.項37的組合物，其中該組合物包含載體。39.項37或38的組合物，其為藥物組合物。40. 一種用于制備抗EGFL7抗體的方法,所述方法包括(a)在合適宿主細胞中表達項35的載體，并(b)回收該抗體。41.項40的方法，其中該宿主細胞是原核的。42.項40的方法，其中該宿主細胞是真核的。43. 一種用于治療腫瘤、癌癥、或細胞增殖性病癥的方法，該方法包括將有效量的項1-33任一項的抗EGFL7抗體施用于需要此類治療的個體。44.項43的方法，其中該癌癥選自下組乳腺癌，結腸直腸癌，肺癌，食管癌，膀胱癌，卵巢癌，胰腺癌，和肝細胞癌。45.項44的方法，其中該癌癥為乳腺癌、結腸直腸癌或肺癌。46.項43的方法，其中該細胞增殖性病癥為癌癥。47.項43-46任一項的方法，進一步包括對個體施用有效量的第二藥物，其中抗EGFL7抗體為第一藥物。48.項47的方法，其中該第二藥物為另一種抗體、化療劑、細胞毒劑、抗血管發生齊U、免疫抑制劑、前藥、細胞因子、細胞因子拮抗劑、細胞毒性放療劑、皮質類固醇、止吐劑、癌癥疫苗、止痛劑、或生長抑制劑。49.項48的方法，其中該第二藥物為抗VEGF抗體。50.項49的方法,其中該第二藥物為bevacizumab。51.項47-50任一項的方法，其中該第二藥物在施用抗EGFL7抗體之前或之后施用。52.項47-50任一項的方法，其中該第二藥物與抗EGFL7抗體同時施用。53. 一種在具有與血管發生有關的病理狀況的受試者中降低或抑制血管發生的方法，包括對受試者施用項1-33任一項的抗體，由此在受試者中降低或抑制血管發生。54.項53的方法，其中所述病理狀況為新生物狀況。55.項53的方法，其中所述病理狀況為非新生物狀況。56.項55的方法，其中所述非新生物狀況選自下組糖尿病性和其它增殖性視網膜病，早產兒視網膜病，新生血管性青光眼，老年性黃斑變性，糖尿病性黃斑水腫，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，視網膜/脈絡膜新血管形成。57. 一種在具有與血管發生有關的病理狀況的受試者中增強抗血管發生劑的功效的方法，包括對受試者施用與抗血管發生劑組合的有效量的項1-33任一項的抗體，由此增強所述抗血管發生劑的抑制活性。58.項57的方法，其中該與血管發生有關的病理狀況為腫瘤、癌癥或細胞增殖性病癥。59.項57的方法，其中該與血管發生有關的病理狀況為非新生物狀況。60.項59的方法，其中所述非新生物狀況選自下組糖尿病性和其它增殖性視網膜病，早產兒視網膜病，新生血管性青光眼，老年性黃斑變性，糖尿病性黃斑水腫，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，視網膜/脈絡膜新血管形成。
61.項57-60任一項的方法，其中所述抗血管發生劑在施用抗EGFL7抗體之前或之后施用。62.項57-60任一項的方法，其中所述抗血管發生劑與抗EGFL7抗體同時施用。63.項57-60任一項的方法，其中所述抗血管發生劑為抗VEGF劑。64.項63的方法，其中所述抗VEGF劑為抗VEGF抗體。65.項64的方法,其中所述抗VEGF抗體為bevacizumab。66.項64的方法,其中所述抗VEGF抗體為ranibizumab。67. 一種在受試者中降低或抑制腫瘤灌注和滲透性的方法，包括對受試者施用項1-33任一項的抗體，由此在受試者中降低或抑制腫瘤灌注和滲透性。68.項67的方法，進一步包括施用抗血管發生劑。69.項68的方法，其中所述抗血管發生劑在施用抗EGFL7抗體之前或之后施用。70.項68的方法，其中所述抗血管發生劑與抗EGFL7抗體同時施用。71.項67-70任一項的方法，其中所述抗血管發生劑為抗VEGF劑。72.項71的方法，其中所述抗VEGF劑為抗VEGF抗體。73.項72的方法,其中所述抗VEGF抗體為bevacizumab。附圖簡述圖I描繪來自小鼠(SEQ ID NO :1)和人(SEQ ID ON :2)的EGFL7的氨基酸序列。標示了 EMI1、EMI2, EGF和卷曲螺旋域的位置。截短的EGFL7缺少卷曲螺旋域。肽EMIl(SEQ ID N0:3)、EMI2 (SEQ ID NO :4)和 p2 (SEQ ID NO :5)、P4 (SEQ ID NO :6)、p5 (SEQID NO :7)、和p6 (SEQ ID NO :8)的序列標有下劃線。圖2描繪人卡帕I共有(SEQ ID NO 9)和4F11. vl (SEQ ID NO :10)的輕鏈可變域的氨基酸序列。位置依照Kabat來編號，而且框示了高變區。圖3 描繪人亞組 III 共有(SEQ ID NO :11)和 4F11. vl (SEQ ID NO :12)的重鏈可變域的氨基酸序列。位置依照Kabat來編號，而且框示了高變區。圖4描繪用于轉換框架轉換文庫中位置的寡核苷酸。顯示了 4F11. vl的DNA序列和用于生成框架轉換的寡核苷酸。還顯示了初始和一些所得框架轉換區的氨基酸序列。在一些情況中，基于如何設計簡并密碼子，還摻入了別的氨基酸殘基。序列標識符顯示于相應序列右邊的括號中(SEQ ID NO 13-28)ο圖5描繪結果，證明了 mu4Fll結合EGFL7能被肽2 (SEQ ID NO 5)阻斷，但不被交疊肽I或3 (分別為SEQ ID NO 29和30)或隨機對照肽阻斷。圖6描繪展示4F11. vIFab的噬菌體對微量滴定板上固定化的截短的EGFL7的結合。作為漸增噬菌體濃度的函數，4F11. vl噬菌體的兩份樣品都顯示升高的對固定化EGFL7的結合。對照噬菌體顯示與4F11. vl噬菌體在低噬菌體濃度的水平相似的背景結合，提示一些非特異性噬菌體-EGFL7相互作用。圖7描繪展示4F11. VlFab的噬菌體對EMI2域或p2肽(經由游離氨基或游離硫醇基生物素化的)的結合。圖8描繪框架轉換期間在每個框架位置處找到的殘基的豐度。列出了框架轉換期間在每個框架位置處引入的氨基酸。圖9 (圖9A和9B)描繪在6個“單位置文庫”(SPL)每一個中對3種框架每一個觀察到的CDR序列變化。文庫通過使用的框架分開(4F11. VU4F11. v2和4F11. v3)。相對于特定⑶R序列突顯了自每一個SPL獲得的變化。這些變化以外的VL和VH序列與相應框·架相同，而且現在顯示。序列標識符顯示于相應序列右邊的括號中(SEQ ID N0:31-77)。出現超過一次的序列個體可能不是總是具有相應的序列標識符。圖10描繪有限文庫I和2的輕鏈可變域的框架和文庫設計。與用于文庫I (SEQID N0:78)和文庫2 (SEQ ID NO :79)的模板相比，顯示了人卡鉬I共有(SEQ ID N0:9)和4Fll.vl (SEQ ID NO : 10)的氨基酸序列。以穿過氨基酸的斜線顯示了隨機化成所有20種
