專利名稱：來自蜂王漿的降壓肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及來自蜂王漿的蛋白分解物及其制造方法，以及含有該蛋白分解物的食品、口服制劑。本發明的蛋白分解物具有血管緊張素轉化酶抑制作用，對高血壓的預防或治療有效。
背景技術：
高血壓癥是一種沒有自覺癥狀，如果置之不理的話則繼發心臟病、腦血管病等重大疾病的疾病，高血壓的治療和預防是一個重大的課題。已知血管緊張素轉化酶(以下稱為ACE)與高血壓癥密切相關，通過抑制ACE可以預防或治療高血壓。
另一方面，預防或治療高血壓的藥品需要長時間攝取，因此具有極低的副作用也是一個重要的因素。現在，預防醫學的健康管理的觀念正在普及，這就要求開發出不用擔心副作用的預防高血壓的食品。
據說蜂王漿是蜜蜂為了養育母蜂王而從頭部的下咽頭腺和大顎腺分泌出的一種乳白色的膠狀物質，作為人類的食品所攝取的歷史很久，具有滋養、強壯、改善體質等各種廣泛作用。對該蛋白質的酶解產物進行了研究，也已經知道了具有ACE抑制活性的來自蜂王漿的肽(日本特開2002-145899；日本特開2002-338594；日本特開2005-255670；Journal of Nutritional Biochemistry 13(2002)，pp.80-86；診斷と新薬，第39卷，第2號，2002年，85-90頁；日本食品科學工學會誌，第50卷，第10號457-462頁(2003)；日本食品科學工學會誌，第50卷，第6號286-288頁(2003)；日本食品科學工學會誌，第50卷，第7號310-315頁(2003)；日本食品科學工學會誌，第51卷，第1號34-37頁(2004))。
但是，從經水解蜂王漿材料所得到的量和ACE抑制活性的強度、速效性、副作用、作用的持續時間、攝取的形狀、保存穩定性平衡的觀點考慮，這些肽還有面向工業化方向改善的余地。
雖然日本特開2005-255670公開了來自蜂王漿的ACE抑制肽，但是還要求具有強ACE抑制活性的肽。

發明內容
本發明的目的在于提供沒有副作用、具有預防高血壓作用的蛋白分解物、其制造方法、含有該蛋白分解物的食品以及口服制劑。
本發明的另一個目的在于提供一種具有速效性、效果持續性及保存穩定性的ACE抑制物質、含有該抑制物質的高血壓預防或治療劑。
本發明人對上述問題進行了反復地研究，結果發現，將生蜂王漿、干燥蜂王漿進行乙醇處理得到的變性蛋白質等蜂王漿材料利用蛋白分解酶，例如用胰蛋白酶進行水解，由此可以得到可以預防高血壓的蛋白分解物。
另外，本發明的蛋白分解物(含有四種分離的游離，下同)具有較強的ACE抑制作用，具有比由ACE抑制作用所預測的更強的高血壓預防或治療作用，推測該作用的一部分是基于抑制具有降壓作用的緩激肽分解的作用。
該蛋白分解物過敏作用等副作用小，是一種來自蜂王漿的安全食品，對正常高值或輕度高血壓等血壓較高人群，具有特別有用的降壓作用或高血壓預防作用，特別適合用作為特定保健用食品等的食品。
對正常高值和輕度高血壓的人群給用本發明的蛋白分解物，確認了顯著的血壓降低作用，并且攝取結束后，血壓緩慢上升，沒有超過攝取前值的反彈，脈搏、體重/BMI、血液檢查、尿液檢查無異常，沒有干咳、皮膚癥狀、消化系統癥狀等可能與蜂王漿分解物具有因果關系的副作用，是一種安全性較高的食品。
本發明提供以下發明。
1.一種具有血管緊張素轉化酶抑制作用的蛋白分解物，利用胰蛋白酶處理蜂王漿材料而得到，含有以下4種肽的至少一種Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
2.如上述1所述的蛋白分解物，其中蜂王漿材料是蜂王漿的醇變性蛋白質。
3.一種蛋白分解物，其來自蜂王漿材料，其中，用下式100×(相對于Gly(1摩爾)的蛋白分解物的Lys(mol))/(相對于Gly(1摩爾)的蜂王漿材料的Lys(mol))表示的以Gly為基準時Lys的酶解后的殘存率(摩爾比)為蜂王漿材料的70％以下。
4.一種蛋白分解物，其來自蜂王漿材料，其中，用下式(相對于Lys(1摩爾)的蛋白分解物的Leu(mol))/(相對于Lys(1摩爾)的蜂王漿材料的Leu(mol))表示的以Lys為基準時Leu的含有比例(摩爾比)為蜂王漿材料的1.3倍以上。
5.如上述3或4所述的蛋白分解物，其來自蜂王漿材料，實質上(実質的に)不含有(1)無機鹽類，和(2)選自酸性游離氨基酸、堿性游離氨基酸、具有醇羥基的游離氨基酸、游離Ala和游離Gly組成的組中的至少一種。
6.如上述5所述的蛋白分解物，其來自蜂王漿材料，實質上(実質的に)不含有(1)無機鹽類，和(2)游離酸性氨基酸、以及游離堿性氨基酸。
7.如上述6所述的蛋白分解物，其來自蜂王漿材料，實質上(実質的に)不含有(1)無機鹽類，和(2)酸性游離氨基酸(Asp，Glu)、堿性游離氨基酸(Lys，His，Arg)、具有醇羥基的游離氨基酸(Thr，Ser)、游離Ala和游離Gly。
8.如上述3～5任一項所述的蛋白分解物，其中，糖分的含量為35重量％以下，在40℃、6個月(鋁袋)的加速試驗條件下實質上(実質的に)不變色。
9.如上述3～6任一項所述的蛋白分解物，其中，經凝膠過濾柱分析實質上(実質的に)未發現分子量10000以上的成分，在分子量約200～約1500的范圍內具有最大的峰，具有分子量約200～約300的尖峰。
10.如上述3～6任一項所述的蛋白分解物，其中，平均分子量在約700～約6000的范圍內。
11.如上述1～10任一項所述的蛋白分解物，其中，使前述蛋白分解物通過具有下述特性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的柱(4.6mmφ×150mm)時，由下式表示的相關成分(関與成分)含量(％)為40％以上。
·苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的特性粒度分布；30μm細孔徑；250官能團；沒有適用pH范圍全區域。
·相關成分含量(％)＝A1/AT×100T1色氨酸的保留時間T210-羥基-δ-2-癸烯酸的保留時間A1從在T1的洗脫位置檢測的峰之后到在T2的洗脫位置檢測的峰之前的峰面積的總和AT所有的峰面積的總和。
12.如上述11所述的蛋白分解物，其中，前述相關成分含量為58±5％。
13.如上述1～11任一項所述的蛋白分解物，其中，含有在使前述蛋白分解物通過具有以下特性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的柱，并且用水(級分1，2)、20％甲醇(級分3)、40％甲醇(級分4)、60％甲醇(級分5)、80％甲醇(級分6)、100％甲醇(級分7)洗脫時的級分中的級分3～6粒度分布；＞250μm(含有90％以上粒徑大于250μm的粒子)細孔徑；400官能團；沒有適用pH范圍全區域。
