本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從植物膽木莖中分離得到的新生物堿苷類(lèi)化合物Naucleamide G在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

抗炎藥物一般是通過(guò)調(diào)節(jié)對(duì)炎癥具有重要作用的促炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-6等)的水平，從而發(fā)揮其抗炎作用。關(guān)于抗炎機(jī)制方面的研究，文獻(xiàn)對(duì)很多信號(hào)通路在炎癥方面的作用進(jìn)行了描述(Guha M，Mackman N.LPS induction of gene expression in human monocytes.Cell Signal.2001，13：85-94)，其中，核因子-κB(NF-κB)與絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)是與炎癥相關(guān)的兩條重要通路。研究表明，NF-κB主要是通過(guò)IκB激酶(IKK)介導(dǎo)的IκB-α的磷酸化與降解而激活的；在MAPK信號(hào)通路中，ERK、JNK和p38是與炎癥關(guān)系密切的三個(gè)亞族，也被認(rèn)為是抗炎藥物作用的重要靶點(diǎn)。

膽木(Nauclea officinalis)為茜草科烏檀屬植物，分布于我國(guó)的海南、廣西和廣東一帶，其莖、皮均可入藥，性味苦寒，具有清熱解毒，消腫止痛之功效。我國(guó)南方民間常用于感冒發(fā)熱、肺炎、腸炎、痢疾等病的治療(《中華本草》，1999，6：456)。同時(shí)，膽木也是一味黎族醫(yī)學(xué)中常用的植物藥，收載于《黎族醫(yī)藥》。目前，國(guó)內(nèi)有“膽木注射液”和“膽木浸膏片”兩種中藥制劑，臨床用于急性扁桃炎、急性咽炎、急性結(jié)膜炎和上呼吸道感染。文獻(xiàn)報(bào)道膽木中主要含有生物堿、五環(huán)三萜等多種化學(xué)成分，以生物堿類(lèi)成分居多(宣偉東.中藥膽木和云南狗牙花活性成分研究，復(fù)旦大學(xué)，2005；胡欣.烏檀化學(xué)成分分離分析與相關(guān)成分活性、藥動(dòng)學(xué)研究.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，2007；孫靜勇.膽木和山香圓化學(xué)成分及其生物活性成分研究.山東大學(xué)，2008)。膽木制劑的主要工藝過(guò)程是水煎醇沉，其制劑中活性物質(zhì)尚不明確。

發(fā)明人前期研究了膽木提取物的抗炎活性，結(jié)果表明，膽木提取物具有較好的抗炎活性(Zhai X T，Zhang Z Y，Jiang C H，et al.Journal of Ethnopharmacology 2016，183：159-165)。本專(zhuān)利是前期研究的繼續(xù)。

發(fā)明人前期利用柱色譜技術(shù)結(jié)合Waters自動(dòng)純化系統(tǒng)從膽木中分離出了一個(gè)全新的化合物，命名為Naucleamide G(朱粉霞，王靜靜，宋捷，等.膽木的化學(xué)成分研究.藥學(xué)學(xué)報(bào).2013，48(2)： 276-280)，其分子式為C₂₅H₃₂N₂O₈，分子量為488.53，結(jié)構(gòu)式如下圖所示：

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供Naucleamide G在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一方面，發(fā)明人研究了Naucleamide G對(duì)LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞中炎癥因子IL-1β和TNF-α的生成以及IL-1β和TNF-αmRNA表達(dá)的影響，從而研究了Naucleamide G的抗炎活性。

本發(fā)明的第二方面，發(fā)明人研究了Naucleamide G在LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞中發(fā)揮抗炎作用的分子機(jī)制。Naucleamide G經(jīng)LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該化合物可以抑制NF-κB信號(hào)通路中IKKα、IκB-α和p65的磷酸化；此外，Naucleamide G也能夠抑制MAPK信號(hào)通路中ERK、JNK和p38的磷酸化。