氨基酸的位置。圖11描繪有限文庫I和2的重鏈可變域的框架和文庫設計。與用于文庫I (SEQID N0:80)和文庫2 (SEQ ID NO :81)的模板相比，顯示了人亞組III共有(SEQ ID NO 11)和4F11.V1 (SEQ ID NO : 12)的氨基酸序列。以穿過氨基酸的斜線顯示了隨機化成所有20種氨基酸的位置。圖12描繪在有限文庫I和2中的隨機化位置處觀察到的變化頻率。顯示了輕鏈中位置53和54及重鏈中29、52、和98處選擇的氨基酸偏愛。對任何氨基酸的偏愛(Sigma)報告為超出假設氨基酸二項式分布時文庫中給定殘基的隨機機會出現的標準偏差數目。通過此方法進行的打分說明了建立共有時預期的密碼子偏倚和取樣統計學。圖13和14描繪在體外人源化4F11變體對HUVEC粘附固定化人或鼠EGFL7的抑制。在漸增濃度的抗體存在下容許HUVEC (20，000個細胞/孔)粘附至用5 μ g/ml人或鼠EGFL7包被的96孔板。對清洗后仍粘附至板的細胞數計數，并作為分配入每個孔的總細胞的百分比來計算。圖 15 描繪人卡帕 I 共有(SEQ ID NO 9),4F11. vl(SEQ ID NO :10)、4F11. vl7(SEQID N0:82)JP4F11.v22(SEQ ID NO :83)的輕鏈可變域的氨基酸序列。位置依照Kabat來編號，而且框示了高變區。圖16 描繪人亞組 III 共有(SEQ ID NO :11)、4F11. vl (SEQ ID NO :12)、4F11. vl7(SEQ ID NO :84)、和4F11. v22 (SEQ ID NO :85)的重鏈可變域的氨基酸序列。位置依照Kabat來編號,而且框示了高變區。圖17描繪人卡帕I共有(SEQ ID NO :9)和18F7-嫁接(SEQ ID NO :86)的輕鏈可變域的氨基酸序列。位置依照Kabat來編號，而且框示了高變區。圖18 描繪人亞組 III 共有(SEQ ID NO :11)和 18F7-嫁接(SEQ ID NO :87)的重鏈可變域的氨基酸序列。位置依照Kabat來編號，而且框示了高變區。圖19描繪用于轉換框架轉換文庫中位置的寡核苷酸。顯示了 18F7-嫁接的DNA序列和用于生成框架轉換的寡核苷酸。還顯示了初始和一些所得框架轉換區的氨基酸序列。在一些情況中，基于如何設計簡并密碼子，還摻入了別的氨基酸殘基。序列標識符顯示于相應序列右邊的括號中(SEQ ID NO 88-99)ο圖20描繪描繪結果，證明了結合EGFL7的mul8F7能被EMIl (SEQ ID NO :3)或肽P5 (SEQ ID NO :7)阻斷，但不被肽P4或P6 (分別為SEQ ID NO :6和8)阻斷。用含有帶HA標簽的全長人EGFL7 cDNA的質粒轉染雞胚成纖維細胞。在200倍過量的競爭性肽存在下用mul8F7免疫沉淀自經轉染細胞制備的細胞溶胞物。使用抗HA抗體通過Western印跡分析免疫沉淀物。圖21描繪展示18F7-嫁接Fab的噬菌體對微量滴定板上固定化的截短的huEGFL7的結合。作為漸增噬菌體濃度的函數，18F7-嫁接噬菌體的兩份樣品都顯示升高的對固定化 EGFL7的結合。對照噬菌體顯示與18F7-嫁接噬菌體在低噬菌體濃度的水平相似的背景結合，提示一些非特異性噬菌體-EGFL7相互作用。圖22描繪展示18F7-嫁接Fab對EMIl域或p5肽(經由游離氨基或游離硫醇基生物素化的)的結合。圖23描繪框架轉換期間在每個框架位置處找到的殘基的豐度。列出了框架轉換期間在每個框架位置處引入的氨基酸。圖24 (圖24A和24B)描繪在6個SPL每一個中對3段框架每一個觀察到的⑶R序列變化。文庫通過使用的框架分開(18F7-嫁接、18F7-K、18F7-KV、和18F7-KA)。相對于特定⑶R序列突顯了自每一個SPL獲得的變化。這些變化以外的VL和VH序列與相應框架相同，而且現在顯示。序列標識符顯示于相應序列右邊的括號中(SEQ ID N0100-192)o出現超過一次的序列個體可能不是總是具有相應的序列標識符。圖25描繪在體外人源化18F7變體對HUVEC粘附固定化人或小鼠EGFL7的抑制。在漸增濃度的抗體存在下容許HUVEC(20，000個細胞/孔)粘附至用5 μ g/ml人或鼠EGFL7包被的96孔板。對清洗后仍粘附至板的細胞數計數，并作為分配入每個孔的總細胞的百分比來計算。圖26描繪對HUVEC跨孔遷移的抑制。將HUVEC (50，000個細胞每孔)在跨孔板的上槽中培養16小時，并用5 μ g/ml重組人EGFL7蛋白包被上槽中的膜。將各種濃度的對照抗體(抗IgE)或不同18F7變體添加至上和下槽中的培養基，而在下孔中添加20ng/ml重組人VEGF-165以刺激HUVEC遷移。對遷移至上槽下側的細胞計數，并相對于處理(抗體和濃度)繪圖。圖27 描繪人卡帕 I 共有(SEQ ID NO :9)、18F7. v6(SEQ ID NO :193)、和 18F7. v6k(SEQ ID NO :194)的輕鏈可變域的氨基酸序列。位置依照Kabat來編號，而且框示了高變區。在沒有顯示18F7. v6k的序列的情況中(比對的第二和第三部分中)，相應序列與18F7.v6的序列相同。圖28 描繪人亞組 III 共有(SEQ ID NO :11)、18F7. v6(SEQ ID NO :195)、和 18F7.v6k (SEQ ID NO :196)的重鏈可變域的氨基酸序列。位置依照Kabat來編號，而且框示了高變區。在沒有顯示18F7. v6k的序列的情況中(比對的第一和第三部分中)，相應序列與18F7. v6的序列相同。圖29描繪單獨地或與抗VEGF抗體組合地使用hul8F7. v6k對H1299異種移植物腫瘤生長的抑制。圖30描繪單獨地和與抗VEGF抗體組合地使用hul8F7. v6k對LXFL 1674異種移植物腫瘤生長的抑制。