14.如上述13所述的蛋白分解物，其中，在級分4中含有選自由Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；和Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr組成的組中的至少一種肽，在級分5中含有Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
15.一種高血壓的預防或治療劑，其以上述1～14任一項所述的蛋白分解物為有效成分。
16.一種食品，其含有上述1～14任一項所述的蛋白分解物。
17.如上述16所述的食品，其為高血壓預防用食品。
18.一種口服用制劑，其含有上述1～14任一項所述的蛋白分解物。
19.一種高血壓的預防或治療劑，其中，含有選自下述4種肽中的至少一種肽作為有效成分Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
20.如上述18所述的制劑，其為明確的食品和/或包含補充劑(サプリメント)的食品形態。
21.一種血管緊張素轉化酶抑制劑，其以上述1～14任一項所述的蛋白分解物為有效成分。
22.如上述1～14任一項所述的蛋白分解物的制造方法，其特征在于，用豬胰蛋白酶處理蜂王漿材料。
23.如上述22所述的方法，其特征在于，使用合成吸附劑對通過豬胰蛋白酶處理得到的蛋白分解物進行處理，除去(1)無機鹽類、和(2)選自酸性游離氨基酸、堿性游離氨基酸、具有醇羥基的游離氨基酸、游離Ala和游離Gly組成的組中的至少一種。
24.如上述22所述的方法，其特征在于，將通過豬胰蛋白酶處理得到的蛋白分解物吸附在苯乙烯-二乙烯基苯共聚物上，水洗除去無機鹽和水溶性氨基酸，然后用含水醇洗脫。
25.如上述24所述的方法，其中，苯乙烯-二乙烯基苯共聚物具有下述特性粒度分布＞250μm(含有90％以上粒徑大于250μm的粒子)細孔徑；400官能團；沒有適用pH范圍全區域。
26.一種新型肽，含有以下4種肽中的任何一種Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
發明效果本發明的來自蜂王漿材料的蛋白分解物通過口服顯示較強的ACE抑制作用，對高血壓的預防或治療有效。
本發明的蛋白分解物，其中使能夠成為抗原的分子量在2萬以上的蛋白質含量降低，優選的蛋白分解物中幾乎或者完全不含有能夠成為抗原的分子量在1萬以上的蛋白質。因此，本發明的蛋白分解物可以更強地抑制過敏反應，幾乎沒有發現過敏反應。
而且，本發明的蛋白分解物是在進行脈搏、體重·BMI、血液檢查、尿液檢查時沒有異常，沒有干咳、皮膚癥狀、消化器官癥狀等副作用的安全的物質。
在脫鹽操作后的本發明的蛋白分解物中，可以作為升壓物質的鹽類，特別是氯化鈉的含量非常低。并且，經脫鹽操作，游離氨基酸和糖類等其它成分的含量降低，抑制了吸濕性或美拉德反應等的化學反應，可以得到穩定性更高的蛋白分解物。
通過長期攝取本發明的蛋白分解物，可以使血壓緩慢而且持續地降低，對于正常血壓的受試者可以預防高血壓、進而可以預防高血壓引起的各種疾病。
本發明的蛋白分解物因為作用持續時間(8～12小時)長，血壓緩慢地降低，因此在服用了該蛋白分解物時，一天的血壓變動小，容易控制血壓。例如如果早晨服用，在活動時間使血壓降低，睡覺時不使血壓降低，因此，血壓高的人服用具有理想的作用方式。另外，服用中止后血壓緩慢地上升，沒有觀察到超過服用前的血壓的反彈。特別是在緩慢降低舒張期血壓這一方面，本發明的蛋白分解物或4種肽是優異的。
本發明的蛋白分解物的誘變試驗及抗原性試驗得到結果為陰性，血壓變動少，幾乎不影響心率、體重，是一種安全性優異的材料。
本發明的蛋白分解物適合具有高血壓癥的危險因子(遺傳性、環境因素等)的正常高值或輕度高血壓人群或高血壓患者攝取。


圖1顯示GFC分析結果。
具體實施例方式
本發明中，蜂王漿材料是指含有蜂王漿的蛋白質的材料，只要滿足上述條件就沒有特別限制，例如有生蜂王漿、干燥蜂王漿、對蜂王漿進行乙醇沉淀、硫酸銨處理、加熱處理等蛋白變性處理得到的蛋白沉淀物(包括乙醇沉淀物)、或者含有通過提取、過濾、離心分離、層析等各種方法對蜂王漿進行分級后的蛋白質的材料。
蜂王漿可以是任何一種，可以廣泛使用蜜蜂為了養育蜂王而分泌的蜂王漿。具體地說，蜂王漿是將蜜蜂中的工蜂從下咽頭腺及大顎腺分泌的分泌物混合而成的乳白色的膠狀物質。
來自蜂王漿的蛋白質級分可以適合使用將蜂王漿進行醇沉淀而得到的蛋白級分。特別優選使用在制造蜂王漿飲料時作為水不溶性蛋白副產物產生的蜂王漿的乙醇變性蛋白質。乙醇變性蛋白質可以是用約50～約100體積％的乙醇從蜂王漿中提取癸烯酸等飲料用生理活性物質后的殘渣的對水溶解度小的蛋白質。
含有4種肽的本發明的蜂王漿材料的酶解產物可以利用胰蛋白酶進行水解得到。胰蛋白酶有通過胰蛋白酶原的限制性水解生成的活性α-胰蛋白酶和β-胰蛋白酶，可以使用其中的任何一種。另外，也可以將凝血酶、纖維蛋白血溶酶、激肽釋放酶、尿激酶等底物特異性和催化機理相似的類胰蛋白酶作為胰蛋白酶使用。而且，可以使用通過對胰蛋白酶(包含類胰蛋白酶)的一種以上的氨基酸進行置換、添加、缺失、插入等變性的變異型酶。該變異型胰蛋白酶和類胰蛋白酶也包含在本發明的蜂王漿材料的酶解中所使用的胰蛋白酶中。胰蛋白酶的來源例如有牛、豬、羊、人等哺乳動物。在蜂王漿材料的水解中也可以使用從牛、豬等哺乳動物的胰臟提取出來的胰蛋白酶，也可以使用通過基因重組而得到的胰蛋白酶。
作為用胰蛋白酶處理蜂王漿材料的條件，例如通過在水性溶劑中在約15℃到約60℃，優選約20℃到約50℃，特別是37℃左右處理約1～約72小時，優選處理約3～約48小時，可以較好地實施。胰蛋白酶的使用量例如相對于每100g蛋白質為約0.01～約3g，優選約0.05～約1g。胰蛋白酶可以使用游離的酶，也可以使用固定在載體上的酶。胰蛋白酶具體可以優選使用由Novozyme制造的來自豬的胰蛋白酶。
酶反應液的pH為約6～約10，優選約7～約9。用胰蛋白酶水解蜂王漿材料時，由于pH慢慢下降，因此優選使用堿金屬氫氧化物(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀)、堿金屬碳酸鹽(例如碳酸鈉、碳酸鉀)、堿金屬碳酸氫鹽(例如碳酸氫鈉、碳酸氫鉀)等堿，使pH保持在一定范圍內。
反應液適合使用水，也可以在含有少量乙醇等水混溶性有機溶劑的含水醇等水性溶劑中進行。
通過對酶解產物(酵素分解物)的反應液進行熱處理、以及根據需要進一步進行離心分離、過濾、提取、脫鹽、凍干(或噴霧干燥)等后處理，可以得到本發明的蛋白分解物。例如，使用生蜂王漿或干燥蜂王漿作為蜂王漿材料的情況下，也可以除去來自蜂王漿的糖類等成分。在本發明的優選實施方式之一中，本發明的蜂王漿材料的蛋白分解物利用凝膠過濾柱測定的分子量為約200～約7000，特別是約250～約6000，具有分子量約200～約300的尖峰，和在分子量約200～約1500的范圍內具有最大峰。從凝膠過濾柱的測定結果推定的蛋白分解物的推定分子量為約700～約6000，優選約800～約5000。
