本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物及其制備方法。

背景技術(shù)：

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 (rheumatoid arthritis，RA) 是以關(guān)節(jié)慢性滑膜炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫疾病，主要表現(xiàn)為對稱性、慢性、進行性多關(guān)節(jié)炎，是最常見和致殘率最高的骨關(guān)節(jié)疾病之一。RA 歸屬于中醫(yī) “痹病” 范疇，其病機主要為正氣不足于先，復(fù)感風(fēng)寒濕諸邪于后，痰濁瘀血，痹阻經(jīng)絡(luò)，氣血閉阻，以致人體肌肉、筋骨失養(yǎng)，終至筋傷骨損。該病臨床多以虛實夾雜多見，以肝腎氣血不足為本、風(fēng)寒濕痹阻為標(biāo)，因此祛風(fēng)除濕、補益肝腎、溫經(jīng)通絡(luò)為治療 RA 的基本法則。趨化因子中 CXC 亞族主要趨化、激活中性粒細(xì)胞，并能促進粘附分子表達、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用、細(xì)胞骨架的重新構(gòu)建、中性粒細(xì)胞的 “呼吸爆炸”以及其他炎癥反應(yīng)。其受體 CXCR3 在炎癥細(xì)胞選擇性進入關(guān)節(jié)的過程中發(fā)揮重要作用。白細(xì)胞介素-8 (IL-8) 是 CXCR3 中的一種重要配體，參與RA 的炎癥反應(yīng)，具有很強的中性粒細(xì)胞趨化作用和促血管增生作用。IL-8 在 RA 患者的滑膜液和滑膜組織中滴度較高。在趨化因子抑制實驗中，給予 IL-8 中和抗體后能改善膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎。

趨化因子能活化促進淋巴細(xì)胞的發(fā)育成熟，活化滑膜成纖維樣細(xì)胞，激活 T 淋巴細(xì)胞信號傳導(dǎo)通道，并且在血管形成中起一定作用，具有化學(xué)趨化和細(xì)胞免疫作用，在 RA 等自身免疫性疾病發(fā)病中發(fā)揮重要作用。CXCR3 被公認(rèn)為 T 淋巴細(xì)胞遷移至炎性部位的標(biāo)記之一。IL-8 又稱為中性粒細(xì)胞激活蛋白，由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞等產(chǎn)生。在 RA 關(guān)節(jié)病灶滑液中，有大量 IL-8 異常增多。作為 CXCR3 的配體之一，IL-8 對中性粒細(xì)胞和 T 細(xì)胞具有強大趨化作用，不僅參與 RA 的炎癥期，還可以促進新血管生成，使細(xì)胞保持遷移能力并為血管翳形成提供氧。從 RA 病人的血清、滑膜液和滑膜組織中可檢測到高滴度的 IL-8。該趨化因子主要由 RA 滑膜中的巨噬細(xì)胞、滑膜細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞合成。動物實驗表明: 將重組 IL-8注射到兔的膝關(guān)節(jié)內(nèi)，可引起滑膜炎，其病理改變與人的 RA 相似。相關(guān)研究顯示: RA 滑膜細(xì)胞可產(chǎn)生 IL-8，滑膜中、滑膜液中 IL-8 水平增高。抗 IL-8 抗體可中和 40%RA 關(guān)節(jié)腔積液對嗜中性粒細(xì)胞的趨化活性。IL-8 在中性粒細(xì)胞粘附、穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞的過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。IL-8 可調(diào)節(jié) RA 中淋巴細(xì)胞粘附分子的表達。在趨化因子抑制實驗中，給予 IL-8 中和抗體后能改善鼠膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎。

三爪金龍：為葡萄科爬山虎屬植物三葉爬山虎Parthenocissus himalayana（Royle）Planch.［Ampelopsis himalayana Royle］的全株。秋、冬季采收根及莖，洗凈后切片或切段，曬干。夏、秋季采葉，曬干。【性味】 辛；溫。【功能主治】祛風(fēng)除濕；散瘀通絡(luò)。主風(fēng)濕痹痛；跌打損傷；骨折。【原植物形態(tài)】三葉爬山虎 落葉木質(zhì)藤本。多分枝，枝粗壯，土褐色；卷須短而分枝，頂端有吸盤。掌狀3小葉互生；總?cè)~柄長5-12cm，無毛或有毛；葉片紙質(zhì)，中間小葉卵形或?qū)捙槧盥研危L6-12cm，寬2-7cm，先端漸尖或近尾狀，基部楔形，側(cè)生小葉不對稱，斜卵形，較中間小葉略小，邊緣有明顯而帶尖頭的鋸齒，上面無毛，下面或沿葉脈有疏柔毛；小葉柄長5-6mm。花兩性，聚傘花序常生于短枝的頂端或與葉對生；花梗較葉柄短；花淡綠色，5數(shù)，有時4數(shù)；花萼淺碟狀，全緣；花瓣長圓形；雄蕊與花瓣對生；花盤不明顯；花柱短圓柱形，花瓣脫落后先端常擴大成盤狀。漿果球形，熟時變黑褐色，具白粉，種子1-2顆。收載于中藥大辭典。

小金發(fā)蘚：為金發(fā)蘚科小金發(fā)蘚屬植物東亞小金發(fā)蘚Pogonatum inflexum（Lindb.)Lac.［Polytricum inflexum Lindb.］的全草。5-7月采收，洗凈，曬干。【性味】辛；溫。【功能主治】鎮(zhèn)靜安神；散瘀；止血。主心悸怔忡；失眠多夢；跌打損傷；吐血。【化學(xué)成份】 含牛磺酸。【性狀】本品為數(shù)株叢集在一起的團塊，莖長2-8cm，暗綠色或黃褐色。濕潤分離后，每株莖單一，基部密生細(xì)假根。葉闊披針形，漸尖，基部圓卵形，內(nèi)凹，半鞘狀，邊緣有粗鋸齒；中肋粗，長達葉尖，腹面布滿櫛片。有的可見細(xì)長蒴柄，橙黃色。孢蒴圓柱形，蒴蓋有長喙，蒴帽密布黃色長毛。氣微，味淡。收載于中藥大辭典。

藜蘆瑟文（Protocevine）：CAS號5876-23-3，分子式C₂₇H₄₃NO₈，分子量509.64。【成分來源】藜蘆 Veratrum nigrum。

尖葉石松堿（Acrifoline）：CAS號664-24-4，分子式C₁₆H₂₃NO₂，分子量261.36。【成分來源】小接筋草Huperzia selago [Syn. Lycopodium selago]，兩年石松Lycopodium annotinum var. acrifolium。

咖坡林 （Capaurine ）：CAS號478-15-9，分子式C₂₁H₂₅NO₅，分子量371.43。熔點165-167℃。【藥理作用】具有興奮子宮作用。【用途】作用于子宮 。【成分來源】罌粟科植物深山紫堇 Coxydalis pallida (Thunb.)Pers. 根，細(xì)深山紫堇 C.pallida Pers. var. tenuis Yatabe全草。

3個原料藥化學(xué)結(jié)構(gòu)：

藜蘆瑟文（Protocevine）

尖葉石松堿（Acrifoline） 咖坡林 （Capaurine ）。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服背景技術(shù)的不足，提供一種有效治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物及其制備方法。

本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

制成該治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的原料藥的組成和重量份為：

三爪金龍85-90重量份 小金發(fā)蘚60-68重量份 咖坡林4-8重量份 尖葉石松堿2-3重量份 藜蘆瑟文1-2重量份。

優(yōu)選的用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，是由如下重量份的原料藥組成：

三爪金龍88重量份 小金發(fā)蘚64重量份 咖坡林6重量份 尖葉石松堿2.5重量份 藜蘆瑟文1.5重量份。

一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，其特征在于藥物組合物可以采用制劑學(xué)的常規(guī)方法制備成片劑或膠囊劑或滴丸。

一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，其特征在于藥物組合物與化學(xué)藥或中藥組成的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物。

一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的制備方法，其特征在于按如下步驟制備：

原料藥的組成和重量份為：三爪金龍85-90重量份 小金發(fā)蘚60-68重量份 咖坡林4-8重量份 尖葉石松堿2-3重量份 藜蘆瑟文1-2重量份；

制備方法：

（1）按原料藥配比取三爪金龍、小金發(fā)蘚、咖坡林、尖葉石松堿、藜蘆瑟文，混勻，用重量百分比濃度28%乙醇作為溶劑，30℃溫浸提取，提取次數(shù)為32次，每次提取時間為43小時，每次溶劑用量為原料藥總重量的79倍，濾過，得藥渣A和提取液A，提取液A回收乙醇，濃縮至相對密度1.08，濾過，藥液通過YWD-11大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度36%乙醇溶液洗脫YWD-11大孔吸附樹脂柱，收集重量百分比濃度36%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物A；

（2）取步驟（1）藥渣A，用重量百分比濃度63%乙醇作為溶劑，加熱回流提取13次，每次提取時間為0.2小時，每次溶劑用量為藥渣A重量的85倍，濾過，得藥渣B和提取液B，提取液B回收乙醇，濃縮至相對密度1.13，濾過，藥液通過HZ-802大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度79%乙醇溶液洗脫HZ-802大孔吸附樹脂柱，收集重量百分比濃度79%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物B；

（3）將提取物A和提取物B混勻，即得藥物組合物。

優(yōu)選的一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的制備方法，其特征在于按如下步驟制備：

原料藥的組成和重量份為：三爪金龍88重量份 小金發(fā)蘚64重量份 咖坡林6重量份 尖葉石松堿2.5重量份 藜蘆瑟文1.5重量份；

制備方法：

（1）按原料藥配比取三爪金龍、小金發(fā)蘚、咖坡林、尖葉石松堿、藜蘆瑟文，混勻，用重量百分比濃度28%乙醇作為溶劑，30℃溫浸提取，提取次數(shù)為32次，每次提取時間為43小時，每次溶劑用量為原料藥總重量的79倍，濾過，得藥渣A和提取液A，提取液A回收乙醇，濃縮至相對密度1.08，濾過，藥液通過YWD-11大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度36%乙醇溶液洗脫YWD-11大孔吸附樹脂柱，收集重量百分比濃度36%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物A；

（2）取步驟（1）藥渣A，用重量百分比濃度63%乙醇作為溶劑，加熱回流提取13次，每次提取時間為0.2小時，每次溶劑用量為藥渣A重量的85倍，濾過，得藥渣B和提取液B，提取液B回收乙醇，濃縮至相對密度1.13，濾過，藥液通過HZ-802大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度79%乙醇溶液洗脫HZ-802大孔吸附樹脂柱，收集重量百分比濃度79%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物B；

（3）將提取物A和提取物B混勻，即得藥物組合物。

一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的制備方法，其特征在于藥物組合物可以采用制劑學(xué)的常規(guī)方法制備成片劑或膠囊劑或滴丸。

一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的制備方法，其特征在于藥物組合物與化學(xué)藥或中藥組成治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物。

藥物組合物治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎療效顯著。

具體實施方式

實施例1：治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物及其制備方法

治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的原料藥的組成和重量份為：三爪金龍88g 小金發(fā)蘚64g 咖坡林6g 尖葉石松堿2.5g 藜蘆瑟文1.5g；