圖31描繪單獨地和與抗VEGF抗體組合地使用hul8F7. v6k對新生兒氣管血管化的抑制。發明詳述本發明提供抗EGFL7抗體的方法、組合物、試劑盒和制品。本文中提供這些方法、組合物、試劑盒和制品的詳情。 通用技術本文中描述或提到的技術和規程一般得到了本領域技術人員的充分理解，而且通常利用常規方法得以采用，諸如例如下列文獻中記載的廣泛應用的方法SambiOOket al. , Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd. edition(2001)Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y ;CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(F. M. Ausubel, et al. eds. , (2003))；叢書 METHODS IN ENZYM0L0GY(AcademicPress, Inc.) : PCR2:A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Tayloreds. (1995)) ；Harlow and Lane, eds. (1988)ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL ;及 ANIMALCELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987))。定義“分離的”抗體指已經鑒定且自其天然環境的一種成分分開和/或回收的抗體。其天然環境的污染性成分指將會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質，可包括酶、激素、和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在優選的實施方案中，將抗體純化至(I)根據Lowry法的測定，抗體重量超過95%，最優選重量超過99%，(2)足以通過使用轉杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內部氨基酸序列的程度，或(3)根據還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用考馬斯藍或優選銀染色，達到同質。既然抗體天然環境的至少一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個純化步驟來制備。“分離的”核酸分子指已經鑒定且與抗體核酸的天然來源中通常與之關聯的至少一種污染性核酸分子分開的核酸分子。分離的核酸分子不同于在自然界中發現它時的形式或背景。分離的核酸分子因此與存在于天然細胞中時的核酸分子有區別。然而，分離的核酸分子包括通常表達該抗體的細胞中所包含的核酸分子，例如當所述核酸分子在所述細胞中的染色體定位不同于它在天然細胞中的染色體定位時。術語“抗EGFL7抗體”或“結合EGFL7的抗體”指能夠以足夠親和力結合EGFL7，使得該抗體可用作靶向EGFL7的診斷劑和/或治療劑的抗體。在某些實施方案中，結合EGFL7的抗體具有彡I μ M、彡ΙΟΟηΜ、彡10nM、彡InM、或彡0. InM的解離常數(Kd)。“結合親和力”通常指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有說明，在用于本文時，“結合親和力”指反映結合對的成員(例如抗體與抗原)之間I:I相互作用的內在結合親和力。分子X對其配偶體Y的親和力通常可用解離常數(Kd)來表述。親和力可通過本領域知道的常用方法來測量，包括本文中所描述的。低親和力抗體通常緩慢的結合抗原且趨于容易解離，而高親和力抗體通常更快速的結合抗原且趨于保持更長時間的結合。本領域知道測量結合親和力的多種方法，其中任一種都可用于本發明的目的。下文描述了具體的示例性實施方案。在一個實施方案中，依照本發明的“Kd”或“Kd值”是通過如下測定法所述使用Fab型式的目的抗體及其抗原進行的放射性標記抗原結合測定法(RIA)來測量的通過在存在未標記抗原的滴定系列的條件下， 用最小濃度的125I標記抗原平衡，然后用抗Fab抗體包被的平板捕捉結合的抗原來測量Fab對抗原的溶液結合親和力(Chen，et al.，(1999)J.Mol Biol 293:865-881)。為了確定測定條件，用50mM碳酸鈉(pH 9.6)中的5 μ g/ml捕捉用抗Fab抗體(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)過夜，隨后用PBS中的2%(w/v)牛血清清蛋白在室溫(約23° C)封閉2-5小時。在非吸附平板(Nunc#269620)中，將IOOpM或26pM[125I]_抗原與連續稀釋的目的Fab混合(例如與Presta et al. , (1997)CancerRes. 57:4593-4599中抗VEGF抗體，Fab-12的評估一致)。然后將目的Fab保溫過夜；不過，保溫可持續更長時間(例如65個小時)以保證達到平衡。此后，將混合物轉移至捕捉板以進行室溫保溫(例如I小時)。然后除去溶液，并用含O. l%Tween -20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150 μ I/孔閃爍液(MicroScint _20; Packard),然后在TopCount伽馬計數器(Packard)上對平板計數10分鐘。選擇各Fab給出小于或等于最大結合之20%的濃度用于競爭性結合測定法。依照另一實施方案，Kd或Kd值是通過表面等離振子共振測定法使用BIAcore -2000 或 BIAcore -3000 (BIAcore, Inc. , Piscataway, NJ)在 25° C 使用固定化抗原CM5芯片在約10個響應單位(RU)測量的。簡而言之，依照供應商的說明書用鹽酸N-乙基-N’ - (3- 二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物傳感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用IOmM乙酸鈉pH 4. 