在本發明的其他優選的實施方式之一中，本發明的蜂王漿材料的蛋白分解物實質上(実質的に)不含有糖類、鹽類、以及選自酸性游離氨基酸、堿性游離氨基酸、具有醇羥基的游離氨基酸、游離Ala和游離Gly組成的組中的至少一種。如前所述，在用胰蛋白酶處理蜂王漿材料的情況下，在蛋白水解時，優選加入堿如氫氧化鈉等維持反應液的pH為對胰蛋白酶合適的pH即約6～約10，特別是pH約7～約9。這樣添加的堿(例如氫氧化鈉)，在酶反應后向反應液中添加酸(例如鹽酸)，將pH調整為約3.5～約7，優選約4～約5.5，將堿(例如氫氧化鈉)變成對應的鹽(例如氯化鈉)。這時生成的大量的鹽特別是氯化鈉等含鈉的鹽的情況下，由于鈉是升壓物質，因而優選除去。該脫鹽可以通過例如使用脫鹽柱實施，具體而言，使用含有苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的疏水性的合成吸附劑(例如ダイヤイオンHP-20(由三菱化學制造)、セパビ一ズSP-70(由三菱化學制造)吸附蛋白分解物，用水洗滌除去氯化鈉等鹽，然后使用甲醇、乙醇、乙腈等合適的有機溶劑進行洗脫，由此可以得到脫鹽的、實質上不含無機鹽類的蛋白分解物。當在脫鹽中使用合成吸附劑時，例如難以吸附于疏水性的合成吸附劑上的Asp、Glu、Lys、Arg等的酸性或堿性游離氨基酸等會和無機鹽類一起除去，另一方面，Phe、Leu、Ile、Trp、Val等為疏水性的容易吸附于合成吸附劑上的游離氨基酸即使通過脫鹽操作也難以除去。另外，Ser、Thr等具有醇羥基的游離氨基酸、以及游離Ala，游離Gly等也難以吸附在疏水性的合成吸附劑上，因而和酸性或堿性的游離氨基酸同樣地容易與無機鹽類一起被除去。
本發明的一個實施方式中，在蜂王漿的蛋白分解物中產生較多的游離Lys，但通過使用合成吸附劑柱進行的脫鹽處理，大部分被水洗除去，因而在用乙醇等洗脫回收的分級的蛋白分解物中實質上不含有游離Lys。
本發明的另一實施方式中，在蜂王漿的蛋白分解物中也存在很多游離Ala，對于游離Ala，通過使用合成吸附劑柱進行的脫鹽處理將其大部分水洗除去，因而在用乙醇等洗脫回收的分級的蛋白分解物中實質上不含有游離Ala。
這里，所說的“實質上不含有游離氨基酸”是指該游離氨基酸的含量為約0.01μmol/10mg以下，優選為約0.001μmol/10mg以下，更優選為0.0001μmol/10mg以下。
在本說明書中，“酸性氨基酸”是指Glu和Asp，堿性氨基酸是指Lys、His、Arg，具有醇羥基的氨基酸是指Thr、Ser。
優選的實施方式之一中，本發明的蛋白分解物中的鹽類(特別是氯化鈉)的含量為1重量％以下，更優選0.2重量％以下，進一步優選0.1重量％以下，特別是檢測限以下。
如上所述，經脫鹽處理雖然堿性游離氨基酸、酸性游離氨基酸、醇性游離氨基酸、游離Ala、游離Gly等的濃度降低，但是ACE抑制活性幾乎或完全沒有降低。認為這是由于堿性游離氨基酸、酸性游離氨基酸、醇性游離氨基酸、游離Ala和游離Gly等對ACE抑制活性的貢獻率低的原因。
本發明的優選的另外的一個實施方式中，本發明的蛋白分解物中在以Gly為基準時Lys的殘存率(以摩爾數比較)為蜂王漿材料的25～70％，30～60％，35～55％，40～50％。例如對于本發明的實施例得到的蛋白分解物，酶解(酵素分解)前的蜂王漿材料(乙醇沉淀物)相對于Gly(1摩爾)，Lys為(1.1摩爾)酶解產物(酵素分解物)(用填充有合成吸附劑的柱處理脫鹽后，回收的樣品)相對于Gly(1摩爾)，Lys為(0.5摩爾)故根據數學式1計算Lys的殘存率為，100×(0.5/1.1)＝約45％。
雖然根據蜂王漿材料、分解條件的不同多少有些變動，但是在通過合成吸附劑吸附蛋白分解物進行脫鹽的情況下，很明顯游離Lys的含有濃度和原來的分解物相比降低了。
本發明的優選的其它的一個實施方式中，本發明的蛋白分解物中，在以Lys為基準時Leu的含有比例(摩爾比)為蜂王漿材料的約1.3～約3.5倍，例如為約1.5～約3倍，約1.7～約2.7倍或約2～約2.5倍。例如對于由本發明實施例所得到的蛋白分解物，酶解前的蜂王漿材料(乙醇沉淀物)相對于Lys(1摩爾)，Leu為(約1.1摩爾)酶解產物(用填充有合成吸附劑的柱脫鹽后，回收的樣品)相對于Lys(1摩爾)，Leu為(約2.5摩爾)因此，根據數學式2計算Leu的含有比例(摩爾基準)為，2.5/1.1＝約2.3倍在本發明的蛋白分解物中，比未分解的高分子量的蛋白質、胰蛋白酶等殘留時，根據需要可以利用超濾等除去。
本發明的優選的其它的一個實施方式中，優選本發明的蛋白分解物中來自蜂王漿的糖類含量低。糖類(糖分)含量只要不破壞蛋白分解物的質量即可，沒有特別限定，通常為35重量％以下，優選為30重量％以下，更優選為25重量％以下。糖分例如有葡萄糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖等單糖或二糖。這些糖分由于在保存時和蛋白分解物緩慢反應(例如美拉德反応)，使蛋白分解物變成褐色，或導致吸濕性升高，因此希望盡可能地除去。
本發明的蛋白分解物可以在酶處理后優選通過進行脫鹽處理來制造，還可以進一步通過柱等處理收集ACE抑制活性更強的級分。然后，根據需要經反復進行同樣的純化，分離具有ACE抑制作用的肽，分離或濃縮該生理活性肽，用作具有ACE抑制作用的蛋白分解物。
對于ACE抑制肽而言，例如，將本發明的蛋白分解物施加至合成吸附劑或凝膠過濾劑、分子篩、反相色譜等中，用水、甲醇、乙醇、或這些的混合溶液等適當洗脫液進行洗脫，分離成各種級分，對ACE抑制活性強的級分利用制備型HPLC等常規方法分離肽，經結構鑒定也可以分離ACE抑制活性強的肽。
本發明的優選的一個實施方式中，使蜂王漿材料經胰蛋白酶進行處理得到的蛋白分解物吸附在作為合成吸附劑之一的HP-20柱上，根據下述流程圖1，可以分級成7個級分。
另外，本說明書中，有時將級分(Fraction)簡寫為“Fr”或“P”。例如級分4可以寫作“Fr4”或“P4”。
流程圖1蜂王漿蛋白水解液855mL(相當于凍干物50g)↓加到ダイヤイオンHP20(柱尺寸φ11cm×20cm、容量約1.9L)上↓洗滌液使用水3260mL↓洗脫液20％、40％、60％、80％、100％MeOH↓·20％甲醇使用2460mL↓·40％甲醇使用2340mL↓·60％甲醇使用2720mL↓·80％甲醇使用2300mL↓·100％甲醇使用3200mL洗滌液及各洗脫液↓使用蒸發器(40℃)濃縮各濃縮液↓凍干水洗滌級分級分1和220％甲醇洗脫級分級分340％甲醇洗脫級分級分460％甲醇洗脫級分級分580％甲醇洗脫級分級分6
