本發明涉及胃病藥物
技術領域：
，具體是一種低鐵飽和度牛乳鐵蛋白在制備治療幽門螺旋桿菌感染性胃病藥物中的應用。
背景技術：
：目前對幽門螺桿菌的治療多選用抗生素。但是長期使用抗生素容易引起細菌對其產生耐藥性。因此研制一種高效殺滅耐藥性幽門螺桿菌制劑，成為當務之急。乳鐵蛋白具有抗微生物活性是由于它具有結合對于某些細菌生長必需的鐵的能力。一些研究者(Bishop等，1977；Payne等，1990)的研究證實乳鐵蛋白的抗微生物活性依賴于它的鐵飽和度。Batish等人(1988)還發現低鐵飽和度乳鐵蛋白的抗菌活性比高鐵飽和度乳鐵蛋白的抗菌活性高。中國專利CN200510095244.3公開了一種從牛奶或者乳清水中提取與制備高純度乳鐵蛋白的方法，其中制備的乳鐵蛋白純度雖然較高，但是由于奶源的產地不同，比如奶牛的品種、飼養地以及所用飼料均存在一定的區別，因此導致牛奶中乳鐵蛋白的鐵飽和度具有較大的隨機性，難以滿足其標準化、規模化應用的需要。為拓寬乳鐵蛋白應用，為了保證功效的一致性，需要乳鐵蛋白保持穩定一致的飽和度；目前將鐵飽和度保持一致的高飽和度可以通過加入鐵離子的方式；但是在抗菌類藥物的生產過程中為了保證功效的穩定性，需要乳鐵蛋白保持穩定一致的低鐵飽和度，從而實現藥物的標準化、規模化生產；但是目前還未見將乳鐵蛋白實現一致低鐵飽和度的生產工藝，導致藥物抗菌活性未能達到最佳效果；因此，如何實現乳鐵蛋白低鐵飽和度，滿足其做為藥品原料標準化的要求，也成為亟待解決的問題。技術實現要素：針對現有技術的不足，本發明提供一種低鐵飽和度牛乳鐵蛋白在制備治療幽門螺旋桿菌感染性胃病藥物中的應用，其首要目的將低飽和度牛乳鐵蛋白用于胃病藥物中能夠有效抑制幽門螺旋桿菌；同時本發明還提供一種低鐵飽和度牛乳鐵蛋白生產工藝，保證所獲得的低鐵飽和度的乳鐵蛋白鐵飽和度的一致性，從而實現藥物的標準化、規模化生產。低鐵飽和度牛乳鐵蛋白在制備治療幽門螺旋桿菌感染性胃病藥物中的應用，所述低鐵飽和度牛乳鐵蛋白為鐵飽和度＜15％的牛乳鐵蛋白。優選鐵飽和度6％～8％的牛乳鐵蛋白。所述胃病包括急慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜脫落以及胃酸度過高。所述低鐵飽和度乳鐵蛋白的制備步驟為：第1步，使用陽離子交換樹脂對牛乳中的乳鐵蛋白進行吸附、解析；所述解析過程是采用二級解析，第一級解析是采用1～2.5％的鹽溶液解析，解析液是乳過氧化物酶蛋白，棄去；第二級解析是采用3.5～7％的鹽溶液解析，解析液送入第2步處理；所述的鹽溶液是指鈉鹽、鉀鹽或者鈣鹽溶液；第2步，對第1步得到的解析液采用分離膜進行濃縮；所述的分離膜是截留分子量在1000～30K的超濾膜；第3步，第2步得到的濃縮液采用不溶性Fe3+螯合樹脂進行吸附，再采用分離膜對濃縮液進行濃縮；所述吸附操作時需要在濃縮液中加入醋酸、醋酸鹽以及枸櫞酸鹽，配制其吸附環境中枸櫞酸鹽濃度為0.1mol/L～0.5mol/L,并調節pH至5.0～6.7；所述的分離膜是截留分子量在1000～30K的超濾膜。進一步的，所述的第2步得到的濃縮液在送入第3步之前，可再經過一次弱酸型陽離子樹脂的吸附、解附和超濾膜的濃縮處理；所述的弱酸型陽離子樹脂是指CM樹脂。進一步的，所述第2步得到濃縮液在進入第3步之前可以加入氯化鈉，使氯化鈉的濃度達到5～10g/L，再用截留分子量范圍是200000～400000的超濾膜對濃縮液進行過濾。進一步的，所述的第3步中，所述的不溶性Fe3+螯合樹脂是指D403螯合樹脂；樹脂的吸附時間20～120分鐘，吸附時攪拌槳轉速速率為20～150rpm，吸附溫度在3～30℃。進一步的，所述的第3步中不溶性Fe3+螯合樹脂可以選擇由以下方法制備的螯合樹脂，包括如下步驟：S1，按重量份計，將4～6份的苯酚、60～80份質量濃度在20～30wt％的甲醛水溶液混合，在40～45℃溫度范圍內進行反應1～5h，再加入5～8份2,2-二羥基丙酸和35～40份乙二醇，攪拌均勻，得到預聚液；S2，在預聚液中再加入35～55重量份液體石蠟和3～5重量份脫水山梨醇油酸酯，升溫至60～65℃后攪拌0.5～1h,再加入濃度在30～35wt％的鹽酸0.5～0.8重量份和2～4重量份烷羥基硅油，在80～85℃范圍內聚合反應1～5h后，過濾分出固體，用乙醇洗滌、烘干之后，得到螯合樹脂。以下提供幾種基于低鐵飽和度牛乳鐵蛋白的治療幽門螺旋桿菌感染性胃病藥物：第一種，其組成包括6％～8％鐵飽和度牛乳鐵蛋白80-200mg、雷貝拉唑10-20mg、克拉霉素300-500mg、替硝唑300-500mg。第二種，其組成包括6％～8％鐵飽和度牛乳鐵蛋白80-200mg、奧美拉唑100-200mg、阿莫西林200-500mg。第二種，其組成包括6％～8％鐵飽和度牛乳鐵蛋白10％、碳酸氫鈉10％、碳酸鈉30％、檸檬酸38％、氯化鈉2.4％、賦形劑9.6％。