8將抗原稀釋至5 μ g/ml (約O. 2 μ Μ),然后以5 μ I/分鐘的流速注入至獲得約10個響應單位(RU)的偶聯蛋白質。注入抗原后，注入IM乙醇胺以封閉未反應基團。為了進行動力學測量，在25° C以約25 μ I/分鐘的流速注入在含O. 05%Tween -20的PBS(PBST)中兩倍連續稀釋的Fab(O. 78nM至500nM)。使用簡單一對一朗格繆爾(Langmuir)結合模型(BIAcore EvaluationSoftware version 3.2)通過同時擬合結合和解離傳感圖計算結合速率(km)和解離速率(koff)。平衡解離常數(Kd)以比率I^ffZXn計算。參見例如Chen，Y.，et al. , (1999) J. Mol.Biol. 293:865-881。如果根據上文表面等離振子共振測定法，結合速率超過10 -^那么結合速率可使用熒光淬滅技術來測定，即根據分光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計(astop-flow equipped spectrophometer) (Aviv Instruments)或 8000 系列 SLM-Aminco 分光光度計(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測量,在存在濃度漸增的抗原的條件下，測量PBS，pH 7. 2中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25° C的熒光發射強度(激發=295nm ;發射=340nm, 16nm帶通)的升高或降低。術語“載體”在用于本文時意指能夠運輸與其連接的其它核酸的核酸分子。一類載體是“質粒”，指其中可連接另外的DNA區段的環狀雙鏈DNA環。另一類載體是噬菌體載體。另一類載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在其所導入的宿主細胞中自主復制(例如具有細菌復制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)可在導入宿主細胞后整合到宿主細胞的基因組中，由此隨著宿主基因組一起復制。此外，某些載體能夠指導與其可操作連接的基因表達。此類載體在本文中稱為“重組表達載體”(或簡稱為“重組載體”或“表達載體”)。通常，在重組DNA技術中有用的表達載體常常是質粒形式。在本說明書中，“質粒”和“載體”可互換使用。“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互換使用，指任何長度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經過修飾的核苷酸或堿基、和/或其類似物，或者是可通過DNA或RNA聚合酶或者通過合成反應摻入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含經過修飾的核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。如果有的話，對核苷酸結構的修飾可以在裝配聚合物之前或之后進行。核苷酸序列可以由非核苷酸組分中斷。多核苷酸可以在合成后進一步修飾，諸如通過與標記物偶聯。其它類型的修飾包括例如“帽”，將一個或多個天然存在的核苷酸用類似物替代，核苷酸間修飾諸如例如具有不帶電荷連接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有帶電荷連接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修飾，含有懸垂模塊(pendant moiety)諸如例如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚L-賴氨酸等)的修飾、具有嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)的修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修飾、含有 燒化劑的修飾、具有經修飾連接(例如α端基異構核酸(anomeric nucleic acid)等)的修飾、以及未修飾形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖類中的任何羥基可以用例如膦酸(phosphonate)基團、磷酸(phosphate)基團替換,用標準保護基團保護，或活化以制備與別的核苷酸的別的連接，或者可偶聯至固體和半固體支持物。5’和3’末端OH可磷酸化或者用胺或1-20個碳原子的有機加帽基團模塊取代。其它羥基也可衍生成標準保護基團。多核苷酸還可含有本領域普遍知道的核糖或脫氧核糖糖類的類似物形式，包括例如2’ -氧-甲基、2’ _氧-烯丙基、2’ -氟-或2’ -疊氮-核糖，碳環糖類似物，α -端基異構糖,差向異構糖諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、批喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，無環類似物及脫堿基核苷類似物諸如甲基核糖核苷。可用備選連接基團替換一個或多個磷酸二酯連接。這些備選連接基團包括但不限于以下實施方案，其中磷酸酯用P(O)S (“硫代酸酯”(thioate))、P(S)S (“二硫代酸酯” (dithioate) )、(O)NR2 (“酰胺酯” (amidate) )、P (0) R、P (0) OR’、CO 或 CH2(“甲縮醛” (formacetal))替代，其中R或R’各自獨立為H或者取代或未取代的烷基(1_20個C)，任選含有醚(-0-)連接、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有連接都必需是相同的。前述描述適用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和 DNA。“寡核苷酸”在用于本文時一般指短的多核苷酸，一般是單鏈，一般是合成的，長度一般但不是必需小于約200個核苷酸。術語“寡核苷酸”與“多核苷酸”并不互相排斥。上文關于多核苷酸的描述平等且完全適用于寡核苷酸。術語“EGFL7”(可互換地稱為“EGF 樣域，多種 7 (EGF-like-domain multiple
7)”)，在用于本文時，除非另有明確說明或者上下文另有說明，指任何天然的或變異的(無論是天然的或合成的)EGFL7多肽。術語“天然序列”明確涵蓋天然存在的截短或分泌形式(例如胞外結構域序列)、天然存在的變異形式(例如可變剪接形式)和天然存在的等位變體。術語“野生型EGFL7” 一般指包含天然存在EGFL7蛋白的氨基酸序列的多肽。術語“野生型EGFL7序列” 一般指在天然存在EGFL7中發現的氨基酸序列。
術語“抗體”和“免疫球蛋白”以最廣義互換使用，包括單克隆抗體(例如全長或完整單克隆抗體)、多克隆抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要它們展現出期望的生物學活性)，而且還可以包括某些抗體片段(如本文中更為詳細描述的)。抗體可以是人的、人源化的和/或親和力成熟的。“可變的”指可變域中的某些部分在抗體序列間差異廣泛且用于每種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作互補決定區或高變區(CDR或HVR，在本文中可互換使用)的三個區段。可變域中較保守的部分稱作框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR，它們大多采取β-折疊片構象，通過形成環狀連接且在有些情況中形成β-折疊片結構一部分的三個HVR連接。每條鏈中的HVR通過FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的HVR —起促成抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabat et al. , Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第 5 版，National Institute of Health, Bethesda, MD.(1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結合，但展現出多種效應器功能，諸如抗體依賴性細胞的(細胞)毒性中抗體的參與。·用木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱為“Fab”片段，各自具有一個抗原結合位點，及一個剩余的“Fe”片段，其名稱反映了它易于結晶的能力。胃蛋白酶處理產生一個F (ab’)2片段，它具有兩個抗原結合位點且仍能夠交聯抗原。“Fv”是包含完整抗原識別和結合位點的最小抗體片段。在雙鏈Fv種類中，此區由緊密、非共價結合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈Fv種類中，一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域可以通過柔性肽接頭共價相連，使得輕鏈和重鏈在與雙鏈Fv種類類似的“二聚體”結構中相結合。正是在這種構造中，各可變域的三個HVR相互作用而在Vh-' 二聚體表面上確定了抗原結合位點。六個HVR共同賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使是單個可變域(或只包含對抗原特異的三個HVR的半個Fv)也具有識別和結合抗原的能力，只是親和力低于完整結合位點。Fab片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CHl)。Fab’片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CHl結構域的羧基末端增加了少數殘基，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸。Fab’ -SH是本文中對其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab’的稱謂。F(ab' )2抗體片段最初是作為在Fab’片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對Fab’片段生成的。還知道抗體片段的其它化學偶聯。根據其恒定域的氨基酸序列，來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(K)和拉姆達(λ)。根據其重鏈恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可歸入不同的類。免疫球蛋白有五大類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進一步分為亞類(同種型)，例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將與不同類的免疫球蛋白對應的重鏈恒定域分別稱作α、δ、ε、Y和μ。不同類的免疫球蛋白的亞基結構和三維構造是眾所周知的。“抗體片段”只包含完整抗體的一部分，其中所述部分優選保留該部分存在于完整抗體中時通常與之有關的至少一項、優選大多數或所有功能。抗體片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab' )2和？￥片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。在一個實施方案中，抗體片段包含完整抗體的抗原結合位點，如此保留結合抗原的能力。在另一個實施方案中，抗體片段，例如包含Fe區的抗體片段，保留通常與Fe區存在于完整抗體中時通常與之有關的至少一項生物學功能，諸如FcRn結合、抗體半衰期調控、ADCC功能和補體結合。在一個實施方案中，抗體片段是體內半衰期與完整抗體基本上相似的單價抗體。例如，這樣的抗體片段可包含一個抗原結合臂且其與能夠賦予該片段以體內穩定性的Fe序列相連。術語“高變區”、“HVR”或“HV”在用于本文時指抗體可變域中序列上高度可變和/或形成結構上定義的環的區域。