100％甲醇洗脫級分級分7在上述級分中，優選含有級分3～6的制品。也可以含有級分7，但因為級分7的收率少，所以含有級分3～6的蛋白分解物顯示充分的降壓作用。另外，級分1，2盡管可以顯示出ACE抑制作用，但是因為含有氨基酸和無機鹽類(例如NaCl)，所以不是必須包含在本發明的蛋白分解物中。
本發明的蛋白分解物，當通過具有下述特性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(商品名三菱化學公司制MCI-GEL，CHP55Y)的柱(4.6mmφ×150mm)時，由下述式表示的相關成分含量(％)為35％以上，優選為40％以上，更優選為50％以上，進一步優選為50～70％，特別優選為58±5％、最優選為58±3％，·相關成分含量(％)＝A1/AT×100T1色氨酸的保留時間T210-羥基-δ-2-癸烯酸的保留時間A1從在T1的洗脫位置檢測的峰之后到在T2的洗脫位置檢測的峰之前的峰面積的總和AT所有的峰面積的總和。
·苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的特性粒度分布；30μm細孔徑；250官能團；沒有適用pH范圍全區域柱(4.6mmφ×150mm)在上述A1中，主要含有級分4和級分5。
蜂王漿蛋白水解物(被分析物)的相關成分含量的測定例如可以在以下的條件(試驗方法)下進行。
試驗方法稱量本品0.50g，添加水/甲醇混合液(1∶1)10mL溶解，并且制成50mL。用薄膜過濾器(0.45μL)過濾該液體，將濾液作為待檢液體。
或者，稱量本品0.50g，添加水/甲醇混合液(1∶1)10mL及磷酸緩沖液(pH8.0)1)10mL進行溶解，再添加水15mL和稀醋酸2)5mL并充分地振蕩混合，加水制成50mL。用薄膜過濾器(0.45μL)過濾該溶液，將濾液作為待檢液體。
另外，稱量1mg色氨酸3)及甘氨酰-L-亮氨酰-L-酪氨酸4)5mg，添加醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.0)5)5mL進行溶解，再加水制成10mL，作為A液。
稱量10-羥基-δ-癸烯酸標準品6)5mg，添加水/甲醇混合液(1∶1)0.5mL進行溶解。在該溶液中添加A液0.5mL，充分混合，作為比較液。
分別取待檢液體和比較液各50μL，在下述操作條件下進行液相色譜測定。將比較液的色氨酸及10-羥基-δ-2-癸烯酸的保留時間設為T1及T2，測定從在待檢液體的T1的洗脫位置檢測的峰之后到在T2的洗脫位置檢測的峰之前的峰面積的總和A1及全部的峰面積的總和AT，經下式求出相關成分含量。
相關成分含量(％)＝A1/AT×100操作條件檢測器紫外分光光度計(測定波長275nm)柱向內徑4.6mm，長度150mm的不銹鋼管中填充30μm的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物反相用聚合物7)。
柱溫50℃左右的恒定溫度流動相A水/甲醇混合液(199∶1)
B甲醇/水混合液(19∶1)流速*1mL/分鐘梯度條件0分 → 10分A∶B＝92∶8 保持10分→ 12分A∶B＝92∶8 →A∶B＝50∶50直線12分→ 22分A∶B＝50∶50 保持22分→ 30分A∶B＝50∶50→A∶B＝10∶90直線30分→ 45分A∶B＝10∶90 保持45.01分 → 55分A∶B＝92∶8 保持面積測定范圍10-羥基-δ-2-癸烯酸保留時間的約1.5倍的范圍*對于流速和梯度條件，進行適當地調整，以滿足下述系統適合性。
系統適合性系統的性能對于比較液50μL，在上述的操作條件下進行液相色譜測定時，以色氨酸、甘氨酰-L-亮氨酰-L-酪氨酸、10-羥基-δ-2-癸烯酸的順序洗脫，色氨酸和甘氨酰-L-亮氨酰-L-酪氨酸的分離度為3以上，甘氨酰-L-亮氨酰-L-酪氨酸和10-羥基-δ-2-癸烯酸的分離度為5以上。
注1)磷酸緩沖液(pH8.0)按照日本食品添加劑標準(食品添加物公定書)進行制備。
2)稀醋酸按照日本食品添加劑標準進行制備。
3)L-色氨酸使用C11H12N2O2，和光純藥工業株式會社公司制造的特級試劑或同等質量的產品。
4)甘氨酰-L-亮氨酰-L-酪氨酸使用C17H25N3O5，フルカ(リ一デル·デ·ハ一ン)公司制的含量為98％以上或同等質量的產品。
5)醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.0)將醋酸鈉三水合物5.44g溶解在水900mL中，滴加醋酸(100)，將pH調整為4.0之后，添加水至1000mL。
6)10-羥基-δ-2-癸烯酸標準品使用(E)-10-羥基-δ-2-癸烯酸標準品(C10H18O3)，由和光純藥工業株式會社公司制造或同等質量的產品。
(7)苯乙烯-二乙烯基苯共聚物反相用聚合物使用三菱化學公司制造的MCI-GEL CHP55Y或同等質量的產品。
下面，對級分3～6的相關成分(肽)的分離和其鑒定按如下所述進行。
(a)經大口徑柱分離HPLC條件柱TSK-gel ODS 120T 55mmφ×300mm東ソ一保護柱TSK-gel ODS 120T 45mmφ×55mm東ソ一流動相水/乙腈混合液*/0.05％TFA流量42mL/分鐘柱溫室溫檢測波長220nm*乙腈濃度7～25％、50％(洗出)(b)經中口徑柱分離HLPC條件柱COSMOSIL-5C18-AR II 20mmφ×250mmナカライテスク和/或COSMOSIL-5C18-AR II 10mmφ×250mmナカライテスク流動相水/甲醇混合液*/0.05％TFA流量8mL/分鐘或2mL/分鐘柱溫40℃檢測波長220nm*甲醇濃度等度(イソクラテイツク)方式2～35％、50％(洗出)梯度方式A液0％(0.05％TFA)、B液50％(c)各分部分離液(分取液)的純度的確認<HLPC條件>
檢測器紫外分光光度計(測定波長220nm)柱COSMOSIL-5C18-AR II 4.6mmφ×250mmナカライテスク
流動相水/甲醇混合液*/0.05％TFA流量0.4mL/分鐘柱溫40℃*甲醇濃度2～40％ACE抑制率的測定測定純度為85％以上的級分的ACE抑制率。
另外，也進行純度為85％以下的樣品的一部分測定。
ACE抑制率的測定方法試樣溶液(反應液中濃度0.1mg/mL)25μL↓ACE溶液(來自兔肺的血管緊張素I轉化酶25mU/mL)50μL預溫育(プレインキユベ一ト)37℃-5分鐘↓底物溶液(馬尿酰-L-組氨酰-L-亮氨酸12.5mM)50μL溫育(インキユベ一ト)37℃-60分鐘↓鹽酸(9→200)125μL↓內標液(m-馬尿酸0.625mM)100μL↓乙酸乙酯750μL↓渦流混合機10秒×2離心分離(2000rpm，5分鐘)↓有機層500μL↓在60℃、氮氣氣流下干燥硬化↓流動相500μL↓用渦流混合機溶解將20μL注入HPLC<HPLC條件>