本發明以生鮮乳、乳清粉為原料提取與制備低鐵飽和度乳鐵蛋白，其能夠作為治療急慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜脫落和胃酸度過高的藥物、輔助用藥及保健食品的有效成分，療效顯著并且而無任何副作用。此外，本發明提供的方法具有乳鐵蛋白提取與制備純度高的優點，同時能夠降低乳鐵蛋白中Fe3+離子含量，使鐵飽和度降低至6-8％，從而明顯提高了乳鐵蛋白的抗菌活性。此外通過調整Fe3+螯合樹脂吸附的時間、攪拌速度以及媒介的濃度、pH，可以對乳鐵蛋白處理后的鐵飽和度進行控制，以滿足不同產品應用對乳鐵蛋白鐵飽和度的要求。附圖說明圖1是NaHCO3濃度對抑菌活性的影響的曲線圖。具體實施方式實施例1以下通過分組實驗對牛乳鐵蛋白的作用機理進行研究。一、牛乳鐵蛋白對耐藥幽門螺旋桿菌(HP)的體外抗菌試驗(一)試驗目的本實驗指在對牛乳鐵蛋白進行體外抗耐藥幽門螺旋桿菌活性評價,并與麗珠集團麗珠制藥廠生產的麗珠得樂(鉍劑)進行比較,以正確評價和開發利用牛乳鐵蛋白的抗菌功效。(二)受試藥品1、試驗品:7％鐵飽和度牛乳鐵蛋白(LF),總蛋白合量97％,LF純度96％。2、對照品:鉍劑(麗珠得樂),由麗珠集團麗珠制藥廠生產,每克藥含鉍劑110mg。3、對照品:14％鐵飽和度牛乳鐵蛋白，LF純度96％；20％鐵飽和度牛乳鐵蛋白，LF純度96％。(三)細菌:所試細菌為30株幽門螺旋桿菌臨床分離株,均為近年來從患者新鮮胃黏膜檢材中分離獲得,并經尿素酶試驗,革蘭染色鏡檢等方法鑒定證實，其中6株幽門螺旋桿菌為臨床耐藥株。(四)培養基:采用HP培養基和布氏肉湯。(五)藥物配制1、牛乳鐵蛋白配制將牛乳鐵蛋白直接用無菌HP培養基配制成一系列不同濃度的含藥平皿。2、鉍劑先用蒸餾水將鉍劑溶解,再用滅菌的培養基作一系列倍比稀釋使制成含不同濃度的藥物平皿。(六)試驗方法1、最小抑菌濃度(MIC):不同鐵飽和度LF的HP培養基平板(濃度32μg/mg～0.125μg/mg)。將30株幽門螺旋桿菌(其中包括6株臨床耐藥性HP菌株)培養物分成A、B兩批(每批15株),各用布氏肉湯配制成濃度為1x106/ml的菌液。以內徑為2mm的接種環挑取1環菌液劃線接種到不同濃度藥物平板的表面,同時接種不含藥物的平板上作為對照,劃線長度為1cm左右。于37℃微需氧環境中培養48h后觀察細菌生長情況。以無細菌生長平皿中所含藥物最小的濃度作為最小抑菌旅度(MIC)。結果見表1-1,表1-2。表1-1不同鐵飽和度牛乳鐵蛋白及鉍劑對HP菌株的MIC表1-27％鐵飽和度牛乳鐵蛋白對臨床耐藥HP菌株的MIC菌種名(菌株數)藥物MIC范圍幽門螺旋桿菌(30)7％鐵飽和度牛LF0.5625～3mg/ml2、殺菌曲線(1)將0.1ml濃度為106/ml的HP菌液,分別加入鐵飽和度為20％、14％、7％牛乳鐵蛋白濃度為(2.5mg/ml,5mg/ml,10mg/ml)的溶液中,混勻,于37℃的搖床中培養,分別于0.5h、1h、1.5h和2h時吸取0.1ml樣品涂布于HP培養基平板表面,37℃微氧環境中孵育48h后計數活菌數,并繪制出時間—殺菌曲線。(2)將0.1ml濃度為106/ml的HP菌液加入0.9ml含4μg的鉍劑溶液中,按上法同樣繪制出鉍劑的時間—殺菌曲線作為已知藥物的對照試驗。不同鐵飽和度牛LF及鉍劑在各時間計數活菌數的對數值見表2。表2不同鐵飽和度牛LF及鉍劑在各時間計數活菌數的對數值3、培養條件對MIC的影響(1)pH值對MIC的影響將各濃度的含藥培養基的HP分別調整至5、7、9三種狀態,測定該藥物平板對2株HP試驗菌株的MIC變化,結果見表3表3不同PH值對MIC的影響(2)細菌接種量對MIC的影響在其他條件不變的前提下,改變細菌接種量(103、106、109/ml比較不同菌量對MIC的影響,結果見表4。表4細菌接種量對MIC的影響接種菌量牛乳鐵蛋白MIC(mg/m1)鉍劑MIC(μg/m1)103/ml0.56251106/ml1.52109/ml32(3)NaHCO3濃度對抑菌活性的影響將鐵飽和度為20％、14％、7％的blf溶于NaHCO3溶液中,blf濃度為2.5mg/ml,測定對H.pylori的抑菌圈直徑，結果見圖1。圖1表明HCO3-的濃度為100mmol/L時，產生的抑菌圈直徑幾乎是對照組的1.7～2.2倍。這與HCO3-的濃度增加會提高blf鐵結合能力有一定關系。二、牛乳鐵蛋白對幽門螺旋桿菌感染動物的治療實驗(一)材料與方法:1、實驗動物:蒙古沙鼠,體重160±10g,月齡2～3與雌雄兼用,健康無腹瀉,分籠普通飼料喂養。2、實驗藥物:(1)8％鐵飽和度牛乳鐵蛋白；(2)食醋,恒順牌鎮江陳醋,瓶裝500ml,PH:4～5(3)麗珠得樂(鉍劑),由麗珠集團麗珠制藥廠生產,每克藥含鉍劑110mg。