專利名稱：中國毛蝦蛋白降壓肽及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及從中國毛蝦(Accedes chinensis)的酶解產物中分離純化具有新的氨基酸序列的降壓肽及其制備方法與應用，屬于海洋生物技術領域。
背景技術：
由食物蛋白經過部分酶解所得的短肽越來越引起食物學家的重視。這些短肽具有各種活性，比如提高免疫力，提高營養吸收率，抗高血壓活性。具有這些活性的蛋白已經從食物蛋白酶解物中純化出來，這些肽在蛋白質序列內是沒有活性的，只有通過酶解或食物加工從蛋白中釋放出來才具有活性。
血管緊張素轉化酶(ACE)是一種能夠催化血管緊張素1轉化成血管緊張素2的羧肽酶，能夠導致血壓升高，因此抑制ACE活性，可以導致血液中的血管緊張素2的濃度降低，從而導致血壓降低。雖然人工合成的ACE抑制劑具有明顯的降血壓效果，但是副作用太大，因此現在必須找到更安全、新穎、高效的治療高血壓的藥物?，F在從不同的蛋白中通過不同的酶進行酶解，在其酶解物中發現了許多ACE抑制短肽，這些蛋白資源包括牛奶蛋白、大豆蛋白、雞蛋蛋白、雞肉蛋白、海洋魚類蛋白、藻類等，到現在為止已有兩百多中具有ACE抑制活性的酶解活性肽被報道，但是現在報道的ACE抑制短肽主要來源于陸地蛋白的酶解物，來源于海洋蛋白酶解物的報道較少，因此，今后，海洋生物蛋白酶解物將成為今后篩選新的ACE抑制肽的重要來源。
毛蝦是我國渤海灣水域的一種低附加值的海洋蛋白資源，每年的捕撈量達到30萬噸，到目前為止，沒有有效的開發利用，只是曬干制作蝦皮或制作蝦醬，產品的附加值較低。由于毛蝦較高的蛋白含量和較低的脂肪含量，因此，毛蝦是用于酶解的很好的蛋白資源，而且就毛蝦的氨基酸組成來說，富含具有與降血壓肽結構有關的支鏈氨基酸和芳香族氨基酸，是酶解分離降高血壓肽的好原料。

發明內容本發明針對現有技術的不足，提供一種中國毛蝦蛋白降壓肽及其制備方法與應用。
本發明從中國毛蝦的蛋白酶解產物中分離純化出新的具有六個氨基酸的降壓肽，其序列分別為Phe-Cys-Val-Leu-Arg-Pro，Ile-Phe-Val-Pro-Ala-Phe或Lys-Pro-Pro-Glu-Thr-Val。具有較高的血管緊張素轉化酶(ACE)抑制活性。
考慮到上述三種六肽有可能在消化道內被進一步酶解，所以根據體內酶的作用位點，對上述三種六肽可能的酶解產物短肽進行了化學合成，經ACE抑制試驗，篩選得到Cys-Val-Leu-Arg-Pro，Val-Leu-Arg-Pro，Phe-Cys-Val-Leu，Cys-Val-Leu，Arg-Pro，Val-Leu，Phe-Cys，Ile-Phe-Val-Pro-Ala，Phe-Val-Pro-Ala-Phe，Val-Pro-Ala-Phe，Val-Pro-Ala和Ile-Phe等12種序列的短肽具有很好的ACE抑制活性。
縱上，本發明的中國毛蝦蛋白降壓肽是具有如下序列的短肽之一或組合
Phe-Cys-Val-Leu-Arg-Pro肽1，Ile-Phe-Val-Pro-Ala-Phe肽2，Lys-Pro-Pro-Glu-Thr-Val肽3，Cys-Val-Leu-Arg-Pro肽4，Val-Leu-Arg-Pro肽5，Phe-Cys-Val-Leu肽6，Cys-Val-Leu肽7，Arg-Pro肽8，Val-Leu肽9，Phe-Cys肽10，Ile-Phe-Val-Pro-Ala肽11，Phe-Val-Pro-Ala-Phe肽12，Val-Pro-Ala-Phe肽13，Val-Pro-Ala肽14或Ile-Phe肽15。
本發明中國毛蝦蛋白降壓肽的制備方法，包括從中國毛蝦的蛋白酶解產物中分離純化具有新的氨基酸序列的降壓肽(ACE抑制肽)和進一步利用酶解液分離純化ACE抑制肽。具體包括酶解毛蝦制備酶解液、從酶解液中分離純化降壓肽、序列測定和降壓肽的固相合成。