研究結(jié)果表明，本發(fā)明中的化合物Naucleamide G能夠顯著地抑制IL-1β和TNF-α生成及其mRNA的表達(dá)，對(duì)炎癥有明顯的抑制作用，因此可以用于制備抗炎藥物。此外，抗炎機(jī)制研究表明，Naucleamide G能夠抑制LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞中的NF-κB和MAPK信號(hào)通路，從而解釋了Naucleamide G發(fā)揮抗炎作用的分子機(jī)制。

附圖說(shuō)明

圖1是Naucleamide G對(duì)LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞活力的影響；

圖2是Naucleamide G對(duì)LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞中炎癥因子生成的影響，其中A是Naucleamide G對(duì)IL-1β水平的影響，B是Naucleamide G對(duì)TNF-α水平的影響；

圖3是Naucleamide G對(duì)IL-1β和TNF-αmRNA表達(dá)的影響，其中A是Naucleamide G對(duì)IL-1βmRNA生成的影響，B是Naucleamide G對(duì)TNF-αmRNA生成的影響；

圖4是Naucleamide G對(duì)LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的抑制作用， 其中A是Naucleamide G對(duì)IκB磷酸化的影響，B是Naucleamide G對(duì)p65磷酸化的影響，C是Naucleamide G對(duì)IKKα磷酸化的影響；

圖5是Naucleamide G對(duì)LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路的抑制作用，其中A是Naucleamide G對(duì)ERK磷酸化的影響，B是Naucleamide G對(duì)JNK磷酸化的影響，C是Naucleamide G對(duì)p38磷酸化的影響。

具體實(shí)施方法

下面通過(guò)實(shí)施例和附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。本發(fā)明所用試劑和原料均可購(gòu)得或按文獻(xiàn)方法制備。

實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例：本發(fā)明化合物Naucleamide G對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中炎癥具有良好的抑制作用。

(一)細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。在37℃，5％CO₂條件下，用含10％HyClone胎牛血清、100U/mL青霉素及100mg/mL鏈霉素的DMEM不完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，0.5％胰酶消化傳代。所有操作均為無(wú)菌操作。

(二)細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)

RAW 264.7細(xì)胞接種于96孔板中(4×10⁶個(gè)/mL)，每組六個(gè)復(fù)孔，每孔含200μL不完全高糖DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞貼壁后，用PBS洗滌細(xì)胞一遍，對(duì)照組加入不完全高糖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組加入含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，給藥組加入25、50、100和200μM的Naucleamide G溶液和含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，于37℃，5％CO₂孵育箱中培養(yǎng)24h后，加20μL 5mg/mL MTT培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞用PBS洗滌一遍，加150μL DMSO，微波震蕩15min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm和490nm處的OD值。細(xì)胞活力＝[(OD₅₇₀-OD₄₉₀)_sample/(OD₅₇₀-OD₄₉₀)_control]×100％。

結(jié)果如圖1所示，25～200μM濃度的Naucleamide G對(duì)細(xì)胞活性的影響與對(duì)照組和誘導(dǎo)組相比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)，表明Naucleamide G沒(méi)有顯著的細(xì)胞毒性。

(三)Naucleamide G對(duì)LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞中IL-1β生成的影響

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)異Naucleamide G加藥組對(duì)LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β的影響。RAW 264.7細(xì)胞接種于96孔板中(4×10⁶個(gè)/mL)，每組六個(gè)復(fù)孔，每孔含200μL不完全高糖DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞貼壁后，用PBS洗滌細(xì)胞一遍，對(duì)照組加入不完全高糖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組加入含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，給藥組加入25、50、100和200μM的Naucleamide G溶液和含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，于37℃，5％CO₂孵育箱中培養(yǎng)24h后，吸50μL上清液，根據(jù)ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)IL-1β含量。