(4)安必仙,香港聯邦制藥廠生產。3、實驗方法:(1)脾虛大鼠幽門螺旋桿菌感染模型的復制參考彭氏法加以改良,造模大鼠每天空腹灌胃食醋2ml/100g,形成嗜酸偏食,共10天,單日禁食,雙日不限食,自由飲水,形成饑飽失常,以致飲食不節。第11天采用空腹束縛水浴(溫室29±15℃,水溫23士0.5℃)6小時形成倦冷刺激,使大鼠在上述因素共同作用下產生脾虛癥侯。第12天起空腹灌胃1x109cfu/ml的HP混懸液,劑量1.5ml/隔日一次,共三次,并繼續隔日禁食飼。(2)實驗分組大鼠隨機分為10組:①不用藥脾虛感染組,每日冷開水4ml灌胃。②陽性用藥對照I組用麗珠得樂治療10天,陽性II組用安必仙治療3天。③Lf治療分A組、B組、C組、D組、E組、F組、G組、H組共八組。(3)方法第17天予以治療用藥,脾虛感染組喂蒸餾水。陽性對照I組喂麗珠得樂0.35g/kg,陽性II組用安必仙0.53g/kg,7％鐵飽和度牛乳鐵蛋白大劑量A組2.0g/kg鼠,中劑量B組0.45g/kg鼠,小劑量C組0.05g/kg,連續用藥10天。D組0.45g/kg鼠,用藥3天,E組0.45g/kg鼠,用藥5天,F組0.45g/kg,用藥7天,G組0.45g/kg,用藥10天,H組0.45g/kg,用藥15天陽性對照II組治療3天后處死,取胃黏膜組織作檢查。(4)檢測指標:1、HP培養:大鼠胃黏膜活檢標本45份,分別取自大鼠胃竇部,將大鼠胃黏膜組織放入20％GS運用液中,4℃3h內送至實驗室,將滅菌組織黏膜研成勻漿,涂布于ECY培養基,在微需氧環境中37℃培養3-6天,3日后逐日觀察菌落。其可疑菌落作涂片染色、鏡檢,并作快速尿素酶試驗,如具有典型的菌、菌體形態和染色特征,快速尿素酶試驗陽性者鑒定為HP。2、快速尿素酶試驗。3、常規HE染色觀察組織形態學變化。4、W-S銀染觀察HP感染程度,HP檢查按Marshal1標準分級。5、電鏡觀察胃黏膜修復及HP感染情況。(二)結果:1、各檢測方法對幽門螺旋桿菌的檢出情況,見表5表5各組HP檢出情況2、常規HE染色觀察組織形態學變化。主要觀察胃黏膜炎癥反應。炎癥細胞以淋巴細胞及嗜酸性細胞為主,多分布于胃黏膜的底部及胃黏膜下層結締組織中,以炎癥細胞的數量為標準,將炎癥分為四級,“0”,為基本無炎癥細胞出現,“1”可見少量炎癥細胞,“2”為中等炎癥細胞,“3”可見大量炎癥細胞。結果見表6表6HE染色觀察炎癥情況表**P<0.01，*P<0.053、鼠胃黏膜電鏡觀察:高劑量組(0.5g/ml)電鏡下可見黏膜上皮結構完整,微絨毛可見,內質網清晰、豐富,分泌顆粒豐富。中劑量組(0.11g/ml)電鏡下可見黏膜上皮結構基本完整,微線毛可見,分泌顆粒較多。低劑量組(0.01g/ml)電鏡下可見大部分黏膜上皮結構完整,微線毛可見,分泌顆粒較少。陽性對照組電鏡下可見表層黏膜上皮細胞結構完整,微絨毛可見,充滿分泌顆粒。模型組電鏡下可見大部分表層黏膜上皮細胞壞死,不完整,微絨毛較少,分泌顆粒少。(三)、結論牛乳鐵蛋白對HP有一定的抑制作用,同時對由HP引起的胃粘膜損傷有修復作用。三、牛乳鐵蛋白對感染幽門螺旋桿菌小鼠的治療研究(一)材料與方法:1、實驗動物:C57BL/6小鼠,體重17士20g,7周齡,均為雌性,健康無腹瀉,分籠普通飼料喂養。2、實驗藥物:(1)7％鐵飽和度牛乳鐵蛋白。(2)麗珠得樂(鉍劑),由麗珠集團麗珠制藥廠生產,每克藥含鉍劑110mg。(3)菌株:HP菌株由浙大醫學院提供。3、實驗方法:所有動物灌胃前禁食12小時,將用布氏肉湯洗脫的HP菌灌胃小鼠,0.4ml/只(約109/m1),連續5次,1周完成；從最后一次灌胃HP液計算，4周以后喂牛乳鐵蛋白,小鼠分大劑量組(0.1875g/kg體重),中劑量組(0.0938g/kg體重)、低劑量(0.0469g/kg體重),麗珠得樂對照組(0.148g/kg體重),模型組,每組10只，共給藥10天。末次給藥后一天,處死小鼠,取胃黏膜組織,HE染色和W-S銀染觀察HP感染程度,同時進行尿素酶試驗及HP培養(取小鼠胃黏膜標本,置于標本保存液中-70℃保存。取標本于研磨器中,滴加約0.2ml的標本研磨液進行研磨,將研磨液涂布在ECY選擇性培養基上,5％02,15％C02,8.0％N2,微需氧培養5天,觀察菌落形態,典型的HP菌落形態為針尖樣大小,無色透明,表面光滑,濕潤,有光澤,挑取部分細菌進行快速尿素酶實驗和革蘭氏染色鏡檢,典型HP應為快速尿素酶實驗強陽性,鏡檢為革蘭氏陰性,形態呈飛鳥狀或螺旋桿狀)(二)結果:1、各檢測方法對幽門螺旋桿菌的檢出情況,見表7表7各檢測方法對幽門螺旋桿菌的檢出情況(三)結論牛乳鐵蛋白對C57BL/6小鼠感染的HP有一定的抑制作用。其中的細菌學檢(查陽性率)和尿素酶陽性率結果與麗珠得樂的結果還低10個百分點。四、牛乳鐵蛋白對水浸應激性胃潰瘍動物模型的影響(一)試驗目的:研究牛乳鐵蛋白對水浸大鼠應激性胃潰瘍的影響。