制備方法：

（1）按原料藥配比取三爪金龍、小金發(fā)蘚、咖坡林、尖葉石松堿、藜蘆瑟文，混勻，用重量百分比濃度28%乙醇作為溶劑，30℃溫浸提取，提取次數(shù)為32次，每次提取時間為43小時，每次溶劑用量為原料藥總重量的79倍，濾過，得藥渣A和提取液A，提取液A回收乙醇，濃縮至相對密度1.08，濾過，藥液通過YWD-11大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度36%乙醇溶液洗脫YWD-11大孔吸附樹脂柱，收集重量百分比濃度36%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物A；

（2）取步驟（1）藥渣A，用重量百分比濃度63%乙醇作為溶劑，加熱回流提取13次，每次提取時間為0.2小時，每次溶劑用量為藥渣A重量的85倍，濾過，得藥渣B和提取液B，提取液B回收乙醇，濃縮至相對密度1.13，濾過，藥液通過HZ-802大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度79%乙醇溶液洗脫HZ-802大孔吸附樹脂柱，收集重量百分比濃度79%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物B；

（3）將提取物A和提取物B混勻，即得藥物組合物。

實施例2：治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物及其制備方法

治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的原料藥的組成和重量份為：三爪金龍85g 小金發(fā)蘚68g 咖坡林4g 尖葉石松堿3g 藜蘆瑟文1g；

制備方法：

（1）按原料藥配比取三爪金龍、小金發(fā)蘚、咖坡林、尖葉石松堿、藜蘆瑟文，混勻，用重量百分比濃度28%乙醇作為溶劑，30℃溫浸提取，提取次數(shù)為32次，每次提取時間為43小時，每次溶劑用量為原料藥總重量的79倍，濾過，得藥渣A和提取液A，提取液A回收乙醇，濃縮至相對密度1.08，濾過，藥液通過YWD-11大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度36%乙醇溶液洗脫YWD-11大孔吸附樹脂柱，收集重量百分比濃度36%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物A；

（2）取步驟（1）藥渣A，用重量百分比濃度63%乙醇作為溶劑，加熱回流提取13次，每次提取時間為0.2小時，每次溶劑用量為藥渣A重量的85倍，濾過，得藥渣B和提取液B，提取液B回收乙醇，濃縮至相對密度1.13，濾過，藥液通過HZ-802大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度79%乙醇溶液洗脫HZ-802大孔吸附樹脂柱，收集重量百分比濃度79%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物B；

（3）將提取物A和提取物B混勻，即得藥物組合物。

實施例3：治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物及其制備方法

治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的原料藥的組成和重量份為：三爪金龍90g 小金發(fā)蘚60g 咖坡林8g 尖葉石松堿2g 藜蘆瑟文2g；

制備方法：

（1）按原料藥配比取三爪金龍、小金發(fā)蘚、咖坡林、尖葉石松堿、藜蘆瑟文，混勻，用重量百分比濃度28%乙醇作為溶劑，30℃溫浸提取，提取次數(shù)為32次，每次提取時間為43小時，每次溶劑用量為原料藥總重量的79倍，濾過，得藥渣A和提取液A，提取液A回收乙醇，濃縮至相對密度1.08，濾過，藥液通過YWD-11大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度36%乙醇溶液洗脫YWD-11大孔吸附樹脂柱，收集重量百分比濃度36%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物A；

（2）取步驟（1）藥渣A，用重量百分比濃度63%乙醇作為溶劑，加熱回流提取13次，每次提取時間為0.2小時，每次溶劑用量為藥渣A重量的85倍，濾過，得藥渣B和提取液B，提取液B回收乙醇，濃縮至相對密度1.13，濾過，藥液通過HZ-802大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度79%乙醇溶液洗脫HZ-802大孔吸附樹脂柱，收集重量百分比濃度79%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物B；

（3）將提取物A和提取物B混勻，即得藥物組合物。

實施例4：片劑的制備

取實施例1藥物組合物354g，加入淀粉410g，混勻，制粒，干燥，加微晶纖維素150g，硬脂酸鎂20g，混勻，壓制成4500片， 即得藥物組合物片劑。

實施例5：膠囊的制備

取實施例2藥物組合物170g，加入淀粉263g，混勻，制粒，干燥，整粒，加入適量硬脂酸鎂，混勻，裝膠囊1200粒，即得藥物組合物膠囊。

實施例6：滴丸的制備

稱取聚乙二醇 6000 250g水浴(80℃)加熱煮熔，加入實施例3藥物組合物11.3 g，充分?jǐn)嚢杈鶆颍砸后w石蠟為冷卻劑，置玻璃管（4*80cm）中，冷卻溫度為-5℃，滴口內(nèi)外徑為7.0/2.0(mm/mm)，滴口距液面為2.5cm，滴速以每分56滴為最佳條件，用棉布吸干滴丸表面的冷凝劑，即得藥物組合物滴丸。

實施例7：治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物

治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的原料藥的組成和重量份為：

咖坡林 30重量份 尖葉石松堿2重量份 藜蘆瑟文4重量份。

實施例8：治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物

治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的原料藥的組成和重量份為：

咖坡林2重量份 尖葉石松堿10重量份 藜蘆瑟文1重量份。

實施例9：治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物

治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的原料藥的組成和重量份為：

咖坡林10重量份 尖葉石松堿12重量份 藜蘆瑟文3重量份。

實驗例1：治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的試驗研究

1 材料與方法

1.1 藥物

甲氨蝶呤( MTX) 片由上海醫(yī)藥 (集團) 有限公司信誼制藥總廠生產(chǎn)，批號: 090634；藥物組合物(實施例1藥物組合物) 批號091104。

1.2 主要試劑與儀器

牛Ⅱ型膠原、弗氏完全佐劑均購自美國 Sigma 公司；Trizol 試劑盒購自廣州合達生物科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq( Perfect Real Time)試劑盒購自日本 TaKaRa 公司；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自美國 Invitrogen公司；LDZS-2 型離心機為中國北京醫(yī)用儀器廠產(chǎn)品；YLS-7B足趾容積測量儀為中國成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品；Giotto Image 高頻鉬靶數(shù)字化乳腺機為意大利 IMS 公司產(chǎn)品；7500 Real-time PCR System 擴增儀為美國 ABI 公司產(chǎn)品；MR5000 型酶標(biāo)儀為美國Dyntech 公司產(chǎn)品；脫水機、包埋機、切片機、染色機、LX70倒置顯微鏡均為德國Leica 公司產(chǎn)品。

1.3 動物及分組

SPF 級 Wistar大鼠 54只，雄性，體質(zhì)量(90±10)g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號: SCXK (粵)2006-0015。隨機分為 6 組，即正常組，模型組，MTX 組，藥物組合物低、中、高劑量組，每組 9 只。

1.4 抗原注射液制備

電子天平稱取牛Ⅱ型膠原25 mg，放入試管，用 0.1mol/L醋酸5 mL 逐漸加入并攪拌溶解。加入等量的弗氏完全佐劑混合研磨，制成濃度為2 mg/mL的抗原注射液，于冰浴中充分乳化，封裝備用。

1.5 造模與給藥

正常組大鼠尾根注射生理鹽水 0.1mL/只。其他組大鼠用體積分?jǐn)?shù) 75%酒精消毒尾根部，將配制好的抗原注射液按膠原蛋白每只0.2 mg 劑量皮下注射于距大鼠尾根部 1cm 處。造模當(dāng)天開始灌胃給藥，正常組、模型組每日給予生理鹽水10mL/kg，MTX 組每周給予 MTX 片0.625mg/kg，藥物組合物低、中、高劑量組分別給予藥物組合物0.2、0.4、0.8g/kg。全部動物喂藥36 d。末次給藥 24 h 后，用 100mg/L水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈無菌采血3 mL，處死。取大鼠左踝關(guān)節(jié)，剝?nèi)テっ泽w積分?jǐn)?shù) 10% 甲醛固定，常規(guī)切片，蘇木精—伊紅(HE)染色，光鏡下做組織病理學(xué)檢查。取大鼠右膝關(guān)節(jié)，剝?nèi)テっ蜷_膝關(guān)節(jié)腔，完整剝離滑膜組織，冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 大鼠一般情況及足腫

觀察大鼠的毛色、活動、飲食、排便、體質(zhì)量變化等。以容積法采用足腫容積測量儀每 3d 測 1 次大鼠足部容積變化以判斷大鼠足腫情況。

1.6.2 病理觀察

HE 染色關(guān)節(jié)滑膜組織病理分級計分標(biāo)準(zhǔn): ①關(guān)節(jié)滑膜上皮未見增生，滑膜間質(zhì)內(nèi)未見炎細(xì)胞浸潤 (－)，計0分；②關(guān)節(jié)滑膜上皮增生不明顯，間質(zhì)內(nèi)少量慢性炎性細(xì)胞浸潤(+)，計1分；③關(guān)節(jié)滑膜上皮細(xì)胞增生不明顯，間質(zhì)內(nèi)小血管擴張、充血，較多慢性炎性細(xì)胞浸潤(+ +)，計2 分；④關(guān)節(jié)滑膜上皮細(xì)胞增生成多層，間質(zhì)內(nèi)有密集的慢性炎性細(xì)胞浸潤 (+ + +)，計3分。HE染色關(guān)節(jié)軟骨病理分級計分標(biāo)準(zhǔn): ①關(guān)節(jié)軟骨面光滑，軟骨細(xì)胞未見增生、變性(－)，計 0分； ②關(guān)節(jié)軟骨局灶性變性，軟骨陷窩內(nèi)細(xì)胞缺失(+)，計1 分；③關(guān)節(jié)軟骨脫失，被長入的血管豁(肉芽腫) 取代(+ +)，計 2 分；④關(guān)節(jié)腔面軟骨及肉芽組織增生，關(guān)節(jié)腔閉鎖 (+ + +)，計3 分。

1.6.3 血清 IL-8 含量檢測

大鼠腹主動脈無菌采血3mL，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血清IL-8 含量。

1.6.4 關(guān)節(jié)滑膜組織 IL-8 mRNA 基因表達的檢測

采用實時熒光定量 PCR 法檢測大鼠滑膜組織IL-8mRNA 表達。取凍存關(guān)節(jié)滑膜組織，液氮研磨，取0.1g 組織直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此3 次進行樣本制備。按Trizol 試劑盒提供方法提取總 RNA，采用紫外分光光度計測定其 D 值，以D260/D280確定 RNA 的純度。IL-8 的PCR產(chǎn)物片段為 385 bp。β-Actin 的 PCR 產(chǎn)物片段為 570 bp。引物序列: IL-8上游: 5'-ATGACTTCCAACCTGGCCGTG-3'，下游: 5'-TTCTCAGCCCTCTTCAAAAAC-3'。 采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，進行 cDNA 的合成。反應(yīng)體系(25μL): 第1鏈cDNA 1μL，2×SYBR Green Mix 5 mol/L 12.5μL，上下游引物(10μm)各1μL，DEPC-free水9.5μL。擴增件: 95℃預(yù)變性 30 s，然后 95℃、5s，60℃、30s，40個循環(huán)。擴增結(jié)束后由儀器內(nèi)置軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線。采用熒光定量 PCR 分析軟件對結(jié)果進行分析。

1.7 統(tǒng)計方法

采用 SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)描述，多組比較采用方差分析法，多組間兩兩比較采用Bonferroni 法分析。對于等級資料多組間比較采用秩和檢驗進行分析，多組間兩兩比較采用 Mann-Whituey U 檢驗，對檢驗水準(zhǔn)根據(jù)比較次數(shù)進行校正。