結(jié)果如圖2A所示，LPS誘導(dǎo)組的IL-1β水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)；給藥組的IL-1β水平與誘導(dǎo)組相比，有顯著差異(P＜0.05)；當(dāng)Naucleamide G濃度達(dá)到50μM水平以上時(shí)，其對(duì)IL-1β抑制作用成劑量依賴(lài)性，與誘導(dǎo)組相比，50、100和200μM水平的Naucleamide G對(duì)IL-1β生成的抑制率分別為29.82％，37.77％和63.39％。

(四)Naucleamide G對(duì)LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞中TNF-α產(chǎn)生的影響

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)異Naucleamide G加藥組對(duì)LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的影響。RAW 264.7細(xì)胞接種于96孔板中(4×10⁶個(gè)/mL)，每組六個(gè)復(fù)孔，每孔含200μL不完全高糖DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞貼壁后，用PBS洗滌細(xì)胞一遍，對(duì)照組加入不完全高糖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組加入含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，給藥組加入25、50、100和200μM的Naucleamide G溶液和含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，于37℃，5％CO₂孵育箱中培養(yǎng)24h后，吸50μL上清液，根據(jù)ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)TNF-α含量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2B所示，LPS誘導(dǎo)組的TNF-α水平顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.01)；給藥組的TNF-α水平與誘導(dǎo)組相比，有顯著差異(P＜0.05)，上述結(jié)果表明Naucleamide G能顯著抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α。

(五)Naucleamide G對(duì)IL-1βmRNA表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)使用Trizol試劑提取對(duì)照組、誘導(dǎo)組和Naucleamide G給藥組的RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1βmRNA，利用RT-PCR確定mRNA的相對(duì)含量。RAW 264.7細(xì)胞接種于96孔板中(4×10⁶個(gè)/mL)，每組六個(gè)復(fù)孔，每孔含200μL不完全高糖DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞貼 壁后，用PBS洗滌細(xì)胞一遍，對(duì)照組加入不完全高糖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組加入含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，給藥組加入25、50、100和200μM的Naucleamide G溶液和含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，于37℃，5％CO₂孵育箱中培養(yǎng)24h后，根據(jù)Trizol試劑供應(yīng)商(美國(guó)Invitrogen公司)提供的方法提取RNA，并測(cè)定在260nm和280nm的吸收值，確定RNA的濃度和純度；隨后，利用RT-PCR擴(kuò)增RNA，以GAPDH為內(nèi)參，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算IL-1βmRNA的相對(duì)表達(dá)量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3A所示，結(jié)果表明，25～200μM水平的Naucleamide G能夠顯著抑制IL-1βmRNA的表達(dá)，并且抑制作用呈劑量依賴(lài)性，當(dāng)Naucleamide G濃度達(dá)到200μM水平時(shí)，與LPS誘導(dǎo)組相比，IL-1βmRNA的表達(dá)被抑制了77.53％。

(六)Naucleamide G對(duì)TNF-αmRNA表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)使用Trizol試劑提取對(duì)照組、誘導(dǎo)組和Naucleamide G給藥組的RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1βmRNA，利用RT-PCR確定mRNA的相對(duì)含量。RAW 264.7細(xì)胞接種于96孔板中(4×10⁶個(gè)/mL)，每組六個(gè)復(fù)孔，每孔含200μL不完全高糖DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞貼壁后，用PBS洗滌細(xì)胞一遍，對(duì)照組加入不完全高糖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組加入含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，給藥組加入25、50、100和200μM的Naucleamide G溶液和含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，于37℃，5％CO₂孵育箱中培養(yǎng)24h后，根據(jù)Trizol試劑供應(yīng)商(美國(guó)Invitrogen公司)提供的方法提取RNA，并測(cè)定在260nm和280nm的吸收值，確定RNA的濃度和純度；隨后，利用RT-PCR擴(kuò)增RNA，以GAPDH為內(nèi)參，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算TNF-αmRNA的相對(duì)表達(dá)量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3B所示，結(jié)果表明，25～200μM水平的Naucleamide G能夠顯著抑制TNF-αmRNA的表達(dá)，并且抑制作用呈劑量依賴(lài)性，當(dāng)Naucleamide G濃度達(dá)到200μM水平時(shí)，與LPS誘導(dǎo)組相比，TNF-αmRNA的表達(dá)被抑制了76.31％。