通常，抗體包含六個HVR :三個在VH中(HI、H2、H3)，三個在VL中(LI、L2、L3)。在天然抗體中，H3和L3展示這六個HVR的最大多樣性，而且認為特別是H3在賦予抗體以精密特異性中發揮獨特作用。參見例如Xu et al.,Immunityl3:37-45 (2000);Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed. , HumanPress, Totowa, NJ, 2003)。事實上,僅由重鏈組成的天然存在camelid抗體在缺乏輕鏈時是有功能的且穩定的。參見例如 Hamers-Casterman et al. , Nature363:446-448 (1993) ; Sheriff et al. , Nature Struct. Biol. 3:733-736(1996)。本文中使用且涵蓋許多HVR的敘述。Kabat互補決定區(OTR)是以序列變異性為基礎的，而且是最常用的(Kabat et al. , Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD. (1991))。Chothia 改為指結構環的位置(Chothia and Lesk J.Mol·Biol. 196:901-917(1987)) o AbM HVR 代表 Kabat HVR 與 Chothia 結構環之間的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件的使用。“接觸(contact) TVR是以對可獲得的復合物晶體結構的分析為基礎的。下文記錄了這些HVR中每一個的殘基。
權利要求
1.一種抗EGFL7抗體，其包含可變域，該可變域包含下述高變區(HVR)序列(i )包含 KxiSx2Sx3DYx4GDSYx5S 的 HVR-Ll，其中 X1 為 A 或 R ;X2 為 H 或 Q ;X3 為 G 或 V ;X4 選自 0，1^，1 ，5，和胃；且父5為]\1或￥ (SEQ ID NO :210)；(ii)包含GASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1 為 N 或 Y ;X2 選自 L，R 和 Y ;且 X3 為 Q 或 S(SEQID NO 211)；(iii)包含QQNNeX1PX2T 的 HVR-L3，其中 X1 為 D 或 E ;且 X2 為 F 或 Y (SEQ ID NO :212);(iv)包含GX1X2X3X4TYGX5S 的 HVR-Hl，其中 X1 為 H 或 V ;X2 為 R 或 T ;X3 選自 F，G，R，和S;X4 選自 0，6，1 ，和1';且父5為]\1或￥ (SEQ ID NO :213)；(V)包含 GffINX1X2SGVPTX3AX4X5X6X7X8 的 HVR-H2，其中 X1 選自 I，M，T，和 W ;X2 為 H 或 R ;X3選自I，M，T，和Y ;X4為D或H ;X5選自D，M和T ;X6為F或Y ;X7為K或S ;且X8為G或R(SEQ ID NO :214)，和(Vi )包含 AxiLGSx2AVDx3 的 HVR-H3，其中 X1 為 N 或 R ;X2 選自 C，R，H，和 Y ;且 X3 為 A 或Y (SEQ ID NO :215)。
2.權利要求I的抗體，其中HVR-Ll包含氨基酸序列KASQSVDYS⑶SYMS(SEQ IDNO: 234)，HVR-L2 包含氨基酸序列 GASYRES (SEQ ID NO: 235)，HVR-L3 包含氨基酸序列 QQNNEEPYT (SEQ ID NO: 236)，HVR-Hl 包含氨基酸序列 GHTFTTYGMS (SEQ ID NO: 34)，HVR-H2包含氨基酸序列GWINTHSGVPTYADDFKG (SEQ ID NO: 35)，且HVR-H3包含氨基酸序列ARLGSYAVDY(SEQ ID NO:237)。
3.一種抗EGFL7抗體，其包含下述HVR序列包含選自SEQ ID NO :37-43的氨基酸序列的HVR-Ll，包含選自SEQ ID NO 44-47的氨基酸序列的HVR-L2，包含SEQ ID NO 48的氨基酸序列的HVR-L3，包含選自SEQ ID NO :49-57的氨基酸序列的HVR-Hl，包含選自SEQ IDNO 58-73的氨基酸序列的HVR-H2，和包含選自SEQ ID NO :74-77的氨基酸序列的HVR-H3。
4.權利要求1-3任一項的抗體，其中重鏈包含下述框架序列包含EXiQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 的 FR-H1，其中 X1 為 I 或 V (SEQ ID NO :216)；包含WVRQAPGKGLEffX1 的 FR-H2，其中 X1 為 I、M 或 V (SEQ ID NO :217);包含 RfTX1SX2DX3SX4X5TX6YLQMNSLRAEDTAVYX7CAR 的 FR-H3，其中 X1 為 F 或 I ;X2 為 L 或 R ;X3 為 N 或 T，X4 選自 A，E，K 和T ;X5 為 N 或 S ;X6 選自 A，L，M，T 和 V ;且 X7 為 F 或 Y(SEQ ID NO :218);和包含 WGQGTLVTVSS的 FR-H4 (SEQ ID NO :219)。
5.權利要求4的抗體，其中重鏈包含下述框架序列包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS的 FR-Hl (SEQ ID 勵197);包含叭1^^61 1^驟的？1 -!12 (SEQ ID NO : 198);包含 RFTISX^NSKNTx2YLQMNSLRAEDTAVYYCAR 的 FR-H3，其中 X1 為 L 或 R ;X2 選自 A，L，M，T 和 V (SEQ IDNO :220);和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR-H4 (SEQ ID NO :200)。
