一種大黃魚魚鰾降壓肽及其制備方法和用途
【專利摘要】本發明公開了一種大黃魚魚鰾降壓肽及其制備方法和用途，該降壓肽的氨基酸序列為Leu-Arg-Pro-Ile（SEQ?ID?No：1），ESI-MS檢測給出分子量為497.65Da（[M+H]+498.48Da）。制備時蒸餾水洗凈大黃魚魚鰾，用高速組織搗碎機勻漿，用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液抽提，硫酸銨分級沉淀得粗蛋白；粗蛋白經胰蛋白酶和堿性蛋白酶依次酶解，酶解物經離心、超濾和色譜精制，得到降壓肽。本發明降壓肽的制備工藝科學合理，雙酶酶解過程易于控制，制備的降壓肽對血管緊張素轉化酶（ACE）具有顯著的抑制作用，且具有易于消化吸收和安全無毒副作用等優點，可用作藥物和保健食品。
【專利說明】一種大黃魚魚鰾降壓肽及其制備方法和用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種魚類活性肽及其制備方法和用途，尤其涉及一種大黃魚魚鰾降壓肽及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002]人體血壓受多種因素的調節，其中最重要的因素是升壓系統(腎素一血管緊張素系統，RAS)和降壓系統(激肽釋放酶一激肽系統，KKS)之間的平衡。而血管緊張素轉化酶(ACE)是影響升壓系統和降壓系統平衡的重要因素。ACE主要通過三種方式升高人體血壓:
(I)將無活性的血管緊張素I (AngI)碳端的His-Leu切除，使血管緊張素I轉換為具有很強血管收縮活性的血管緊張素II (Ang II)，引起血壓升高；(2)使KKS系統中的降血壓物質緩激肽失活，導致血壓升高；(3)通過刺激腎上腺皮質釋放醛固酮，減少腎臟對水分和鹽的排泄，增加了細胞外液量和血漿量，加大靜脈回流量，間接引起血壓升高。因此，如果抑制了ACE的活性，就可能有效防治高血壓。
[0003]降血壓肽(ACEIP)，又稱為ACE抑制肽，可通過酶解食源蛋白獲得，其突出優點是只對高血壓患者起到降壓作用，對血壓正常者無降壓作用，不會有降壓過度現象發生。除降壓功能，ACEIP食用安全性高，較化學降壓藥物(如賴諾普利、培哚普利等)副作用小，還具有易消化吸收、免疫 促進，抗凝血和抗腫瘤等功能?；谑吃吹鞍捉祲弘木哂械莫毺貎烖c，已成為目前研究的熱點。
[0004]但是， 申請人:研究發現，以大黃魚魚鰾為原料，利用酶解技術制備大黃魚魚鰾降壓酶解產物的工藝研究處于空白階段，而以魚鰾酶解產物為材料制備降壓肽及其應用更是未見報道。

【發明內容】

[0005]本發明所要解決的第一個技術問題是針對上述的技術現狀提供一種大黃魚魚鰾降壓肽，該降壓肽降壓作用強、安全無毒副作用，易于消化吸收。
[0006]本發明所要解決的第二個技術問題是提供一種大黃魚魚鰾降壓肽的制備方法，該工藝科學合理。
[0007]本發明所要解決的第三個技術問題是提供一種大黃魚魚鰾降壓肽的應用。
[0008]本發明為解決上述第一個技術問題所采取的技術方案為:一種大黃魚魚鰾降壓肽，其特征在于該降壓肽的氨基酸序列為Leu-Arg-Pro-1Ie(SEQ ID No:1)，ES1-MS檢測給出分子量為 m/z 497.65 Da ([M+H]+ 498.48 Da)。
[0009]本發明為解決上述第二個技術問題所采取的技術方案為:一種大黃魚魚鰾降壓肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
I)大黃魚魚鰾蒸餾水洗凈、破碎勻漿，按料液比lg:8~10 ml的比例加入NaH2PO4-Na2HPO4 緩沖液(0.2mol/L，pH 7.0)，于 O ~4 °C下振蕩抽提 24 ~48 h，以 8000 ~12000 rpm的轉速離心15~25 min，得上清液；上清液中加入硫酸銨，使硫酸銨濃度(重量/體積百分比)達到30%，靜置I~3 h后，以8000~12000rpm的轉速離心15~25 min,去除沉淀物，上清液中繼續加入硫酸銨，使其濃度達到60% (重量/體積百分比)，靜置I~3 h后，以8000~12000 rpm的轉速離心15~25 min,得沉淀物并置于透析袋中用蒸懼水透析18~24 h，透析液冷凍干燥，得魚鰾粗蛋白；
2)取魚鰾粗蛋白，按照料液比Ig: 15~20 mL加入雙蒸水，調節pH值至7.5~8.0，于35~40°C保溫10~15 min ;按照魚鰾濕重的1.(Tl.5%加入第一種蛋白酶，于35~40°C溫度下酶解3~5 h ;酶解液調pH值至9.0-10.0,于4(T50°C保溫l(Tl5 min ;按照魚鰾濕重的
1.(Tl.5%加入第二種蛋白酶，于4(T50°C溫度下酶解2~4 h ；
3)將酶解液加熱到90~95°C滅活10~15min，4500~5000 rpm離心15~20 min，取上清液；上清液依次經超濾和層析，得到降壓肽。
[0010]作為優選,所述步驟2)中的第一種蛋白酶為胰蛋白酶,酶活力> 1.85 X IO5 U/g。
[0011]作為優選,所述步驟2)中的第二種蛋白酶為堿性蛋白酶，酶活力> 1.90X 105 U/
g°
[0012]作為改進，所述步驟3)的超濾和層析的具體過程為:
超濾:將上清液調至pH 6.5~7.5，于0.12~0.15 MPa的工作壓力和25~30 1:的工作溫度下采用I kDa的超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于I kDa組分，得超濾酶解液；