檢測器紫外分光光度計(測定波長228nm)柱L-column ODS 4.6mmφ×150mm，化學物質評價研究機構流動相0.01M磷酸緩沖液(pH3.0)/乙腈混合液(17∶3)流量1.0mL/分鐘柱溫40℃注射量20μL(d)組成氨基酸(構成アミノ酸)的測定對于分離量為2mg以上或ACE抑制率為20％以上的級分，在加酸水解之后測定氨基酸濃度，求出組成氨基酸。
組成氨基酸的測定方法<加酸水解法-1不含色氨酸的分離肽>
試樣溶液(1mg/mL 50％甲醇溶液)50μL↓使用Pico-Tag(Waters)在減壓條件下干燥硬化(室溫)殘留物↓+6mol/L鹽酸溶液(含有1％苯酚)0.2mL(放入反應瓶中)↓經Pico-Tag法水解(110℃、22小時)↓冷卻后↓使用Pico-Tag在減壓條件下干燥硬化(室溫)殘留物↓+0.02mol/L鹽酸試液0.25mL(稀釋5倍)20μL/氨基酸分析<加酸水解法-2含有色氨酸的分離肽>
試樣溶液(1mg/mL 50％甲醇溶液)50μL↓使用Pico-Tag(Waters)在減壓條件下干燥硬化(室溫)殘留物↓+4mol/L甲磺酸溶液(含有0.2％的色胺)20μL↓+水0.2mol/L(放入反應瓶中)↓經Pico-Tag法水解(110℃、22小時)↓冷卻后↓+4mol/L氫氧化鉀溶液22μL
↓使用Pico-Tag在減壓條件下干燥硬化(室溫)殘留物↓+0.05mol/L鹽酸試液0.25mL(稀釋5倍)20μL/氨基酸分析<氨基酸分析條件>
(利用茚三酮反應的后標記法)裝置L-8500型日立高速氨基酸分析計柱4.6mmID×80mm日立カスタムイオン交換樹脂(#2622SC，LotNo.K99272)(Na型、高分離分析、梯度法)緩沖液日立高速氨基酸分析計用緩沖液L-8500PH-KIT(由三菱化學或和光純藥公司制造)V1PH-1(向PH-1 500mL中添加乙醇(99.5)65mL和水，制成1000mL)V2PH-2V3PH-3(未使用)V4PH-4V5PH-RG反應液茚三酮試液-L8500套裝(由和光純藥公司制造)流量緩沖液0.26mL/分鐘反應液0.30mL/分鐘注射量20μL測定波長570nm(Pro440nm)(e)氨基酸序列的測定基于ACE抑制率和組成氨基酸的測定結果，可以推測ACE抑制活性率比較高，含量較多，并且對于純度較高的肽，嘗試通過N-末端氨基酸分析法(埃德曼降解法)對氨基酸序列進行解析。
埃德曼降解法的操作條件試樣溶液的制備方法量取一定量的各試樣，各自添加純化水溶解，達到1nmol/μL。進一步用純化水稀釋10倍，達到100pmol/μL。其中，使用各2μL(200pmol)，用下述裝置測定。
裝置多肽氨基酸序列測定儀(PPSQ-23A，SHIMADZU)PTH分析儀(SPD-10A，SHIMADZU)序列明細表(シ一ケンススケジユ一ルフアイル)(standard GFD)測定結果對于推測為ACE的抑制活性率比較高，含量較多的肽，嘗試經埃德曼降解分析氨基酸序列。
結果是，可以鑒定出結構的是4個檢測樣(A1～A4)，從HP-20的粗級分的Fr4部分可以鑒定3種肽的結構，從Fr5部分可以鑒定1種肽的結構。
將根據它們的結構式及ACE抑制率的測定結果所求得的ACE抑制活性IC50值示于下述的表1中。
表1

本發明的蛋白分解物(含有鑒定為有效成分或相關成分的前述4種肽。以下相同)可以調整到等電點的pH后，作為游離(自由)的蛋白質分解物使用，或者調整到比等電點偏酸性或偏堿性的一側的pH之后，通過凍干、噴霧干燥等除去溶劑，或者添加乙醇等的溶劑使其沉淀等方法，由此可以得到酸加成鹽(鹽酸鹽等無機酸鹽或富馬酸鹽等有機酸鹽)或堿鹽(例如Na，K等的堿金屬鹽)的形式。堿鹽優選盡可能降低升壓物質即鈉的含量。這樣的蛋白分解物可以在溶液形態下使用，通常優選以固形物，例如結晶、非晶形或粉末的形態分離，使用。
本發明的蛋白分解物本身可以用作食品，或者單獨或和適當的無毒口服用載體、稀釋劑或賦型劑一起做成片劑(未包衣片、糖衣片、泡騰片、薄膜包衣片、咀嚼片等)、膠囊劑、錠劑、粉末劑、細粒劑、顆粒劑、液體制劑、懸濁液、乳濁液、糊劑、霜劑、注射劑(包括添加到氨基酸輸液、電解質輸液等的輸液中的情況)、或者可以做成用于腸溶性片劑、膠囊劑、顆粒劑等緩釋制劑等的食品或藥品制劑。前述制劑中的蛋白分解物的含量可以適當選擇，一般是0.01～100重量％的范圍。
另外，通過添加、混合本發明的蛋白分解物(蜂王漿酶解產物)制備得到的食品的具體形態例如有飲料類(清涼飲料(咖啡、可可飲料、果汁、礦物質飲料、茶飲料、綠茶、紅茶、烏龍茶等)、乳飲料、乳酸菌飲料、酸乳飲料、碳酸飲料、酒類(日本米酒、洋酒、果酒、蜂蜜酒等)等)、涂抹食品(スプレツド)(乳蛋糕乳脂、加糖奶油漿、花生醬、巧克力醬、涂抹干酪等)、糊狀物(果泥、蔬菜泥、芝麻糊、海藻糊等)、洋點心(巧克力、炸面圈、餡餅、奶油面包、手指形小蛋糕、松餅、華夫餅干、口香糖、Gummi糖、果凍、糖果、曲奇餅、克力架、餅干、方便點心、蛋糕、布丁等)、日式點心(飴糖、日本脆餅干、油炸糖點心、米雪、米粉團、牡丹餅、年糕餅、豆餅、餅、餡、饅頭、蛋糕、豆沙水果涼粉、羊羹等)、冰果(冰激淋、冰棍、果子露冰激淋、刨冰等)、蒸煮食品(咖喱、牛肉飯、中華飯、雜飯、稀粥、醬湯、湯、肉沙司、半冰沙司、肉球、漢堡、雜燴類、紅小豆米飯、烤雞肉串、蒸雞蛋羹等)、速食食品(方便面、速食烏冬面、速食蕎麥面、速食炒面、速食意大利實心面、速食混沌面、速食年糕小豆湯、醬湯料、粉末湯料、果汁粉混料、混合熱糕點等)、瓶裝食品及罐裝食品、膠狀食品(果凍、瓊脂、陶罐裝食品、膠狀飲料等)、調料(食鹽、天然鹽、醬油、日本甜料酒、醋、砂糖、蜂蜜、大醬、調味品、增香調料、復合調料、沙司、蛋黃醬、番茄醬、添加粉末的食品、天麩羅料汁、面汁(麺つゆ)、即食肉湯料、中華清湯料、中華湯料(麻婆豆腐料、青椒肉絲料)、肉湯、烤肉佐料、冷火鍋佐料、咖喱糊、燉菜糊等)、蜂產品(蜂蜜、蜂王漿、蜂膠、花粉團子、蜂幼蟲等)、乳制品(牛奶、乳酪、酸奶、生奶油等)、經加工果實(果醬、橘皮果醬、糖水水果、干果等)、經加工蔬菜(蔬菜果醬等)、谷物類加工食品(面、意大利面條、面包、米粉等)、腌菜(咸菜、奈良泡菜、朝鮮泡菜、福神泡菜、腌蔥、腌白菜、芥末腌菜、腌結縷草、少鹽腌菜、腌漬品等)、腌菜料(即食腌菜材料、腌白菜材料等)、魚肉制品(魚糕、竹輪、魚肉山芋餅等)、畜肉制品(火腿、紅腸、臘腸、臘肉等)、美味(槍烏賊(さきするめ)、腌制鱈魚、腌海膽、腌墨斗魚、腌章魚、絲背細鱗鲀干、河豚干、熏墨斗魚、腌海參腸等)、干物(帶味海苔等)、日常食品類(拌菜、油炸食品、炒菜、燒菜、煮菜、醋拌食品等)、冷凍食品(炸蝦、炸肉餅、春卷、炸豬排、燒麥、餃子、漢堡、章魚丸子、圓薄餅(旋轉烙餅)、肉包子、有餡饅頭等)、油脂食品(色拉油、人造黃油、黃油)等。通過添加、混合本發明的蜂王漿蛋白分解物可以制備的食品也可以作為保健食品、功能性食品、營養輔助補品、輔助品、特定保健用食品、患者用食品·患者用組合食品(厚生勞動省、特別用途食品的一種)或高齡者用食品(厚生勞動省、特別用途食品的一種)，這種情況下，也可以做成未包衣片、薄膜包衣片、糖衣片、顆粒、粉末、藥片、膠囊(包括硬膠囊和軟膠囊中的任何一種)、咀嚼型、糖漿型、飲品型等。添加、混合有本發明的蜂王漿酶解產物的食品的制備可以使用公知的方法。