(二)藥物和實驗方法1、7％鐵飽和度牛乳鐵蛋白。2、麗珠得樂(鉍劑)，由麗珠集團麗珠制藥廠生產,每克藥含鉍劑110mg。3、動物SD大鼠,體重(200～250g),雌雄各半，由漸江省中醫藥研究院動物房提供。4、試驗方法:取SD大鼠50只,體重(200～250g),雌雄各半,隨機分為5組,10只/組,設立空白對照,三個劑量的牛乳鐵蛋白組(1.4g/kg,0.7g/kg,0.28g/kg)和麗珠得樂陽性對照組(0.8g/kg),喂藥十天后,禁食24h,自由飲水,然后將動物裝入特制籠內,垂直浸入23±0.5℃水中。浸入深度平動物劍突水平，24h后取出，頸椎脫位處死。打開腹腔,結扎胃賁門和幽門并經胃壁向胃腔內注入1％的甲醛溶液8m1,將胃取出浸入甲醛溶液中,30分鐘后沿胃大彎剖開,計數腺胃部出現的潰瘍點數及潰瘍指數。解剖顯微鏡下測量胃黏膜損傷長度(mm),以其總和作為潰瘍指數,在組間進行比較。5、統計方法實驗數據表示為平均值±標準差組間差異的顯著性用t一檢驗進行。(三)、試驗結果結果表明,牛乳鐵蛋白0.7g/kg、2.8g/kg能明顯降低大鼠的潰瘍指數。與空白組比較,有顯著差異(P<o.o5或P<o.o1)。結果見表8表8牛乳鐵蛋白對水浴應激致大鼠急性胃黏膜損傷的影響(X±s,N＝10)**P<0.01,*P<0.05,與空白對照組比較(四)、結論本試驗采用水浸應激致大鼠急性胃黏膜損傷,以胃黏膜損傷長度為指標,研究牛乳鐵蛋白對水浸應激致大鼠胃黏膜損傷的影響。結果表明,牛乳鐵蛋白能降低大鼠的潰瘍指數(降低78％,比麗珠得樂高48％,),抑制率在28-78％之問,比麗珠得樂的抑制率多高出20個百分點。牛乳鐵蛋自能降低大鼠胃黏膜損傷長度,對水漫應激致大鼠急性胃黏膜損傷有一定的保護作用。五、牛乳鐵蛋白對乙酸灼燒致大鼠胃潰瘍的影響。(一)試驗目的研究牛乳鐵蛋白對乙酸灼燒致大鼠胃潰瘍的影響。(二)藥物1、7％鐵飽和度牛乳鐵蛋白。2、麗珠得樂(鉍劑),由麗珠集團麗珠制藥廠生產,每克藥含鉍劑110mg。3、胃動素(MTL)試劑盒:由蘇州大學醫學院血栓研究室提供。4、前列腺素(PEG2)試劑盒:由北京福瑞公司提供。(三)動物:SD大鼠,體重(200～250g),雌雄各半,由漸江省中醫藥研究院動物房提供。(四)試驗方法取SD大鼠50只,體重(200～250g),雌雄各半,試驗前禁食24h,自由飲水,在乙醚麻醉下打開腹腔,將內徑5mm長30mm的玻璃管垂直放置于胃體部漿膜面上,向管腔內加入冰乙酸0.2m1,1.5分鐘后用棉簽蘸出冰乙酸,縫合手術切口。術后正常飲食,第二天隨機分為5組,10只/組,設立空白對照,三個劑量的牛乳鐵蛋白組(1.4g/kg,0.7g/kg,0.28g/kg)和麗珠得樂陽性對照組(0.8g/kg),連續喂藥十天。解剖取出胃,并用甲醛固定,測量潰瘍面積(rhm2),各組間進行比較。同時取血,分離血清,測胃動素(MTL)及前列腺素(PGE2)。(五)、統計方法實驗數據表示為平均值±標準差組間差異的顯著性用t一檢驗進行。(六)、試驗結果結果見表9表9牛乳鐵蛋白對乙酸的灼燒型潰瘍的影響組別劑量(g/kg)動物數(n)潰瘍面積抑制率(％)空白模型對照組1041.20±10.01牛乳鐵蛋白(1.4g/kg)1013.93±9.7866.19牛乳鐵蛋白(0.7g/kg)1026.57±8.1835.51牛乳鐵蛋白(0.28g/kg)1035.81±9.6413.08麗珠得樂(0.8g/kg)1029.40±8.1228.64**P<0.01,*P<0.05,與空白對照組比較表10牛乳鐵蛋白對乙酸灼燒型大鼠胃動素(MTL)及前列腺素(PGE2)的影響*P<0.05,與空白對照組比較(七)結論本試驗采用乙酸灼燒致大鼠胃黏膜損傷,以潰瘍面積為指標,研究牛乳鐵蛋白對乙酸灼燒致大鼠胃黏膜損傷的影響。結果表明,牛乳鐵蛋白能降低大鼠的潰瘍指數(降低65％,比麗珠得樂高52％),抑制率在13-66％之間,比麗珠得樂的抑制率高出37個百分點，對乙酸灼燒致大鼠胃黏膜損傷有一定的保護作用。六、牛乳鐵蛋白對幽門結扎致大鼠急性胃黏膜損傷的影響(一)試驗目的觀察牛乳鐵蛋白對幽門結扎致大鼠急性胃粘膜損傷的影響。(二)藥物1、7％低鐵飽和度牛乳鐵蛋白。2、麗珠得樂(鉍劑)，由麗珠集團麗珠制藥廠生產,每克藥含鉍劑110mg。(三)動物SD大鼠,體重(200～250g),雌雄各半，由浙江省中醫藥研究院動物房提供。(四)試驗方法取SD大鼠50只,體重(200～250g),雌雄各半,隨機分為5組,10只/組,設立空白對照,三個劑量的牛乳鐵蛋白組(1.4g/kg,0.7g/kg,0.28g/kg)和麗珠得樂陽性對照組(0.8g/kg),喂藥十天。禁食36小時,自由飲水,在乙醚麻醉下固定大鼠,沿腹中線剪開一小口,找出胃并結扎幽門。