6.權利要求4的抗體，其中重鏈包含下述框架序列FR-H1包含EIQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:238) ；FR-H2 包含 WVRQAPGKGLEmKSEQ IDNO: 239) ；FR-H3 包含 RFTISXfNSKSTXJLQMNSLRAEDTAVYFCAR，其中 X1 為 L 或 R ;X2 選自 A、L、M、I^PV(SEQ ID NO:240);且 FR-H4 包含 WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 219)。
7.權利要求I的抗體，其中輕鏈包含選自下組的可變域序列(a)圖15(SEQ ID NO82)所示4F11. vl7的可變域序列；和(b)圖15 (SEQ ID NO 83)所示4F11. v22的可變域序列。
8.權利要求I的抗體，其中重鏈包含選自下組的可變域序列(a)圖16(SEQ ID NO84)所示4F11. vl7的可變域序列；和(b)圖16 (SEQ ID NO 85)所示4F11. v22的可變域序列。
9.權利要求I的抗體，其選自下組(a)—種抗體，其中輕鏈包含圖15(SEQ ID NO :82)所示4F11. vl7的可變域序列且重鏈包含圖16 (SEQ ID NO :84)所示4F11. vl7的可變域序列；和(b) 一種抗體，其中輕鏈包含圖15SEQ ID NO :83)所示4F11. v22的可變域序列且重鏈包含圖16 (SEQ ID NO 85)所示4F11. v22的可變域序列。
10.一種抗EGFL7抗體，其包含可變域，該可變域包含下述HVR序列⑴包含 X1X2X3X4X5X6VX7X8X9X10ITYLX11 的 HVR-Ll，其中 X1 選自 L，Q，R，S，和 T ;X2 選自 P，T，和W ;X3為H或S ;X4為D或Q ;X5為G或S ;X6為L或V ;X7為H或P ;X8選自I，L，P，T，和Y;X9選自10或3;父1(|選自六，6，和3;且父11為6或!1 (SEQ ID NO :222); (ii)包含RVSNX1X2S 的 HVR-L2，其中父1為0或1 ;且父2選自 A，G，F，I，和 T (SEQ IDNO :223)；(iii)包含X1QSX2X3VPLT 的 HVR-L3，其中 X1 選自 A，G，I，K，L，N，T，和 V ;X2 為 C 或 T ;且 X3 為 F 或 H (SEQ ID NO :224)；(iv)包含GYX1X2X3DX4YX5N 的 HVR-Hl，其中 X1 為 N 或 T ;X2 為 F 或 V ;X3 選自 I，M，R，和S;X4 選自 Y，Q，和 K;且父5為 I 或M (SEQ ID NO :225)；(V)包含 GDINX1X2X3X4X5X6HX7X8X9XiciX11X12X13 的 HVR-H2，其中 X1 選自 A，L，N，和 P ;X2 選自0，1^，和1 ;父3選自 G，K，N，13，和丫；父4為6或5;父5選自 G，I，K，R，S，T，和 V ;X6 選自 G，R，和T ;X7選自I，V，L，和Y ;X8為N或S ；X9選自A，N，和Q ；X10為K或V ；Xn為F或Q ；X12為K或 T ;且 X13 選自 G，H，R，和 S (SEQ ID NO :226);和(Vi )包含 X1Regvyhx2YDDYAx3DY 的 HVR-H3，其中 X1 選自 A，N，和 T ;X2 為 D 或 P ;且 X3 為M 或 W (SEQ ID NO :227)。
11.一種抗EGFL7抗體，其包含下述高變區(HVR)序列包含選自SEQ ID NO =106-124的氨基酸序列的HVR-Ll，包含選自SEQ ID NO : 125-129的氨基酸序列的HVR-L2，包含選自SEQ ID NO :130-145的氨基酸序列的HVR-L3，包含選自SEQ ID NO : 146-153的氨基酸序列的HVR-H1，包含選自SEQ ID NO =154-187的氨基酸序列的HVR-H2，和包含選自SEQ ID NO 188-192的氨基酸序列的HVR-H3。
12.權利要求10的抗體，其中HVR-Ll包含氨基酸序列RTSQSLVHINAITYLH(SEQIDNO:241)，HVR-L2包含氨基酸序列RVSNRFS(SEQ ID NO: 101)，HVR-L3包含氨基酸序列GQSTHVPLT(SEQ ID NO: 131)，HVR-Hl 包含氨基酸序列 GYTFIDYYMN(SEQ ID NO: 103)，HVR-H2包含氨基酸序列⑶INLDNSGTHYNQKFKG (SEQ ID NO: 242)，且HVR-H3包含氨基酸序列AREGVYHDYDDYAMDY(SEQ ID NO:105)。
13.權利要求10-12任一項的抗體，其中重鏈包含下述框架序列包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 的 FR_H1(SEQ ID NO : 197);包含 WVRQAPGKGLEWXi 的 FR-H2，其中 X1 為 I 或 V (SEQ ID NO :228);包含 RXJX2SX3DX4SX5X6TX7YX8QMNSLRAEDTAVYYC 的 FR-H3，其中X1 SF或V5X2S I或L5X3選自L，R，和V5X4S K或N ;&選自K，N，R，和S ;X6為N或3;父7選自六，1^，和￥;且父8為1^或皿(SEQ ID NO :229);和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR-H4 (SEQID NO 200)o
14.權利要求13的抗體，其中重鏈包含下述框架序列包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 的 FR-Hl (SEQ ID NO :197);包含 WVRQAPGKGLEWV 的 FR-H2(SEQ ID NO 198);包含 RFTISRDX1SKNTX2YLQMNSLRAEDTAVYYCAR 的 FR-H3，其中 X1 為 N 或 K ;且 X2 選自 A，LJPV (SEQ ID NO :230);和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR-H4 (SEQ ID NO :200)。