含有本發明蛋白分解物的特定保健用食品等食品對血壓的正常高值(收縮壓為130～139mmHg，舒張壓為85～89mmHg)以及輕度高血壓(收縮壓為140～159mmHg或者舒張壓為90～99mmHg)的兩類人具有預防高血壓的效果。
本發明的蛋白質分解物對輕度高血壓及正常高值血壓的受試者具有特別有效的降壓作用，但對正常或低血壓受試者的血壓幾乎沒有影響，只顯示輕微的作用，具有理想的預防高血壓的效果。
本發明的蛋白質分解物經口服由口腔粘膜或小腸直接吸收，或者，在胃腸道中水解而被吸收之后，顯示較強的持續抑制ACE的作用，為了預防高血壓癥、緩和高血壓傾向或調節血壓，可以繼續攝取，可以用作預防高血壓的功能性食品、特別是特定保健用食品等。為了該目的使用本發明的蛋白分解物或制劑時，一般來說體重60kg的成人一天口服10mg～10g、優選0.1～5g、更優選0.5～3g、特別優選0.5～1g的范圍。
另外也可以將本發明的蛋白質分解物與蜂王漿、蜂膠、蜂蜜、花粉、蜂幼蟲等并用，或混合使用。
本發明的蛋白質分解物幾乎或完全沒有過敏反應等副作用，作用持續時間長、一天攝取(給藥)一次可以顯示充分的降壓作用。而且，雖然具有速效性，但是沒有像血壓快速降低、或大量飲用時血壓大幅度降低，具有安全性高的降壓作用。另外對人具有優良的降壓作用。
具體實施方式
下面，使用實施例進一步詳細地說明本發明。
實施例1使用向蜂王漿中添加乙醇沉淀的乙醇變性蛋白質1g，添加豬胰蛋白酶250mg，在pH8.0下處理24小時。反應結束后，在100℃下加熱10分鐘，使酶失活。
將該反應液調至pH4.5，施加到合成吸附劑(セパビ一ズSP-70(由三菱化學制造))上，經水洗除去氯化鈉以及酸性或堿性的游離氨基酸、和糖類等，之后用乙醇洗脫，得到脫鹽的本發明的蛋白分解物。
脫鹽后的蛋白分解物，實質上不含有堿性游離氨基酸、酸性游離氨基酸、醇性游離氨基酸、游離Ala和游離Gly，根據數學式1計算Lys的殘存率為約45％，根據數學式2計算Leu的含有比例(摩爾基準)為約2.3倍。并且，糖分的含量為35重量％以下，明確了放入鋁袋中，即使在40℃，6個月的加速試驗中也沒有變色。
另外，取出經過24小時處理后的豬胰蛋白酶分解物25mg，加入流動相20mL，經超聲波處理溶解，精確作成25mL，對其10μl進行下述的凝膠過濾色譜(GFC)分析，檢查分子量分布。
<GFC分析>
柱TSKgel G2000SWXL7.8mmI.D.×30cm流動相0.1％TFA/乙腈流速1.0mL/分鐘柱溫25℃檢測UV(220nm)GFC分析結果如圖1所示。
實施例2蜂王漿(RJ)蛋白水解物的相關成分的結構分析取蜂王漿的乙醇變性蛋白100g，利用豬胰蛋白酶(由Novozyme制造的來自豬的胰蛋白酶)在pH8.0、37℃下酶解24小時。將反應液在沸水浴中加熱30分鐘，使酶失活后，用鹽酸調至pH4.5，離心分離(10000rpm，20分鐘)，將得到的上清液用薄膜過濾器(0.8μm)過濾，得到RJ蛋白水解物1160mL。
將得到的RJ蛋白水解液按照上述流程圖1使用ダイヤイオンHP20，用水、20％、40％、60％、80％的甲醇以及甲醇(100％)洗脫，得到級分1(Fr1)～級分7(Fr7)。
然后，由級分3～6鑒定的4種相關成分(肽)的分離和鑒定的詳細說明如下所示蜂王漿蛋白水解物的相關成分的分離、鑒定1.分離鑒定肽HP20 級分Fr4分離肽A1Thr-Ser-Asn-Thr-Phe分離肽A2Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr分離肽A3Thr-Asn-Asn-Leu-TyrHP20 級分Fr5分離肽A4Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg2.相關成分鑒定用檢測樣的制備(1)蜂王漿蛋白水解物的制備在蜂王漿乙醇變性蛋白100g中添加水1200mL，在37℃的水浴中邊攪拌邊添加20％的氫氧化鈉溶液，調至pH8.0，添加豬胰蛋白酶250mg，在37℃下酶解24小時之后，在沸水浴中加熱30分鐘。向其中加入稀釋的鹽酸調至pH4.5，進行離心分離(10000rpm，20分鐘)之后，將得到的上清液用薄膜過濾器過濾，得到蜂王漿蛋白水解液1160mL。
(2)經ダイヤイオンHP20粗分級將蜂王漿蛋白水解液855mL加至填充有ダイヤイオンHP20作為合成吸附劑的玻璃柱(11cmφ×20cm，容量約1.9L)中，按照水、20％、40％、60％、80％及100％的甲醇的順序洗脫，將水洗脫級分設定為級分(以下稱Fr)1、2，將20％、40％、60％、80％及100％甲醇洗脫級分分別設定為Fr3，4，5，6及7。用蒸發器將各分級液濃縮后凍干，將得到的級分Fr4和級分Fr5作為相關成分鑒定用的檢測樣。
3.蜂王漿蛋白水解物的相關肽的分離、鑒定(1)來自級分Fr4的相關肽的分離、鑒定分離肽A1Thr-Ser-Asn-Thr-Phe
對于利用HP20粗分級的級分Fr4約5g，通過利用大口徑制備用ODS柱的高效液相色譜法[柱TSK-gel ODS 120T(55mmφ×300mm)，流動相10％以及50％乙腈(含有0.05％TFA)，流量42mL/分鐘，柱溫室溫，檢測波長UV220nm。以下，稱為HPLC]進行再分級。
將得到的各分級液進行濃縮、凍干，得到P4(1)、P4(2)(0.536g)，P4(3)，P4(4)(不進行凍干，濃縮后供肽-A3的分離)。
再次使用大口徑的制備用ODS柱，用8％和50％的乙腈(含有0.05％TFA)作為流動相將P4(2)(0.536g)再次分離為7個級分，將各分級液進行濃縮、凍干，得到P4012-11～P40121-13、P4012-14(95.4mg)、P4012-15(44.5mg)、P4012-16以及P4012-17。
使用中口徑的半制備用ODS柱，對P4012-14(95.4mg)進行分部分離(分取)、純化。柱使用COSMOSIL 5C18 AR-II20mmφ×250mm，在流動相12.5％以及50％的甲醇(含有0.05％TFA)，流量8mL/分鐘，柱溫40℃，檢測波長UV220nm的條件下，再次分離為6個級分，將各分級液濃縮、凍干，得到P40409-1、P40409-2、P40409-3(26.7mg)以及P40409-4～P40409-6。
再次使用中口徑的半制備用ODS柱對得到的P40409-3(26.7mg)進行分部分離(分取)、純化。使用流動相A為0.05％TFA，流動相B為50％的甲醇(含有0.05％TFA)的濃度梯度法(0分鐘B 10％→360分鐘B 100％)，分部分離保留時間為69.7分鐘～76.3分鐘的峰部分，將得到的分級液進行濃縮、凍干，得到P40409-3-1(8.6mg)。
利用HPLC測定得到的P40409-3-1的純度，并且在通過加酸水解后的氨基酸分析實施組成氨基酸的測定后，用埃德曼降解N末端氨基酸序列分析法，確定P40409-3-1(A1)的結構為Thr-Ser-Asn-Thr-Phe。
分離肽A2Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr進一步使用中口徑的半制備用ODS柱，對先前通過大口徑制備用ODS柱二次實施再分級操作得到的P4012-15(44.5mg)，進行分部分離、純化。流動相使用12.5％甲醇(含有0.05％TFA)，分部分離保留時間為95.5分鐘～103.4分鐘的峰部分，將得到的分級液進行濃縮、凍干，得到P40410-4(6.1mg)。
利用HPLC測定所得到的P40410-4的純度，并在通過加酸水解后的氨基酸分析實施組成氨基酸的測定后，經埃德曼降解N末端氨基酸序列分析法確定了P40410-4(A2)的結構為Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr。
分離肽A3Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr再次使用大口徑制備用ODS柱，對經大口徑制備用ODS柱進行再分級得到的P4(4)在同一條件下分級為6個級分，將各分級液進行濃縮、凍干，得到P41206-3、P41206-4(177.8mg)以及P41206-5～P41206-8。
進一步使用中口徑的半制備用ODS柱，對P41206-4(177.8mg)的100mg，進行分部分離、純化。在流動相12.5％以及50％的甲醇(含有0.05％TFA)，流量7.6mL/分鐘，柱溫40℃，檢測波長UV220nm的條件下分部分離，將得到的分級液濃縮、凍干，得到P41219-2、P41219-3(11.12mg)和P41219-4。
再次利用中口徑的半制備用ODS柱，對得到的P41219-3(11.12mg)進行分部分離、純化。流動相使用17.5％甲醇(含有0.05％TFA)，分部分離保留時間為63.5分鐘～70.6分鐘的峰部分，將得到的分級液進行濃縮、凍干，得到P41219-3-2(5.25mg)。
利用HPLC測定所得到的P41219-3-2的純度，并在通過加酸水解后的氨基酸分析實施組成氨基酸的測定后，經埃德曼降解N末端氨基酸序列分析法確定了P41219-3-2(A3)的結構為Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr。
(2)來自Fr5級分的相關肽的分離、鑒定分離肽A4Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg對利用HP20粗分級的級分Fr5約5g，通過利用大口徑制備用ODS柱的高效液相色譜法[柱TSK-gel ODS 120T(55mmφ×300mm)，流動相15％、20％以及50％乙腈(含有0.05％TFA)，流量42mL/分鐘，柱溫室溫，檢測波長UV220nm]進行再分級。
將得到的各分級液進行濃縮、凍干，得到P5(1)～P5(5)、P5(6)(0.379g)以及P5(7)～P5(9)。
再次利用中口徑的半制備用ODS柱對得到的P5(6)(0.379g)，進行分部分離、純化。在使用流動相A為0.05％TFA，流動相B為50％的甲醇(含有0.05％TFA)的濃度梯度法(0分鐘B 45％→240分鐘B100％)，流量8mL/分鐘，柱溫40℃，檢測波長UV220nm的條件下，再次分級為13個級分，將得到的各分級液進行濃縮、凍干，得到P5(vi)-1、P5(vi)-2、P5(vi)-3(20.3mg)以及P5(vi)-4～P5(vi)-13。
使用口徑較小的ODS柱，對得到的P5(vi)-3(20.3mg)進行分部分離、純化。柱使用COSMOSIL 5C18 AR-II 10mmφ×250mm，在流動相25％的甲醇(含有0.05％TFA)，流量2mL/分鐘，柱溫40℃，檢測波長UV220nm的條件下，分部分離保留時間41.7分鐘～46.3分鐘的峰部分，對得到的分級液進行濃縮、凍干，得到P5(vi)-3-2(5.3mg)。
利用HPLC測定得到的P5(vi)-3-2的純度，并且在利用加酸水解后的氨基酸分析實施組成氨基酸的測定后，經埃德曼降解N末端氨基酸序列分析法，確定P5(vi)-3-2(A4)的結構為Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
實施例3蛋白分解物的臨床試驗和實施例1同樣的，得到RJ乙醇變性蛋白的豬胰蛋白酶分解物(含有本發明的4種新型肽)，將其根據上述流程圖，吸附于ダイヤイオンHP20后，經水洗除去級分1和2，然后用80％乙醇洗脫，制備成含有級分3～6的本發明的蛋白分解物，提供給以下實驗。
為了研究長期攝取含有所得到的蜂王漿蛋白質水解物(RJPH)的片劑的降壓作用和安全性，實施了對于血壓高的人群(正常高值血壓患者以及輕度高血壓患者都沒有治療)以安慰劑作為對照的雙盲試驗。為使受試者的性別、年齡、收縮壓、舒張壓、脈搏數、體重、BMI沒有差別，分為受試人群(男/女＝26/28、平均年齡49.7±11.2、收縮壓140.1±6.9mmHg、舒張壓81.7±7.1mmHg)和安慰劑人群(男/女＝24/29、平均年齡52.6±10.5、收縮壓140.5±6.6mmHg、舒張壓83.0±7.8mmHg)，對受試人群給與含有RJPH的片劑(250mg/片)，1日4片(RJPH/1000mg/天)，對安慰劑人群給與不含RJPH的片劑，1日4片，分別一日一次。連續給藥12周。
其結果如下表所示，在10、12周后，受試人群的收縮壓和舒張壓與安慰劑人群相比，顯示了顯著的降壓作用。并且，在結束12周服藥并觀察4周后，血壓與安慰劑人群同等程度的緩慢恢復，確認了沒有過度超過服藥前的值的反彈現象。
并且，在服藥期間也沒有確認一般被認為是試驗飲食起因的血液和尿液檢查值的變動，以及ACE抑制劑一般報告的空咳等有害的現象。
從以上內容，明確了含有RJPH的食品即使經過12周的長期給藥，安全性也較高，對正常高值血壓患者以及輕度高血壓患者都具有適度的降壓作用。
表2血壓的推移


平均值±標準偏差與安慰劑組比較#p＜0.05，##p＜0.01(t-檢驗)和攝取開始日比較*p＜0.05，##p＜0.01(Bonferroni檢驗)以下表示含有本發明蛋白分解物的處方例。
處方例1(粒)利用常法將下述原料混合，用打片機成型，制造了直徑8mm的未包衣片。利用常法將該未包衣片進行食品用薄膜包衣，制成了粒狀的保健食品。