術后18小時解剖胃,向胃腔內注入1％甲醛溶液8m1。將胃浸入1％福爾馬林溶液中,10min后,沿胃大彎剪開胃,觀察前胃部潰瘍的發生情況。潰瘍程度的評價,可以計數前胃部潰瘍的面積,以其總和作為潰瘍指數。也常用okabe法,在解剖顯微鏡下測量潰瘍面積,將每只鼠潰瘍面積的總和分為5個等級,作為潰瘍指數。根據潰瘍指數可進一步計算:潰瘍抑制百分比＝(對照組潰瘍指數-給藥組潰瘍指數)/對照組潰瘍指數*100％(五)統計方法實驗數據表示為平均值±標準差組間差異的顯著性用t一檢驗進行。(六)試驗結果結果見表11表11牛乳鐵蛋白對幽門結扎潰瘍的影響**P<0.01,*P<0.05,與空白對照組比較結論本試驗采用幽門結扎致大鼠急性胃黏膜損傷,以潰瘍指數為指標,研究牛乳鐵蛋白對幽門結扎致大鼠胃黏膜損傷的影響。結果表明,牛乳鐵蛋白能降低大鼠的潰瘍指數,抑制率在31-51％之問,比麗珠得樂的抑制率多高出12個百分點.對幽門結扎致大鼠急性胃黏膜損傷有一定的保護作用。七、牛乳鐵蛋白對乙醇致大鼠胃黏膜損傷的影響(一)實驗目的研究牛乳鐵蛋白對乙醇致大鼠急性胃黏膜損傷的影響。(二)藥物1、7％鐵飽和度牛乳鐵蛋白,臨用前將牛乳鐵蛋白用蒸餾水配成0.14g/ml,0.07g/m1,0.028g/m1的濃度,大鼠ig(灌胃)上述溶液1ml/100g。相當于人臨床用藥15g,7.5g,3g。2、麗珠得樂:由麗珠集團麗珠制藥廠生產,臨用前用蒸餾水配制,2包加水25ml,每100g大鼠灌胃1ml。(三)動物:SD大鼠,體重(200±20)g,雌雄兼用,由浙江省中醫藥研究院動物房提供。(四)實驗方法取SD大鼠50只,體重(200±20)g,雌雄兼用,隨機分成5組,10只/組,設立空白對照組,三個劑量的牛乳鐵蛋白組(1.4g,0.7g,0.28g)和麗珠得樂組陽性對照組(0.8g/kg)連續喂藥10天,末次給藥后,禁食48小時,自由飲水,實驗時灌服無水乙醇(1ml/只),一小時后解剖取胃,以1％的甲醛溶液固定。損傷程度以潰瘍指數表示。條索狀損傷的長度大于1mm者測量其長度,每mm計1分,若其寬度大于1mm者將其分加倍,計分總數為該動物的:潰瘍指數,各組間進行比較。(五)統計方法實驗數據表示為平均值±標準差組間差異的顯著性用t一檢驗進行。(六)試驗結果結果見表12表12牛乳鐵蛋白對乙醇型潰瘍的影響**P<0.01,*P<0.05,與空自對照組比較(七)結論本試驗用乙醇致大鼠急性胃黏膜損傷,以潰瘍指數為指標,研究牛乳鐵蛋白對乙醇致大鼠胃黏膜損傷的影響。結果表明,牛乳鐵蛋白能降低大鼠的潰瘍指數,比麗珠得樂降低大鼠的潰瘍指數還多15％,比麗珠得樂的抑制率多高出10個百分點，對乙醇致大鼠急性胃黏膜損傷有一定的保護作用。八、牛乳鐵蛋白對大鼠胃液分泌的影響(-)實驗目的:觀察牛乳鐵蛋白對大鼠胃液量、胃液酸度和胃蛋白的影響。(二)藥物7％鐵飽和度牛乳鐵蛋白。陽性對照藥:麗珠得樂(鉍劑)由麗珠集團麗珠制藥廠生產,每克藥含鉍劑110mg。(三)動物SD大鼠,體重(200士20)g,雌雄兼用,由浙江省中醫藥研究院動物房提供。(四)試驗方法:把SD大鼠隨機分為5組,每組10只,分別設立高劑量組(LF0.28g/200g大鼠)、中劑量組(LF為0.134g/200g大鼠)、低劑量(LF為0.056g/200g大鼠),空白對照組(LF為0.053g/200g大鼠)、陽性對照(折合人劑量,每日4包)、空白對照組(喂蒸餾水),連續喂藥10天,末次給藥后均禁食24小時，不禁水。在乙醚麻醉下,沿腹正中線剪開小口,輕輕找出胃,結扎幽門,縫合腹壁切口,4～6小時后拆線找開腹腔結扎賁門,摘取全胃,用濾紙擦凈血跡,沿大彎側剪開胃腔,傾出胃內容物收集于刻度離心管中,記錄胃液量,再以1,000-2,000g離心約5分鐘,去除食物殘渣等胃內容物(以酸度計測胃液的酸度)用酸堿滴定法測胃液總酸度。利用胃蛋白酶分解血紅蛋白生成酪氨酸,再用酚紅試劑的顯色反應測定酪氨酸的量,從而間接計算胃蛋白酶的活性。胃液總酸度的測定:取上清胃液1ml,加酚紅指示劑1滴,用0.0lmol/L的NaoH滴定,直至胃液先呈黃色后轉為紅色2秒內不消失為終點,記錄用去NaoH溶液量?？偹岫萴mo1/L＝耗去的NaoH溶液量。(2)胃蛋白酶活性測定取上清胃液0.1ml,加入1％牛血清白蛋白(0.1NHCL配制)1ml37℃溫孵20分鐘,加入2％三氯乙酸,并在沸水中加熱5分鐘,冷卻后過濾.。取濾出液0.2ml,加入0.8m10.125NNa2C03,溶液,同時加入Folin-Ciocalte試劑(5ml甲液和0.5ml乙液),混勻后靜置30分鐘后比色(700mn)。以酪氨酸標準曲線計算胃蛋白酶活性。以mmol/h酪氨酸表示胃蛋白酶排出量。(五)、結果結果見表13結果表明,牛乳鐵蛋白能抑制大鼠胃液分泌,抑制胃液酸度。表13牛乳鐵蛋白對胃液的影響(六)、結論結果顯示,1.4g/kg牛乳鐵蛋白能抑制大鼠胃液分泌,減少胃液酸度。其中低劑量組(0.23g/kg)與空白對照組相比,能降低胃液36％,降低胃總酸度12％。以下提供一種從牛乳中提取與制備高純度低鐵飽和度乳鐵蛋白(即實施例1中所用的低鐵飽和度乳鐵蛋白)的方法，它分別用放置陽離子交換樹脂的攪拌罐來吸附、解附牛乳中乳鐵蛋白，并輔以膜分離技術將其分離、濃縮，可以實現對乳鐵蛋白的高度純化；接下來，將所得乳鐵蛋白濃縮液放置不溶性Fe3+螯合樹脂(如D403螯合等系列樹脂)的攪拌罐來吸附鐵離子使其失去鐵離子變為不飽和狀態，并輔以膜分離將其濃縮純化。在使用陽離子交換樹脂對乳鐵蛋白進行吸附、解析時，攪拌罐可調攪拌槳轉速速率為20～100rpm；罐內側壁有增渦流擋板，罐底設置帶過濾板的樹脂床，在樹脂床上的樹脂層上方8～12cm高度處設置快速導流抽濾管。罐內設置供自動控制的各種傳感器pH計，重量計，電導率計及溫度計，罐內液體保溫溫度為3～60℃。乳鐵蛋白吸附樹脂為陽離子交換樹脂，樹脂吸附解附的次數和條件可以根據不同產品和產品純度的要求設定；樹脂的吸附時間為20～120分鐘，吸附溫度在3～30℃。樹脂的解附采用兩級鹽濃度分別解附乳過氧化物酶蛋白、乳鐵蛋白。第一級鹽濃度為1～2.5％，解附乳過氧化物酶蛋白，解附時間為20～120分鐘；第二級鹽濃度為3.5～7％，解附乳鐵蛋白，解附時間為20～120分鐘；解附的攪拌速率為20～150rpm。樹脂解附的時間為20～120分鐘，樹脂解附所用的鹽為鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽；乳鐵蛋白解附液通過0.05～1.4微米的微濾膜將乳鐵蛋白解附液除菌，去殘余的脂肪與其他小顆粒；再用1K～50K分子截留量的超濾膜進行脫鹽和濃縮。在一個實施方式中，為了提高乳鐵蛋白的純度，可以對經上述工藝吸附解附脫鹽濃縮的乳鐵蛋白濃液再經過一次弱酸型陽離子樹脂(如CM樹脂)的吸附、解附和超濾膜的濃縮獲得的。在一個實施方式中，所述第2步得到濃縮液在進入第3步之前加入氯化鈉，使氯化鈉的濃度達到5～10g/L，再用截留分子量范圍是200000～400000的超濾膜對濃縮液進行過濾。上述得到的濃縮液再放置于不溶性Fe3+螯合樹脂如D403螯合樹脂，加入醋酸溶液、醋酸鹽、枸櫞酸鹽作為媒介，配制其吸附環境濃度為0.05mol/L～1.0mol/L，調pH4.0～6.7，加以攪拌吸附乳鐵蛋白中鐵離子，樹脂吸附攪拌時間、媒介濃度、轉速、pH可根據產品對鐵飽和度的要求設定(經實驗測定，吸附時間對鐵飽和度影響最大，擬取10～150分鐘)；樹脂的吸附時間10～150分鐘，攪拌槳轉速速率為10～150rpm，吸附溫度在3～30℃。吸附后清液用1K-50K分子截留量的超濾膜進行脫鹽和濃縮。將乳鐵蛋白濃液進行真空冷凍干燥制成凍干粉。樹脂經吸附工藝過程后，所吸附的鐵離子用1mol/L～3mol/L鹽酸浸泡即可將樹脂解附再生，再用RO水沖洗即可供下一批次吸附之用。實施例2陽離子交換樹脂的制備本發明所使用的陽離子交換樹脂可以通過如下的方法制備得到：第1步，取10g氯乙?；郾揭蚁?二乙烯基苯微球載體(PS-acyl-Cl)，加入60ml四氫呋喃溶脹12h，再加入40ml甲醇，然后按照重量比(PS-acyl-Cl)：乙二胺(EDA)：碳酸氫鈉為1：8：0.7，依次加入乙二胺和碳酸氫鈉，在于80℃下攪拌反應24h，反應結束后，將產物倒入砂芯漏斗中，用蒸餾水洗至中性，甲醇洗濾3遍真空干燥至恒重，得到交聯EDA微球載體；第2步，稱60g取交聯EDA微球載體，置于三頸燒瓶中，加入二甲基甲酰胺溶脹12h后，加入2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸(AMPS)16g、N-丁氧基甲基丙烯酰胺(NBMA)3g、丙烯酸雙環戊烯基酯(DCPA)、K2CO35g、四丁基溴化銨(TBAB)12g，攪拌下于一定溫度的油浴中回流反應，反應結束后將反應產物轉移至沙芯漏斗中，用5wt％的HC1清洗4遍后用蒸餾水濾洗至中性，最后用甲醇洗濾后抽干，真空干燥至恒重，得到陽離子交換樹脂。實施例3陽離子交換樹脂的制備與實施例3的區別在于第2步中未加入NBMA。本發明所使用的陽離子交換樹脂可以通過如下的方法制備得到：第1步，取10g氯乙?；郾揭蚁?二乙烯基苯微球載體(PS-acyl-Cl)，加入60ml四氫呋喃溶脹12h，再加入40ml甲醇，然后按照重量比(PS-acyl-Cl)：乙二胺(EDA)：碳酸氫鈉為1：8：0.7，依次加入乙二胺和碳酸氫鈉，在于80℃下攪拌反應24h，反應結束后，將產物倒入砂芯漏斗中，用蒸餾水洗至中性，甲醇洗濾3遍真空干燥至恒重，得到交聯EDA微球載體；第2步，稱60g取交聯EDA微球載體，置于三頸燒瓶中，加入二甲基甲酰胺溶脹12h后，加入2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸(AMPS)16g、丙烯酸雙環戊烯基酯(DCPA)、K2CO35g、四丁基溴化銨(TBAB)12g，攪拌下于一定溫度的油浴中回流反應，反應結束后將反應產物轉移至沙芯漏斗中，用5wt％的HC1清洗4遍后用蒸餾水濾洗至中性，最后用甲醇洗濾后抽干，真空干燥至恒重，得到陽離子交換樹脂。實施例4乳鐵蛋白的吸附、解附試驗配備3份100ml1.6wt％乳鐵蛋白溶液于250ml燒杯中，各取20μl進高效液相色譜儀檢測，峰面積分別為1240.0034(萬)、1241.6533(萬)和1240.0535(萬)，分別將100gSPC70樹脂、實施例1和實施例2中的陽離子交換樹脂分別100g置于上述盛有250ml乳鐵蛋白溶液的燒杯中，吸附攪拌速率為60rpm，每10min取樣一次進行檢測，實驗數據如下表看出實施例4和5中陽離子樹脂提高生產回收率，改善吸附解附所消耗的時間。另外，再經過鹽溶液淋洗、解附后計算蛋白含量。淋洗、解附的操作是：采用兩級鹽濃度分別解附乳過氧化物酶蛋白、乳鐵蛋白。第一級鹽濃度為1.5％，采用的是NaCl水溶液，解附乳過氧化物酶蛋白，解附時間為70分鐘；第二級鹽濃度為5.0％，采用的是NaCl水溶液，解附乳鐵蛋白，解附時間為80分鐘；解附的攪拌速率為100rpm。乳鐵蛋白解附液通過0.2微米的微濾膜將乳鐵蛋白解附液除菌，去殘余的脂肪與其他小顆粒；再用2000分子截留量的超濾膜進行脫鹽和濃縮。從上表可以看出，采用SPC70樹脂、實施例2和實施例3中的陽離子交換樹脂都可以較好地獲得乳鐵蛋白的吸附、解附效果，不過回收率上還是有所區別。實施例5乳鐵蛋白的提取與制備試驗半脫脂牛奶1890L，pH6.7，總蛋白為3.38g/L，乳鐵蛋白濃度為126mg/L，將SPC70樹脂加入攪拌罐，吸附80min，攪拌速率為60rpm，收集已吸附后的牛奶并用RO水沖洗樹脂，加入第一級100L2.5％NaCl水溶液解附40min，攪拌轉速40rpm，收集解附液后用RO水淋洗收集；加入第二級100L5.5％NaCl水溶液解附40min，攪拌轉速40rpm，收集解附液后用RO水淋洗收集樹脂3次。第二級的解吸液以及第二次RO淋洗液合并收集共180L，輸送到0.8μm的微濾膜設備中進行除菌、除雜；用30K分子截留量的超濾膜設備進行脫鹽濃縮，取樣檢測其鐵飽和度為20％；將乳鐵蛋白濃液輸入到裝有CM樹脂罐中除去雜蛋白，收集已吸附雜蛋白后的乳鐵蛋白溶液繼續用10K分子截留量的超濾膜設備進行脫鹽濃縮，將其中的少量濃液進行冷凍干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.0％，灰分1.1％，總蛋白為96.3％，鐵飽和度20％；再將剩余的乳鐵蛋白濃液輸入到裝有放置D403螯合樹脂罐中進行脫鐵，加入0.1mol/L枸櫞酸鹽，并醋酸-醋酸鈉緩沖液調pH至6.0，加以攪拌吸附鐵離子，樹脂吸附時間120分鐘，攪拌槳轉速速率60rpm。收集以吸附鐵離子后的乳鐵蛋白溶液繼續用10K分子截留量的超濾膜設備進行脫鹽濃縮，收集濃液進行冷凍干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.0％，灰分1.0％，總蛋白為96.3％，鐵飽和度7％。實施例6乳鐵蛋白的提取與制備試驗半脫脂牛奶1890L，pH6.7，總蛋白為3.38g/L，乳鐵蛋白濃度為126mg/L，采用實施例2中描述的步驟操作生產陽離子交換樹脂，將樹脂加入攪拌罐，吸附80min，攪拌速率為60rpm，收集已吸附后的牛奶并用RO水沖洗樹脂，加入第一級100L2.5％NaCl水溶液解附40min，攪拌轉速40rpm，收集解附液后用RO水淋洗收集；加入第二級100L5.5％NaCl水溶液解附40min，攪拌轉速40rpm，收集解附液后用RO水淋洗收集樹脂3次。第二級的解吸液以及第二次RO淋洗液合并收集共180L，輸送到0.8μm的微濾膜設備中進行除菌、除雜；用30K分子截留量的超濾膜設備進行脫鹽濃縮，取樣檢測其鐵飽和度為20％；將乳鐵蛋白濃液輸入到裝有CM樹脂罐中除去雜蛋白，收集已吸附雜蛋白后的乳鐵蛋白溶液繼續用10K分子截留量的超濾膜設備進行脫鹽濃縮，將其中的少量濃液進行冷凍干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.2％，灰分1.1％，總蛋白為96.7％，鐵飽和度20％；再將剩余的乳鐵蛋白濃液輸入到裝有放置D403螯合樹脂罐中進行脫鐵，加入0.1mol/L枸櫞酸鹽，并調pH至6.0，加以攪拌吸附鐵離子，樹脂吸附時間120分鐘，攪拌槳轉速速率60rpm。