2 結(jié)果

2.1 各組對 CIA 大鼠一般情況的影響

造模初期，各組大鼠表現(xiàn)不愛活動、倦怠、食欲減退、注射部位發(fā)紅。造模后，各組大鼠后肢從足趾部分開始，逐漸出現(xiàn)紅、腫等癥狀，皮毛松散、稀疏，易激惹，體質(zhì)量增長減慢。造模前，各組大鼠體質(zhì)量無明顯差異，至造模第 8 天，個別大鼠出現(xiàn)足腫現(xiàn)象，但未影響其進食，故體質(zhì)量未見明顯差異。造模第 14 天后，除正常組外，各組大鼠陸續(xù)開始發(fā)病，影響其進食，大鼠體質(zhì)量出現(xiàn)增長減慢，各組間大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。至第27 天，因藥物干預(yù)病情得以控制，飲食、動作逐漸恢復(fù)，體質(zhì)量也相應(yīng)有所增加，各組間大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 各組對 CIA 大鼠足腫脹度的影響

結(jié)果顯示，造模后，模型組的足腫脹度呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，第 19天起平均腫脹程度顯著高于正常組 (均P＜0.05)。MTX 組和藥物組合物低、中、高劑量組的足腫脹度在第 31 天后的不同時間段均顯著降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。

2.3 各組對 CIA 大鼠關(guān)節(jié)滑膜與軟骨病理變化的影響

RA 早期病變部位滑膜炎性細(xì)胞浸潤，過度增生、增厚，軟骨面破壞是造成關(guān)節(jié)損害的主要病理基礎(chǔ)之一。結(jié)果顯示: 正常組大鼠關(guān)節(jié)滑膜上皮未見增生，滑膜間質(zhì)內(nèi)未見炎細(xì)胞浸潤； 關(guān)節(jié)軟骨面光滑，軟骨細(xì)胞未見增生、變性。模型組關(guān)節(jié)滑膜上皮細(xì)胞增生成多層，間質(zhì)內(nèi)有密集的慢性炎性細(xì)胞浸潤； 關(guān)節(jié)腔面軟骨及肉芽組織增生，關(guān)節(jié)腔閉鎖。MTX 組及藥物組合物低、中、高劑量組大鼠關(guān)節(jié)滑膜上皮細(xì)胞增生不明顯，間質(zhì)內(nèi)小血管擴張、充血，較多慢性炎性細(xì)胞浸潤； 關(guān)節(jié)軟骨局灶性變性，軟骨陷窩內(nèi)細(xì)胞缺失，甚則被長入的血管翳取代。各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜、軟骨病理情況的統(tǒng)計結(jié)果顯示: 模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜及軟骨組織病理積分均顯著升高 (P＜0.05)，各給藥組均可顯著降低滑膜病理積分(P＜0.05 或P＜0.01)，中藥高劑量組可顯著降低軟骨病理積分值(P＜0.01)。

2.4 各組對 CIA 大鼠外周血IL-8水平的影響

結(jié)果顯示: 模型組大鼠血清 IL-8 水平顯著高于正常組(P＜0.0l)。藥物組合物高劑量組大鼠血清IL-8 水平顯著低于模型組大鼠(P＜0.05)。而MTX 組，藥物組合物低、中劑量組大鼠血清 IL-8 水平雖有下降，但與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.5 各組對 CIA 大鼠滑膜組織 IL-8 mRNA 表達的影響

結(jié)果顯示: 模型組大鼠IL-8 mRNA 表達顯著升高 (P＜0.05)。MTX 組，藥物組合物低、中、高劑量組大鼠 IL-8 mRNA 表達均顯著低于模型組大鼠 (P＜0.05)，而藥物組合物高劑量組大鼠 IL-8 mRNA表達顯著低于 MTX 組及藥物組合物低、中劑量組 (P＜0.05)。