(每1粒的組成)表3

處方2(飲料)將下述材料于水中充分攪拌之后，使總量為100mL。
(1瓶的組成)表4

處方3(膠囊劑)將下述材料均勻混合，通過60目篩之后，將該粉末全部量填充于2號明膠膠囊中。
(1個膠囊劑的組成)表5

處方4(顆粒)按照常法將下述材料制成顆粒狀，做成棒狀的鋁分包(アルミ分包)包裝。
(1包的組成)
表6

處方5(沙司)將下述材料充分混合，使用時充分攪拌，用于沙拉或油炸食品。
(1人量的組成)表7

權利要求
1.一種具有血管緊張素轉化酶抑制作用的蛋白分解物，其利用胰蛋白酶處理蜂王漿材料而得到，含有以下4種肽的至少一種Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
2.如權利要求1所述的蛋白分解物，其中蜂王漿材料是蜂王漿的醇變性蛋白質。
3.一種蛋白分解物，其來自蜂王漿材料，其中，用下式100×(相對于Gly(1摩爾)的蛋白分解物的Lys(mol))/(相對于Gly(1摩爾)的蜂王漿材料的Lys(mol))表示的以Gly為基準時Lys的酶解后的殘存率(摩爾比)為蜂王漿材料的70％以下。
4.一種蛋白分解物，其來自蜂王漿材料，其中，用下式(相對于Lys(1摩爾)的蛋白分解物的Leu(mol))/(相對于Lys(1摩爾)的蜂王漿材料的Leu(mol))表示的以Lys為基準時Leu的含有比例(摩爾比)為蜂王漿材料的1.3倍以上。
5.如權利要求3或4所述的蛋白分解物，其來自蜂王漿材料，實質上不含有(1)無機鹽類，和(2)選自酸性游離氨基酸、堿性游離氨基酸、具有醇羥基的游離氨基酸、游離Ala和游離Gly組成的組中的至少一種。
6.如權利要求5所述的蛋白分解物，其來自蜂王漿材料，實質上不含有(1)無機鹽類，和(2)游離酸性氨基酸及游離堿性氨基酸。
7.如權利要求6所述的蛋白分解物，其來自蜂王漿材料，實質上不含有(1)無機鹽類，和(2)酸性游離氨基酸(Asp，Glu)、堿性游離氨基酸(Lys，His，Arg)、具有醇羥基的游離氨基酸(Thr，Ser)、游離Ala和游離Gly。
8.如權利要求3～5任一項所述的蛋白分解物，其中，糖分的含量為35重量％以下，在40℃、6個月(鋁袋)的加速試驗條件下實質上不變色。
9.如權利要求3～6任一項所述的蛋白分解物，其中，經凝膠過濾柱分析實質上未發現分子量10000以上的成分，在分子量約200～約1500的范圍內具有最大的峰，具有分子量約200～約300的尖峰。
10.如權利要求3～6任一項所述的蛋白分解物，其中，平均分子量在約700～約6000的范圍內。
11.如權利要求1～10任一項所述的蛋白分解物，其中，使所述蛋白分解物通過具有下述特性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的柱(4.6mmφ×150mm)時，由下式表示的相關成分含量(％)為40％以上，·苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的特性粒度分布30μm細孔徑250官能團沒有適用pH范圍全區域，·相關成分含量(％)＝A1/AT×100T1色氨酸的保留時間T210-羥基-δ-2-癸烯酸的保留時間A1從在T1的洗脫位置檢測的峰之后到在T2的洗脫位置檢測的峰之前的峰面積的總和AT所有的峰面積的總和。
12.如權利要求11所述的蛋白分解物，其中，所述相關成分含量為58±5％。
13.如權利要求1～11任一項所述的蛋白分解物，其中，含有在使所述蛋白分解物通過具有以下特性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的柱，并且用水(級分1，2)、20％甲醇(級分3)、40％甲醇(級分4)、60％甲醇(級分5)、80％甲醇(級分6)、100％甲醇(級分7)洗脫時的級分中的級分3～6粒度分布＞250μm(含有90％以上粒徑大于250μm的粒子)細孔徑400官能團沒有適用pH范圍全區域。
14.如權利要求13所述的蛋白分解物，其中，在級分4中含有由Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；和Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；組成的組中的至少一種肽，在級分5中含有Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
15.一種高血壓的預防或治療劑，其以權利要求1～14任一項所述的蛋白分解物為有效成分。
16.一種食品，其含有權利要求1～14任一項所述的蛋白分解物。
17.如權利要求16所述的食品，其為高血壓預防用食品。
18.一種口服用制劑，其含有權利要求1～14任一項所述的蛋白分解物。
19.一種高血壓的預防或治療劑，其中，含有選自下述4種肽中的至少一種肽作為有效成分Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
20.如權利要求18所述的制劑，其為明確的食品和/或包含補充劑的食品形態。
21.一種血管緊張素轉化酶抑制劑，其以權利要求1～14任一項所述的蛋白分解物為有效成分。
22.如權利要求1～14任一項所述的蛋白分解物的制造方法，其特征在于，用豬胰蛋白酶處理蜂王漿材料。
23.如權利要求22所述的方法，其特征在于，使用合成吸附劑對通過豬胰蛋白酶處理得到的蛋白分解物進行處理，除去(1)無機鹽類、和(2)選自酸性游離氨基酸、堿性游離氨基酸、具有醇羥基的游離氨基酸、游離Ala和游離Gly組成的組中的至少一種。
24.如權利要求22所述的方法，其特征在于，將通過豬胰蛋白酶處理得到的蛋白分解物吸附在苯乙烯-二乙烯基苯共聚物上，水洗除去無機鹽和水溶性氨基酸，然后用含水醇洗脫。
25.如權利要求24所述的方法，其中，苯乙烯-二乙烯基苯共聚物具有下述特性粒度分布＞250μm(含有90％以上粒徑大于250μm的粒子)細孔徑400官能團沒有適用pH范圍全區域。
26.一種新型肽，含有以下4種肽中的任何一種Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
全文摘要
本發明涉及一種蛋白分解物，經胰蛋白酶處理蜂王漿材料而得到，具有血管緊張素轉化酶抑制作用，含有以下4種肽的至少一種Thr－Ser－Asn－Thr－Phe；Tyr－Ser－Pro－Val－Ala－Ser－Thr；Thr－Asn－Asn－Leu－Tyr；Val－Pro－Ile－Phe－Asp－Arg。本發明的蛋白分解物具有血管緊張素轉化酶抑制作用，對高血壓的預防或治療有效。
文檔編號A61K38/08GK101045747SQ200710085059
公開日2007年10月3日 申請日期2007年2月28日 優先權日2006年3月28日
發明者柳田正 申請人:株式會社山田養蜂場