上述酶解毛蝦制備酶解液可用現有技術，本發明提供的方法是如下具體步驟中的(1)和(2)。
下面詳細說明本發明的各操作步驟，但不限于此(1)蛋白酶制劑的制備培養基餅粉2～3份、玉米粉2～3份、麩皮1～1.5份、Na2HPO40.4～0.5份、KH2PO40.03～0.04份、水100份，均為重量份，下同。滅菌，冷卻，接種枯草芽孢桿菌SM98011(Bacillus.Subtilis SM98011)的茄子瓶菌種的菌懸液5～10份，通風攪拌，培養15～18小時，作為液體種子待用。
液體深層發酵制備蛋白酶制劑培養基豆餅粉3～3.5份、玉米粉3.5～5.0份、麩皮2.0～2.5份、Na2HPO40.4～0.5份、KH2PO40.03～0.04份、水100份，均為重量份，下同。滅菌，接種上述步驟的液體種子，接種量為培養基重量的5～7％，通風攪拌，控溫，發酵37～40小時，得蛋白酶制劑。酶活為4000U/ml。
(2)酶解毛蝦制備酶解液基本原料中國毛蝦，按鮮重稱取毛蝦45～50份原料，打漿，然后加入液體重量45～50份的上述蛋白酶制劑，調pH值到6.8～7.3，溫度45～50℃，攪拌酶解5小時。酶解完畢，離心取上清。
(3)從酶解液中分離純化降壓肽(ACE抑制肽)用5000Da的超濾膜將酶解液超濾，將超濾小于5000Da的超濾液過PharmadexLH20柱(2.5×100cm，medium Pharmadex)，用蛋白核酸檢測儀，在214nm處進行檢測，根據從色譜柱分離得到的色譜峰分別收集，收集的洗脫液凍干稱重后，測定ACE抑制活性，將抑制活性高的組分多次收集，然后進一步用高壓液相色譜反相C18分離。PDA檢測器檢測波長為220nm，然后根據所得的肽的譜圖將肽峰分別收集濃縮，測定ACE抑制活性，得到具有高的ACE抑制活力的肽。
(4)序列測定將第三步分離得到的具有高的ACE抑制活力的純肽，用氨基酸自動測序儀測定氨基酸組成，再通過液質連用儀分析3條肽的分子量和肽段的分布，分析出3條肽的氨基酸序列。序列分別為Phe-Cys-Val-Leu-Arg-Pro，Ile-Phe-Val-Pro-Ala-Phe或Lys-Pro-Pro-Glu-Thr-Val。
(5)降壓肽的固相合成根據人體內蛋白酶(胰蛋白酶，糜蛋白酶和胃蛋白酶)的酶切位點和上述3個分離純化的肽，設計12條肽(原肽序列的一部分)Cys-Val-Leu-Arg-Pro，Val-Leu-Arg-Pro，Phe-Cys-Val-Leu，Cys-Val-Leu，Arg-Pro，Val-Leu，Phe-Cys，Ile-Phe-Val-Pro-Ala，Phe-Val-Pro-Ala-Phe，Val-Pro-Ala-Phe，Val-Pro-Ala和Ile-Phe。按現有技術固相合成，然后測定每一條肽的ACE抑制活性。結果證明固相合成的12條肽具有較高的ACE抑制活性。
上述步驟(1)的培養基中加豆油0.3～0.35重量份作消泡劑。
上述步驟(3)中測定肽的ACE抑制活性方法可用現有公知技術，如分光光度法或高壓液相色譜法，本發明提供如下ACE抑制活性測定方法—毛細管電泳法10μl底物Hip-His-Leu(1mM)，0.8mU的血管緊張素轉化酶(ACE)分別和若干10μl的0.03～40mg/ml中國毛蝦酶解液混合為若干組樣品。所述試劑都用100mM的硼酸緩沖液(包含0.3M NaCl，pH 8.3)配制。反應液在37℃反應30min，然后用0.1％三氟乙酸TFA(10μl)中止反應。血管緊張素轉化酶抑制反應產物直接在毛細管電泳儀上進行檢測。毛細管電泳儀為Beckman Coulter P/ACE MDQ(Fullerton，CA)裝置，配備有PDA(photodiode array)檢測器，數據采集、分析、系統控制用P/ACE MDQ軟件，該軟件來自Beckman Coulter(Fullerton，CA)。中止反應后的混合物樣品直接用毛細管電泳進行檢測，上樣壓力為1psi，時間為5秒，電泳電壓20kV，紫外吸收為228nm，電泳時間5分鐘，電泳緩沖液為20mM的硼酸緩沖液(pH9.18)。每測定一個樣品之后用緩沖液沖洗毛細管1分鐘。底物和產物馬尿酸分別在2.5分鐘和3.5分鐘出峰，根據上述軟件計算馬尿酸的峰面積。
ACE抑制活性的計算(IC50值的計算)馬尿酸配制成不同濃度0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，2，4，6mM，通過毛細管電泳測定其峰面積與馬尿酸濃度的線性關系。
峰面積＝K×Chip+NACE活力(umol/min)＝V×Chip÷tV反應體積，t反應時間，K根據峰面積和馬尿酸濃度求出的曲線常數，Chip馬尿酸濃度，N馬尿酸濃度曲線與Y軸的交點。
通過血管緊張素轉化酶作用，不含任何抑制肽，從底物Hip-His-Leu釋放出來的馬尿酸HA的量被定義為100％ACE活力。抑制50％的ACE活力的海洋蛋白酶解產物的量被定義為酶解產物的抑制活力。IC50值的計算采用線性對數法，以Log(ACE活力/(1-ACE活力))對Log(水解產物濃度mg/ml)作圖，所得直線與X軸的交點對應的值為M，10M為酶解產物抑制ACE活力的IC50值。
上述步驟(3)所用高壓液相色譜柱為反相C18柱。
上述步驟(4)氨基酸分析是將肽用6N的HCl在115℃全水解22小時，通過氨基酸自動測序儀進行測定。
本發明的中國毛蝦蛋白降壓肽產品為白色粉末，易溶于水，可以是肽1-肽15中的一種或其組合。
本發明的中國毛蝦蛋白降壓肽用于制備降壓藥物。
本發明的優良效果在于將陸地微生物酶工程技術應用于毛蝦的深層次開發利用。具體體現在1、用海洋毛蝦作為酶解原料2、從酶解液通過色譜方法分離純化具有降血壓功能的肽3、用ACE反應來檢測各步產物的降壓活性4、并對得到的具有新序列的肽的部分，進行序列合成，得到的小肽具有更高的ACE抑制活力。


圖1是實施例1步驟(3)經過3000Da的膜超濾的毛蝦酶解液經過PharmadexLH20柱分離的色譜圖。
圖2、圖3和圖4分別是II、III、IV號樣品在高壓液相的反相C18柱上分離得到的色譜峰。
圖5、圖6和圖7分別是II、III、IV號樣品的IC50值的線性對數圖，證明II、III、IV號樣品是具有高的ACE抑制活力的純肽，它們分別是分離純化的3條肽(肽1、肽2和肽3)。
具體實施方式
實施例1.
(1)蛋白酶制劑的制備種子培養基以重量份牛肉膏0.3份、蛋白胨1份、瓊脂2份、NaCl 0.5份為培養基，水98份，pH為7.1，滅菌，劃線接枯草芽孢桿菌SM98011(Bacillus.SubtilisSM98011)菌種，30℃培養，培養20小時。
發酵培養基豆餅粉3份、玉米粉2份、麩皮1份、Na2HPO4 0.4份、KH2PO40.04份、水100份，加豆油0.3份作消泡劑。120℃滅菌30分鐘，冷卻后，接上種子的菌懸液10份，150升發酵罐中，裝樣量70升，于30℃下，通風量(V風/V液·時間)10.6，攪拌330轉/分鐘，培養36小時。此時pH7.0。
(2)酶解短肽的制備首先稱取50份(鮮重)的中國毛蝦，打漿。然后加入50份(液體重量)的蛋白酶制劑，調pH值到7.2，50℃，攪拌酶解5小時，酶解完畢，5000rpm離心，上清為酶解短肽液。
(3)降壓肽的分離純化將上清液用5000Da的膜超濾，然后將超濾液上Pharmadex LH20柱，分離得到9個峰，分別收集，測定ACE抑制活力，得到第II，III，IV號峰具有較高的ACE抑制活力(見圖1)，反復收集，上高壓液相色譜，將II，III，IV號樣品進一步分離，得到19個色譜峰(見圖2)，其中有3個峰具有較高的ACE抑制活力，這3個峰對應的肽為肽1，肽2和肽3。
(4)降壓肽的序列測定將步驟(3)得到的具有較高ACE抑制活力3個純肽用6N的HCl全水解，用氨基酸自動測序儀測定氨基酸組成，然后用液質連用儀分析3條肽的分子量和肽段的分布，分析出3條肽的氨基酸序列。Phe-Cys-Val-Leu-Arg-Pro，Ile-Phe-Val-Pro-Ala-Phe，Lys-Pro-Pro-Glu-Thr-Val。毛細管電泳法測定IC50值分別為12.3μM，19.8μM和24.1μM。如圖5，圖6和圖7所示。根據現有技術具有酶解ACE抑制肽的IC50值為0.2μM-600μM，IC50值越小，說明對ACE的抑制作用越強，降血壓效果越好。由此證明，從中國毛蝦酶解物中分離純化的肽1，肽2和肽3具有較高的ACE抑制活性。
(5)肽的固相合成根據體內蛋白酶(胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶)的酶切位點，設計了12條肽，分別是分離純化的3個原肽序列的一部分Cys-Val-Leu-Arg-Pro(肽4)，Val-Leu-Arg-Pro(肽5)，Phe-Cys-Val-Leu(肽6)，Cys-Val-Leu(肽7)，Arg-Pro(肽8)，Val-Leu(肽9)，Phe-Cys(肽10)，Ile-Phe-Val-Pro-Ala(肽11)，Phe-Val-Pro-Ala-Phe(肽12)，Val-Pro-Ala-Phe(肽13)，Val-Pro-Ala(肽14)和Ile-Phe(肽15)。按現有技術固相合成，對合成的肽用毛細管電泳法測定了它們的ACE抑制活性，IC50值依次為141.3，22.3，19.8，17.6，28.1，34.5，478.6，23.9，24.5，575.4，34.4，26.7μM。說明合成的肽對ACE的抑制作用強。
本實施例所得的短肽產品干燥處理后為白色粉末，易溶于水。
實施例2如實施例1所述，所不同的是原料毛蝦的用量不一樣，45份(鮮重)的毛蝦，打漿。然后加入50份(液體重量)的蛋白酶制劑。
本發明的短肽具有較高的ACE抑制活性，即使進入消化道經酶解后，其酶解產物仍有較高的降壓活性。本發明的特點在于集酶工程技術和肽純化鑒定技術于一體，對毛蝦這一量大而至今未被有效利用的海洋蛋白資源進行了深入的開發利用，發現了有新的氨基酸序列組成的ACE抑制肽并保證了在體內的功能性，為以后降壓藥物的開發奠定了基礎。
序列表<110>山東大學<120>中國毛蝦蛋白降壓肽及其制備方法與應用<160>11<170>Patent In3.1<210>1<211>6<212>PRT<213>中國毛蝦(Accedes chinensis)<400>1Phe Cys Val Leu Arg Pro<210>2<211>6<212>PRT<400>2Ile Phe Val Pro Ala Phe<210>3<211>6<212>PRT<400>3Lys Pro Pro Glu Thr Val<210>4<211>5<212>PRT<400>4Cys Val Leu Arg Pro<210>5<211>4<212>PRT<400>5Val Leu Arg Pro
<210>6<211>4<212>PRT<400>6Phe Cys Val Leu<210>7<211>3<212>PRT<400>7Cys Val Leu<210>8<211>2<212>PRT<400>8Arg Pro<210>9<211>2<212>PRT<400>9Val Leu<210>10<211>2<212>PRT<400>10Phe Cys<210>11<211>5<212>PRT<400>11Ile Phe Val Pro Ala
<210>12<211>5<212>PRT<400>12Phe Val Pro Ala Phe<210>13<211>4<212>PRT<400>13Val Pro Ala Phe<210>14<211>3<212>PRT<400>14Val Pro Ala<210>15<211>2<212>PRT<400>15Ile Phe
權利要求