層析:將上述超濾酶解液用雙蒸水配成1(T15 mg/mL的溶液，經過大孔樹脂分離，用雙蒸水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和90%乙醇梯度洗脫，分別收集相應梯度的洗脫溶液，干燥，得四個組分；其中，ACE抑制活性最強組分為大孔樹脂純化酶解物；將上述大孔樹脂酶解物用雙蒸水配成1(T15 mg/mL的溶液，經過凝膠柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據220nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，ACE抑制活最強組分為凝膠層析酶解物，將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成80-100 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行純化，根據ACE抑制活性得I個高活性降壓肽Leu-Arg-Pro-1le (SEQ ID No:1)。
[0013]優選，所述大孔樹脂為DA 201-C，所述凝膠為S印hadex LH-20。
[0014]再優選，所述反相高效液相色譜條件為:進樣量15~20 μ L ;色譜柱為WatersSpherisorb 0DS-2 C18 ;柱溫為25~30 °C;流動相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；梯度洗脫:0~10 min乙腈濃度為10% ; 11~40 min乙腈濃度從10勻速升至60% ;洗脫速度0.8~1.0mL/min ;紫外檢測波長220 nm。
[0015]本發明為解決上述第三個技術問題所采取的技術方案為:一種大黃魚魚鰾降壓肽的應用，其特征在于大黃魚魚鰾降壓肽Leu-Arg-Pro-1le (SEQ ID No:1)對ACE具有顯著的抑制作用，可用作降壓藥品和保健食品。
[0016]與現有技術相比，本發明的優點在于:(I)本發明采用的原料是大黃魚魚鰾，經過本發明的技術轉化可有效提高大黃魚的加工附加值，對大黃魚產業的可持續發展具有重要意義；(2)本發明選用胰蛋白酶和堿性蛋白酶作為酶解用酶，通過生物酶解法同時融合超濾分級和色譜精制，使降壓肽最大程度地釋放；制備的降壓肽是魚鰾蛋白經酶水解制得，安全、無毒副作用，并且抑制ACE作用顯著，可用作降壓藥品和保健食品。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是本發明的大孔樹脂分離組分(F2)的凝膠Sephadex LH-20層析圖；圖2是本發明的S印hadex LH-20凝膠制備酶解物(F23)的RP-HPLC圖；
圖 3 是本發明的降壓肽 Leu-Arg-Pro-1le (SEQ ID No:1)的 RP-HPLC 圖；
圖4是本發明的Leu-Arg-Pro-1le (SEQ ID No:1)的質譜(ES1-MS)圖和結構式。
【具體實施方式】
[0018]以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0019]實施例1:一種大黃魚魚鰾降壓肽的制備方法,制備工藝流程如下:大黃魚魚鰾〃組織搗碎"緩沖液提取粗蛋白"雙酶酶解"酶解物"超濾"大孔樹脂分段"凝膠過濾層析〃高效液相色譜制備〃降壓肽。
[0020]I)大黃魚魚鰾洗凈、破碎勻 漿，按料液比lg: 10 ml的比例加入NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(0.2mol/L, pH 7.0),于4 °C下振蕩抽提48 h,以12000rpm的轉速離心15 min,得上清液；上清液中加入硫酸銨，使硫酸銨濃度(重量/體積百分比)達到30%，靜置I h后，以12000 rpm的轉速離心15 min,去除沉淀物,上清液中繼續加入硫酸銨,使其濃度達到60%(重量/體積百分比)，靜置2 h后，以12000rpm的轉速離心15 min，得沉淀物并置于透析袋中用蒸餾水透析24 h，透析液冷凍干燥，得魚鰾粗蛋白；
2)取魚鰾粗蛋白，按照料液比Ig: 20 mL加入雙蒸水，調節pH值至8.0，于35°C保溫10 min ;按照魚鰾濕重的1.0 %加入胰蛋白酶，于35 °C溫度下酶解4 h ;酶解液調pH值至
9.5，于45°C保溫10 min ;按照魚鰾濕重的1.5%加入堿性蛋白酶，于45°C酶解3 h ；
3)將酶解液加熱到90°C滅活15 min，5000rpm離心20 min，取上清液；上清液依次經超濾和層析，得到降壓肽。
[0021]①超濾:將酶解上清液調至pH 7.0,于0.12 MPa的工作壓力和30 V的工作溫度下采用I kDa的超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解液；
②DA201-C大孔樹脂分段:將上述超濾酶解液用雙蒸水配成1(T15 mg/mL的溶液，經過DA 201-C大孔樹脂分離，用雙蒸水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和90%乙醇梯度洗脫，分別收集相應梯度的洗脫溶液，干燥，得四個組分(F1-F4)，其中，50%乙醇洗脫組分的ACE抑制活性最強，記為大孔樹脂純化酶解物(F2)；
③SephadexLH-20凝膠層析:將上述大孔樹脂純化酶解物(F2)用雙蒸水配成15 mg/mL的溶液，經過Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據220 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，ACE抑制活性最強組分為凝膠層析酶解物(F23)(圖1)。
[0022]表1大黃魚魚鰾蛋白制備降壓肽時各制備組分的ACE抑制活性(η = 3)
【權利要求】
1.一種大黃魚魚鰾蛋白降壓肽，其特征在于該降壓肽的氨基酸序列為Leu-Arg-Pro-1le (SEQ ID No:1 )，分子量為 497.65 Da。
2.—種權利要求1所述的大黃魚魚鰾降壓肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)大黃魚魚鰾洗凈、破碎勻漿，按料液比Ig:8~10 ml的比例加入NaH2PO4-Na2HPOj^沖液(0.2mol/L，pH 7.0)，于O~4 °C下振蕩抽提24~48 h，以8000~12000rpm的轉速離心15~25 min，得上清液；上清液中加入硫酸銨，使硫酸銨濃度(重量/體積百分比)達到30%，靜置I~3 h后，以8000~12000rpm的轉速離心15~25 min，去除沉淀物，上清液中繼續加入硫酸銨，使其濃度達到60% (重量/體積百分比)，靜置I~3 h后，以8000~12000rpm的轉速離心15~25 min,得沉淀物,并置于透析袋中用蒸懼水透析18~24 h,透析液冷凍干燥，得魚鰾粗蛋白； 2)取魚鰾粗蛋白，按照料液比Ig:15~20 mL加入雙蒸水，調節pH值至7.5~8.0，于35~40°C保溫10~15 min ;按照魚鰾濕重的1.(Tl.5%加入第一種蛋白酶，于35~40°C溫度下酶解3~5 h;酶解液調pH值至9.0-ΙΟ.0，于4(T50°C保溫1(T15 min ;按照魚鰾濕重的1.(Tl.5%加入第二種蛋白酶，于4(T50°C溫度下酶解2~4 h ； 3)將酶解液加熱到90~95°C滅活10~15min，4500~5000 rpm離心15~20 min，取上清液；上清液依次經超濾和層析，得到降壓肽。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟2)中的第一種蛋白酶為胰蛋白酶，酶活力≥1.85X IO5 U/g。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟2)中的第二種蛋白酶為堿性蛋白酶，酶活力≥1.90X 105 U/g。
5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)的超濾和層析的具體過程為: 超濾:將上清液調至pH 6.5~7.5，于0.10~0.15 MPa的工作壓力和25~30°C的工作溫度下采用I kDa的超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解物； 層析:將上述超濾酶解物用雙蒸水配成1(T15 mg/mL的溶液，經過大孔樹脂分離，用雙蒸水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和90%乙醇梯度洗脫，分別收集相應梯度的洗脫溶液，干燥，得四個組分，其中，ACE抑制活最強組分為大孔樹脂純化酶解物；將上述大孔樹脂酶解物用雙蒸水配成1(T15 mg/mL的溶液，經過凝膠柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據220nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，ACE抑制活最強組分為凝膠層析酶解物，將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成80-100 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜進行純化，根據ACE抑制活性得I個高活性降壓肽Leu-Arg-Pro-1le (SEQ ID No:1)。
6.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于所述大孔樹脂為DA201-C，所述凝膠為葡聚糖凝膠S印hadex LH-20 ;所述RP-HPLC條件為:進樣量15~20 μ L ;色譜柱為WatersSpherisorb 0DS-2 C18 ;柱溫為25~30 °C;流動相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈;梯度洗脫:0~10 min乙腈濃度為10%; 11~40 min乙腈濃度從10勻速升至60% ;洗脫速度0.8~1.0mL/min ;紫外檢測波長220 nm。
7.—種權利要求1所述的大黃魚魚鰾降壓肽的應用，其特征在于Leu-Arg-Pro-1le(SEQ ID No:1)對ACE具有顯著的抑制作用，且具有易于消化吸收和安全無毒副作用等優點，可用作降壓藥品和保健食品。
【文檔編號】A61P9/12GK103980347SQ201410218251
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月22日 優先權日:2014年5月22日
【發明者】遲長鳳, 王斌, 陳蔭, 胡發遠 申請人:浙江海洋學院