收集以吸附鐵離子后的乳鐵蛋白溶液繼續用10K分子截留量的超濾膜設備進行脫鹽濃縮，收集濃液進行冷凍干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.1％，灰分1.0％，總蛋白為96.7％，鐵飽和度7％。實施例7乳鐵蛋白的提取與制備試驗與實施例5的區別在于：將剩余的乳鐵蛋白濃液輸入到裝有放置D403螯合樹脂罐中進行脫鐵，加入1.0mol/L枸櫞酸鹽，并醋酸-醋酸鈉緩沖液調pH至4.0，加以攪拌吸附鐵離子，樹脂吸附時間20分鐘，攪拌槳轉速速率150rpm。收集以吸附鐵離子后的乳鐵蛋白溶液繼續用10K分子截留量的超濾膜設備進行脫鹽濃縮，收集濃液進行冷凍干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.0％，灰分1.0％，總蛋白為96.4％，鐵飽和度7％。實施例8乳鐵蛋白的提取與制備試驗與實施例6的區別在于：將剩余的乳鐵蛋白濃液輸入到裝有放置D403螯合樹脂罐中進行脫鐵，加入0.3mol/L枸櫞酸鹽，并醋酸-醋酸鈉緩沖液調pH至6.7，加以攪拌吸附鐵離子，樹脂吸附時間70分鐘，攪拌槳轉速速率80rpm。收集以吸附鐵離子后的乳鐵蛋白溶液繼續用10K分子截留量的超濾膜設備進行脫鹽濃縮，收集濃液進行冷凍干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.0％，灰分1.0％，總蛋白為96.5％，鐵飽和度8％。實施例9乳鐵蛋白的提取與制備試驗與實施例6的區別在于：不溶性Fe3+螯合樹脂采用如下方法制備的樹脂，包括如下步驟：S1，按重量份計，將5份的苯酚、70份質量濃度在25wt％的甲醛水溶液混合，在42℃溫度范圍內進行反應3h，再加入6份2,2-二羥基丙酸和37份乙二醇，攪拌均勻，得到預聚液；S2，在預聚液中再加入45重量份液體石蠟和4重量份脫水山梨醇油酸酯，升溫至62℃后攪拌0.6h,再加入濃度在30wt％的鹽酸0.6重量份和3重量份烷羥基硅油，在82℃范圍內聚合反應2h后，過濾分出固體，用乙醇洗滌、烘干之后，得到螯合樹脂。實施例10乳鐵蛋白的提取與制備試驗與實施例9的區別在于：不溶性Fe3+螯合樹脂吸附前將得到濃縮液中加入氯化鈉，使氯化鈉的濃度達到5g/L，再用截留分子量是200000的超濾膜對濃縮液進行過濾，然后進行螯合樹脂脫鐵。對照例1與實施例10的區別在于：濃縮液中中未加入氯化鈉，即得到濃縮液直接用截留分子量是300000的超濾膜對濃縮液進行過濾；然后進行螯合樹脂脫鐵。對照例2與實施例10的區別在于：第3步中未采用超濾膜進行過濾。即得到濃縮液中加入氯化鈉，使氯化鈉的濃度達到5g/L；然后進行螯合樹脂脫鐵。對照例3與實施例10的區別在于：螯合樹脂的制備中，未加入烷羥基硅油改性劑。即不溶性Fe3+螯合樹脂的制備方法，包括如下步驟：S1，按重量份計，將5份的苯酚、70份質量濃度在25wt％的甲醛水溶液混合，在42℃溫度范圍內進行反應3h，再加入6份2,2-二羥基丙酸和37份乙二醇，攪拌均勻，得到預聚液；S2，在預聚液中再加入45重量份液體石蠟和4重量份脫水山梨醇油酸酯，升溫至62℃后攪拌0.6h,再加入濃度在30wt％以上的鹽酸0.6重量份，在82℃范圍內聚合反應2h后，過濾分出固體，用乙醇洗滌、烘干之后，得到螯合樹脂。以上各實施例最終所得到的粉末的檢測指標如下：從上表中可以看出，實施例10提供的方法具有更高的吸附收率和蛋白的純度，通過實施例10和對照例1對比可以看出，通過加鹽變性之后，可以有效地去使一部分影響到吸附過程的蛋白發生變性，進而被超濾去除；實施例9和對照例2對比可以看出，通過加鹽之后未采用超濾過濾仍然無法將這部分蛋白的影響去除，仍然會導致吸附步驟中的回收率偏低；實施例9和對照例3對比可以看出，通過在螯合樹脂的制備中加入烷羥基硅油改性劑，可以提高對蛋白的排斥力，避免乳鐵蛋白被吸附。本發明提供的方法具有乳鐵蛋白提取與制備純度高的優點，同時能夠降低乳鐵蛋白中Fe3+離子含量，使鐵飽和度降低至6-8％，從而明顯提高了乳鐵蛋白的抗菌活性。此外通過調整Fe3+螯合樹脂吸附的時間、攪拌速度以及媒介的濃度、pH，可以對乳鐵蛋白處理后的鐵飽和度進行控制，以滿足不同產品應用對乳鐵蛋白鐵飽和度的要求。實施例11一種治療幽門螺旋桿菌感染性胃病藥物，其組成包括6％～8％鐵飽和度牛乳鐵蛋白140mg、雷貝拉唑15mg、克拉霉素400mg、替硝唑400mg。實施例12一種治療幽門螺旋桿菌感染性胃病藥物，其組成包括6％～8％鐵飽和度牛乳鐵蛋白140mg、奧美拉唑150mg、阿莫西林350mg。實施例13一種治療幽門螺旋桿菌感染性胃病藥物，其組成包括6％～8％鐵飽和度牛乳鐵蛋白10％、碳酸氫鈉10％、碳酸鈉30％、檸檬酸38％、氯化鈉2.4％、賦形劑9.6％。以下是實施例11-13這三種藥物3天、5天、7天、15天的治療wistar大鼠效果數據，以證明上述三種藥物在治療胃病上的療效。當前第1頁1 2 3