1.中國毛蝦蛋白降壓肽，其特征在于，是具有如下序列的肽2Ile-Phe-Val-Pro-Ala-Phe肽2，或在肽2中氨基酸序列經缺失一個或幾個氨基酸衍生的肽11-肽15，序列如下Ile-Phe-Val-Pro-Ala肽11，Phe-Val-Pro-Ala-Phe肽12，Val-Pro-Ala-Phe肽13，Val-Pro-Ala肽14，Ile-Phe肽15。
2.權利要求1所述的中國毛蝦蛋白降壓肽的制備方法，包括酶解毛蝦制備酶解液、從酶解液中分離純化降壓肽、氨基酸序列測定和肽的固相合成，其特征在于從中國毛蝦的蛋白酶解產物中分離純化出新的具有六個氨基酸的降壓肽，其序列為Ile-Phe-Val-Pro-Ala-Phe；根據體內酶的作用位點，對上述六肽可能的酶解產物短肽進行了化學固相合成，經血管緊張素轉化酶抑制試驗，篩選得到Ile-Phe-Val-Pro-Ala，Phe-Val-Pro-Ala-Phe，Val-Pro-Ala-Phe，Val-Pro-Ala和Ile-Phe共4種序列的短肽具有很好的血管緊張素轉化酶抑制活性。
3.如權利要求2所述的中國毛蝦蛋白降壓肽的制備方法，其特征在于所述酶解毛蝦制備酶解液，具體步驟如下(1)蛋白酶制劑的制備培養基餅粉2～3份、玉米粉2～3份、麩皮1～1.5份、Na2HPO40.4～0.5份、KH2PO40.03～0.04份和水100份，滅菌，冷卻，接種枯草芽孢桿菌SM98011的茄子瓶菌種的菌懸液5～10份，通風攪拌，培養15～18小時，作為液體種子待用，均為重量份；然后液體深層發酵制備蛋白酶制劑，具體如下培養基豆餅粉3～3.5份、玉米粉3.5～5.0份、麩皮2.0～2.5份、Na2HPO40.4～0.5份、KH2PO40.03～0.04份和水100份，均為重量份，滅菌，接種上述的液體種子，接種量為培養基重量的5～7％，通風攪拌，控溫，發酵37～40小時，得蛋白酶制劑；(2)酶解毛蝦制備酶解液基本原料中國毛蝦，按鮮重稱取毛蝦45～50份原料，打漿，然后加入液體重量45～50份的上述蛋白酶制劑，調pH值到6.8～7.3，溫度45～50℃，攪拌酶解5小時，酶解完畢，離心取上清。
4.如權利要求2所述的中國毛蝦蛋白降壓肽的制備方法，其特征在于所述從酶解液中分離純化降壓肽具體如下用5000Da的超濾膜將酶解液超濾，將超濾小于5000Da的超濾液過Pharmadex LH20柱，2.5×100cm，用蛋白核酸檢測儀，在214nm處進行檢測，根據從色譜柱分離得到的色譜峰分別收集，收集的洗脫液凍干稱重后，測定血管緊張素轉化酶抑制活性，將抑制活性高的組分多次收集，然后進一步用高壓液相色譜柱分離，PDA檢測器檢測波長為220nm，然后根據所得的肽的譜圖將肽峰分別收集濃縮，測定血管緊張素轉化酶抑制活性。
5.如權利要求4所述的中國毛蝦蛋白降壓肽的制備方法，其特征在于所述上高壓液相色譜柱為反相C18柱。
6.如權利要求2所述的中國毛蝦蛋白降壓肽的制備方法，其特征在于所述氨基酸序列測定是將肽用6N的HCl在115℃全水解22小時，通過氨基酸自動測序儀進行測定。
7.權利要求1所述的中國毛蝦蛋白降壓肽用于制備降壓藥物。
全文摘要
中國毛蝦蛋白降壓肽及其制備方法與應用，屬于海洋生物技術領域。本發明從中國毛蝦的蛋白酶解產物中分離純化出新的具有六個氨基酸的降壓肽，具有較高的血管緊張素轉化酶(ACE)抑制活性。此外，根據體內酶的作用位點，對上述三種六肽可能的酶解產物短肽進行了化學合成，經ACE抑制試驗，篩選得到12種序列的短肽具有很好的ACE抑制活性。本發明降壓肽用于制備降壓藥物。本發明將微生物酶工程技術應用于毛蝦的深層次開發利用，得到的具有新序列短肽，具有高的ACE抑制活力。
文檔編號C07K5/08GK1908008SQ20061010829
公開日2007年2月7日 申請日期2004年12月29日 優先權日2004年12月29日
發明者張玉忠, 何海倫, 陳秀蘭, 吳昊, 周百成 申請人:山東大學