15.權利要求4、5、6、13或14的抗體，其中輕鏈包含下述框架序列包含DIQMTQSPSSLSASVOTRVTITC 的 FR-Ll (SEQ ID NO :201 )，包含 WYQQKPGKAPKLLIY 的 FR-L2(SEQ ID NO :202)，包含 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 的 FR-L3 (SEQ ID NO 203),包含 FGQGTKVEIK (SEQ ID NO :221)或 FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO :204)的 FR-L4。
16.權利要求10的抗體，其中輕鏈包含選自下組的可變域序列(a)圖27(SEQID NO 193)所示18F7. v6的可變域序列；和(b)圖27 (SEQ ID NO :194)所示18F7. v6k的可變域序列。
17.權利要求10的抗體，其中重鏈包含選自下組的可變域序列(a)圖28(SEQID NO 195)所示18F7. v6的可變域序列；和(b)圖28 (SEQ ID NO :196)所示18F7. v6k的可變域序列。
18.權利要求10的抗體，其選自下組(a)—種抗體，其中輕鏈包含圖27 (SEQ ID NO 193)所示18F7. v6的可變域序列且重鏈包含圖28 (SEQ ID NO :195)所示18F7. v6的可變域序列；和(b) —種抗體，其中輕鏈包含圖27SEQ ID NO :194)所示18F7. v6k的可變域序列且重鏈包含圖28 (SEQ ID NO :196)所示18F7. v6k的可變域序列。
19.權利要求1-3或10-12任一項的抗體，其中框架序列的至少一部分為人共有框架序列。
20.權利要求19的抗體，其選自下組(a)—種抗體，其包含人K亞組I共有框架序列；和(b) —種抗體，其包含重鏈人亞組III共有框架序列。
21.權利要求1-20任一項的抗體，其中所述抗體為雙特異性抗體。
22.權利要求21的雙特異性抗體，其中所述雙特異性抗體結合血管內皮生長因子(VEGF)0
23.權利要求22的雙特異性抗體，其中所述雙特異性抗體與bevacizumab或ranibizumab結合相同VEGF表位。
24.編碼權利要求1-23任一項的抗體的核酸。
25.包含權利要求24的核酸的載體。
26.包含權利要求24的核酸或權利要求25的載體的宿主細胞。
27.包含權利要求1-23任一項的抗體的組合物。
28.權利要求27的組合物，其中該組合物包含載體。
29.權利要求27或28的組合物，其為藥物組合物。
30.一種用于制備抗EGFL7抗體的方法,所述方法包括(a)在合適宿主細胞中表達權利要求25的載體，并(b)回收該抗體。
31.權利要求30的方法，其中該宿主細胞選自下組原核宿主細胞和真核宿主細胞。
32.權利要求1-23任一項的抗EGFL7抗體在制備藥物中的用途，該藥物用于在需要此類治療的個體中治療腫瘤、癌癥、或細胞增殖性病癥。
33.權利要求32的用途，其中該癌癥選自下組乳腺癌，結腸直腸癌，肺癌，食管癌，膀胱癌，卵巢癌，胰腺癌，和肝細胞癌。
34.權利要求32的用途，其中該細胞增殖性病癥為癌癥。
35.權利要求32-34任一項的用途，其中對個體施用有效量的第二藥物，其中抗EGFL7抗體為第一藥物。
36.權利要求35的用途，其中該第二藥物為另一種抗體、化療劑、細胞毒劑、抗血管發生劑、免疫抑制劑、前藥、細胞因子、細胞因子拮抗劑、細胞毒性放療劑、皮質類固醇、止吐劑、癌癥疫苗、止痛劑、或生長抑制劑。
37.權利要求36的用途，其中該第二藥物為抗VEGF抗體。
38.權利要求37的用途,其中該第二藥物為bevacizumab。
39.權利要求35-38任一項的用途，其中該第二藥物在施用抗EGFL7抗體之前或之后或與抗EGFL7抗體同時施用。
40.權利要求1-23任一項的抗體在制備藥物中的用途，該藥物用于在具有與血管發生有關的病理狀況的受試者中降低或抑制血管發生。
41.權利要求40的用途，其中所述病理狀況選自下組新生物狀況和非新生物狀況。
42.權利要求41的用途，其中所述非新生物狀況選自下組糖尿病性和其它增殖性視網膜病，早產兒視網膜病，新生血管性青光眼，老年性黃斑變性，糖尿病性黃斑水腫，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，視網膜/脈絡膜新血管形成。
43.權利要求1-23任一項的抗體在制備藥物中的用途，該藥物用于在具有與血管發生有關的病理狀況的受試者中增強抗血管發生劑的功效，其中與抗血管發生劑組合施用所述抗體，由此增強所述抗血管發生劑的抑制活性。
44.權利要求43的用途，其中該與血管發生有關的病理狀況選自下組(a)腫瘤、癌癥或細胞增殖性病癥；和(b)非新生物狀況。
45.權利要求44的用途，其中所述非新生物狀況選自下組糖尿病性和其它增殖性視網膜病，早產兒視網膜病，新生血管性青光眼，老年性黃斑變性，糖尿病性黃斑水腫，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，視網膜/脈絡膜新血管形成。
46.權利要求1-23任一項的抗體在制備藥物中的用途，該藥物用于在受試者中降低或抑制腫瘤灌注和滲透性。
47.權利要求46的用途，其中與抗血管發生劑一起施用所述抗體。
48.權利要求43-45或47任一項的用途，其中所述抗血管發生劑在施用抗EGFL7抗體之前或之后或與抗EGFL7抗體同時施用。
49.權利要求43-45、47或48任一項的用途，其中所述抗血管發生劑為抗VEGF劑。
50.權利要求49的用途，其中所述抗VEGF劑為抗VEGF抗體。
51.權利要求50的用途，其中所述抗VEGF抗體選自下組bevacizumab和ranibizumabο
全文摘要
本發明關注針對EGFL7的抗體及其用途。本發明關注人源化抗EGFL7抗體及其使用方法。
文檔編號A61K39/395GK102875677SQ20121036698
公開日2013年1月16日 申請日期2010年5月7日 優先權日2009年5月8日
發明者葉偉蘭, M.丹尼斯, J.弗雷德里克森 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司