(七)Naucleamide G對(duì)NF-κB通路的抑制作用

RAW 264.7細(xì)胞接種于96孔板中(4×10⁶個(gè)/mL)，每組六個(gè)復(fù)孔，每孔含200μL不完全高糖DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞貼壁后，用PBS洗滌細(xì)胞一遍，對(duì)照組加入不完全高糖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組加入含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，給藥組加入25、50、100和200μM的Naucleamide G溶液和含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，于37℃，5％CO₂孵育箱中培 養(yǎng)24h后，胰酶消化，于冷PBS中洗滌2遍，各加入200ul冰預(yù)冷裂解緩沖液，混勻后冰浴30min，每隔5min渦旋震蕩10s，充分裂解，4℃離心10min，上清液分裝，存于-70℃保存，待檢測(cè)。利用Western blot法，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算IκBα、p-IκBα、IKKα、p-IKKα、p65、p-p65的相對(duì)表達(dá)量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明，Naucleamide G能夠顯著地降低LPS-刺激的RAW 264.7細(xì)胞中p-IκBα、p-IKKα和p-p65的表達(dá)，并且抑制作用呈劑量依賴(lài)性。Naucleamide G水平在25、50、100、200μM時(shí)，磷酸化蛋白與總蛋白的比例分別如下，p-IκBα/IκBα為：0.95±0.02、0.72±0.03、0.68±0.03、0.49±0.03；p-IKKα/IKKα為：0.85±0.04、0.69±0.03、0.47±0.02、0.35±0.02；p-p65/p65為：0.96±0.02，0.90±0.02，0.82±0.04，0.50±0.02。

(八)Naucleamide G對(duì)MAPK通路的抑制作用

RAW 264.7細(xì)胞接種于96孔板中(4×10⁶個(gè)/mL)，每組六個(gè)復(fù)孔，每孔含200μL不完全高糖DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞貼壁后，用PBS洗滌細(xì)胞一遍，對(duì)照組加入不完全高糖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組加入含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，給藥組加入25、50、100和200μM的Naucleamide G溶液和含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，于37℃，5％CO₂孵育箱中培養(yǎng)24h后，胰酶消化，于冷PBS中洗滌2遍，各加入200ul冰預(yù)冷裂解緩沖液，混勻后冰浴30min，每隔5min渦旋震蕩10s，充分裂解，4℃離心10min，上清液分裝，存于-70℃保存，待檢測(cè)。利用Western blot法，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38的相對(duì)表達(dá)量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，25～200μM水平的Naucleamide G劑量依賴(lài)性的抑制ERK的磷酸化(圖5A)；Naucleamide G在25μM水平時(shí)，對(duì)JNK和p38的磷酸化沒(méi)有抑制作用，但是，當(dāng)濃度達(dá)到50μM水平時(shí)，Naucleamide G顯著地抑制p-JNK和p-p38的表達(dá)水平，且抑制作用呈劑量依賴(lài)性(圖5B，C)。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Naucleamide G可顯著抑制LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞中IL-1β和TNF-α的生成，同時(shí)也抑制了IL-1β和TNF-αmRNA的表達(dá)，這些結(jié)果說(shuō)明Naucleamide G具有良好的抗炎活性，且無(wú)細(xì)胞毒性，因此可用于制備抗炎藥物。抗炎機(jī)制方面的研究結(jié)果顯示，Naucleamide G能夠抑制RAW 264.7細(xì)胞中LPS刺激的NF-κB和MAPK通路的激活，從而部分解釋了Naucleamide G抗炎作用的分子機(jī)制。

以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)例進(jìn)行了具體說(shuō)明，但本發(fā)明創(chuàng)造不限于所述實(shí)施例， 熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出其他的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍。