本發明屬于水凝膠技術領域，尤其涉及一種包含表皮干細胞條件培養基的溫敏水凝膠及其制備方法。

背景技術：

表皮干細胞(epidermal stem cell,EpSCs)位于皮膚表皮基底層，是人體最大的干細胞庫。在沒有毛發的部位EpSCs位于真皮乳頭頂部相連的基底層；有毛發的皮膚則位于表皮的基底層。EpSCs的表面標志物包括整合素、核蛋白P63和角蛋白等。皮膚EpSCs具有以下優點：取材損傷性小；細胞易于分離；短期內能夠大量擴增。在組織工程中用于構建皮膚替代物^[5]，在醫療美容方面，也可用于抗衰老皮膚再生。在皮膚損傷修復中，EpSCs可以主動遷移參與創面修復，也可以通過分泌多種細胞因子促進傷口愈合。目前已發現EpSCs可分泌數十種與創傷修復過程密切相關的生長因子，其中較為重要的有血管內皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、轉化生長因子-β(TGF-β)、成纖維細胞生長因子(FGF)和白介素-1/6/8等，可促進角質形成細胞及成纖維細胞增殖，刺激表皮增生，并維持局部免疫微環境；但細胞因子在液態環境中半衰期短，如何穩定并延長其生物學功能成為難點。

潮濕環境可以給燒燙傷的創面提供足夠的水分，有利于細胞因子等水溶性物質的釋放和發揮作用，使傷口疼痛減輕、炎癥擴散消退、滲出物減少、減少創面微生物生長，并能防止神經末梢外露和死亡，減少更換敷料時對傷口表面的損傷；有利于吞噬細胞發揮其吞噬功能，其中水凝膠敷料適用于各種類型的燒傷創面，可以有效緩解疼痛，加速傷口愈合速度。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種溫敏水凝膠，其既能延長細胞因子在液態環境中的半衰期，穩定并延長其生物學功能，又可以給燒燙傷的創面提供足夠的水分，有利于細胞因子等水溶性物質的釋放和發揮作用，進而促進傷口修復。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：一種溫敏水凝膠，所述溫敏水凝膠的原料包含細胞因子活性穩定劑、表皮干細胞條件培養基和膠原蛋白交聯液。

本發明所述溫敏水凝膠很好地滿足了兩個利于皮膚創面修復的條件：首先，本發明獨創性地將細胞因子穩定劑加入到表皮干細胞(epidermal stem cell,EpSCs)條件培養基中，穩定EpSCs分泌的多種細胞因子，延長其半衰期，這些細胞因子對創傷修復起關鍵作用，它們可通過介導和調控皮膚損傷修復過程中的血管化、纖維化、細胞外基質的分泌和再上皮化等過程，從而促進創面新生血管的形成、肉芽組織的形成、再上皮化及附件的再生，進而促進傷口愈合；再者，溫敏水凝膠是指具有溫敏特性，可以隨著環境溫度改變而在液態和固態之間相互轉變，即可以在較低溫度下制備成液態水凝膠，通過注射或涂抹的方法將其施于病患部位，后由于溫度升高(體溫)而轉換為固態，在原位成膠。因此，本發明所述溫敏水凝膠具有操作簡單、塑型隨意、原位成膠等優點，可以充分的覆蓋創面，與創面緊密貼合，防止創面水分蒸發，可以有效地維持傷口處的濕潤環境。

優選的，所述溫敏水凝膠，所述細胞因子活性穩定劑、表皮干細胞條件培養基和膠原蛋白交聯液的體積比為：1:2:1。

優選的，所述細胞因子活性穩定劑由組分A和組分B組成，所述組分A包含殼聚糖、甘露醇、聚乙二醇、透明質酸和海藻酸鈉，所述組分B包含β-甘油磷酸鈉和人白蛋白。

優選的，所述組分A中，殼聚糖的濃度為1.5～2.5％(W/V)，甘露醇的濃度為0.1～0.5％(W/V)、聚乙二醇的濃度為0.5～1％(W/V)，透明質酸的濃度為0.5～1％(W/V)，海藻酸鈉的濃度為3～5％(W/V)。若無特別說明，本文中涉及的溶液中物質的濃度(W/V)的計算公式為：(物質的質量/溶液的體積)×100％，其中物質的質量/溶液的體積的單位為g/m³或mg/L；例如，此處的殼聚糖的濃度是通過(殼聚糖的質量/組分A的體積)×100％得到的。

優選的，所述組分B中，所述人白蛋白的濃度為0.5～1％(W/V)，所述β-甘油磷酸鈉的濃度為40～60％(W/V)。

優選的，所述組分A中的殼聚糖的濃度為2％(W/V)，甘露醇的濃度為0.25％(W/V)，聚乙二醇的濃度為1％(W/V)，透明質酸的濃度為0.5％(W/V)，海藻酸鈉的濃度為4％(W/V)。

優選的，所述透明質酸的分子量為120-140萬。透明質酸，又稱玻尿酸(HA)，廣泛存在于人皮膚、關節液及眼玻璃體中，可減少手術并發癥并促進傷口愈合用，可形成透氣薄膜。

優選的，所述細胞因子活性穩定劑通過在冰浴條件下將所述組分A與組分B按體積比4～7：1的比例充分混合制得。

優選的，所述細胞因子活性穩定劑通過在冰浴條件下將所述組分A與組分B按體積比5：1的比例充分混合制得。

優選的，所述組分A的制備方法為：(1)向0.1mol/L的鹽酸溶液中加入殼聚糖粉末，得到殼聚糖溶液，其中所述殼聚糖的濃度為1.5～2.5％(W/V)；(2)向步驟(1)所得的殼聚糖溶液中加入甘露醇、聚乙二醇、透明質酸和海藻酸鈉，其中所述甘露醇的終濃度為0.1～0.5％(W/V)、聚乙二醇的終濃度為0.5～1％(W/V)、透明質酸的終濃度為0.1～0.5％(W/V)、海藻酸鈉的終濃度為3～5％(W/V)；(3)使用1M的NaOH水溶液調整pH值為6～6.5，高壓蒸汽滅菌，即為所述組分A。

優選的，所述組分B的制備方法為：將β-甘油磷酸鈉粉末溶于三蒸水中，其中所述β-甘油磷酸鈉的終濃度為40～60％(W/V)，然后加入人白蛋白，所述人白蛋白的終濃度為0.5～1％(W/V)，最后經0.22μm濾網過濾除菌，即為所述組分B。

優選的，所述組分B中人白蛋白的濃度為0.75％(W/V)。

優選的，所述表皮干細胞條件培養基的制備方法為：首先分離皮膚樣本表皮部分，利用0.25％胰蛋白酶溶液消化表皮，然后加入表皮干細胞培養基培養，則第3～5代的表皮干細胞培養基即為表皮干細胞條件培養基。

優選的，所述表皮干細胞培養基為：采用K-SFM培養基作為基礎培養基，其中加入人表皮生長因子，使其終濃度為5-20ng/ml；加入成纖維細胞生長因子和類胰島素生長因子-1，使其終濃度均為1.5-5ng/ml；加入牛垂體提取物，使其終濃度為20-40μg/ml；加入CaCl₂，使其終濃度為0.01～0.1mM；加入氫化可的松，使其終濃度為0.2～1μg/mL；加入青霉素和鏈霉素，使其終濃度均為50～150U/ml。

優選的，所述表皮干細胞條件培養基的制備方法具體為：

a.清洗及表皮分離：將新鮮手術取下的正常人皮片用含有100U/mL青霉素和鏈霉素的生理鹽水沖洗8～10次，剪成約5mm×5mm的皮片，去除皮下脂肪組織后將分離表皮和真皮，得到表皮組織后，再次剪成1mm×1mm的碎片；

b.表皮的胰酶消化及培養：將表皮組織加入0.25％胰蛋白酶-PBS溶液消化15～-30min，加入EpSCs原代培養基終止消化，吹打后100μm濾網過濾；濾液經1000r/min離心10min，細胞沉淀加入EpSCs原代培養基制成2～4×10⁵個/ml的單細胞懸液，接種于預包被IV型膠原的培養皿中，37℃靜置10min；吸棄未貼壁細胞，用PBS輕柔漂洗培養皿一次，再次加入EpSCs原代培養基，置37℃，5％CO₂和100％濕度的黑暗環境培養；3日后更換為EpSCs繼代培養基，繼續培養，每3～4天更換新鮮EpSCs繼代培養基一次，

c.表皮干細胞條件培養基的制備：待貼壁細胞生長融合率達到80～90％時，用0.25％胰蛋白酶-0.1％EDTA/PBS溶液消化，按照1：4的比例傳代，傳到第3-5代可用于檢測或制備條件培養基：待表皮干細胞貼壁生長融合率達到70～80％時，全量換液為新鮮的EpSCs繼代培養基，24～36h后收集培養基，3000r/min離心30min去除細胞碎片，0.22μm濾膜過濾除菌后備用。

優選的，所述步驟b中的EpSCs原代培養基的制備方法為：向K-SFM培養基中加入人表皮生長因子(EGF)，使其終濃度為10ng/ml；加入成纖維細胞生長因子(FGF)和類胰島素生長因子-1(IGF-1)，使其終濃度均為2ng/ml；加入牛垂體提取物(BPE)，使其終濃度為30μg/ml；加入CaCl₂，使其終濃度為0.05mM；加入氫化可的松，使其終濃度為0.5μg/mL；加入青-鏈霉素，使其終濃度均為100U/ml。

優選的，所述步驟b和步驟c中的EpSCs繼代培養基的制備方法為：向K-SFM培養基中加入人表皮生長因子(EGF)，使其終濃度為2ng/ml；加入牛垂體提取物(BPE)，使其終濃度為20μg/ml；加入CaCl₂，使其終濃度為0.05mM；加入氫化可的松，使其終濃度為0.5μg/mL；加入青-鏈霉素，使其終濃度均為100U/ml。

優選的，所述步驟b中預包被IV型膠原的培養皿采用如下方法制備：IV型膠原溶于0.1％的醋酸溶液至終濃度為100mg/L，濾過除菌，4℃保存備用；將配制好的IV型膠原溶液2ml鋪于25cm²培養瓶中，6孔板每孔使用30ul包被。將包被好的培養板置4℃過夜，棄上清，使用無菌PBS漂洗3次，去除多余膠原，4℃干燥箱烘干，紫外線照射過夜，得到預包被IV型膠原的培養皿。

優選的，所述膠原蛋白交聯液包含膠原蛋白和水，其中膠原蛋白的濃度為0.5～2mg/mL。

優選的，所述膠原蛋白為人臍帶膠原蛋白。人臍帶膠原蛋白(CO)是臍帶結締組織的主要成分，具有來源廣泛、細胞親和力高、膠聯度可控及可降解性等優點。

優選的，所述膠原蛋白的濃度為1mg/mL。

優選的，所述膠原蛋白交聯液的制備方法為：在冰水浴中，將膠原蛋白粉末溶于三蒸水中配制膠原蛋白交聯液，所述膠原蛋白終濃度為0.5～2mg/mL，pH值為7.0～7.2，經0.22μm濾網過濾除菌，即得所述膠原蛋白交聯液。

另外，本發明提供一種所述溫敏水凝膠的制備方法，所述方法包括以下步驟：將所述細胞因子活性穩定劑、表皮干細胞條件培養基和膠原蛋白交聯液在冰浴攪拌條件下混合，即得所述溫敏水凝膠。

具體地，所述溫敏水凝膠的制備方法包括以下步驟：

a.清洗及表皮分離：將新鮮手術取下的正常人皮片用含有100U/mL青霉素和鏈霉素的生理鹽水沖洗8～10次，剪成約5mm×5mm的皮片，去除皮下脂肪組織后將分離表皮和真皮，得到表皮組織后，再次剪成1mm×1mm的碎片。

b.表皮的胰酶消化及培養：將表皮組織加入0.25％胰蛋白酶-PBS溶液消化15～30min，加入EpSCs原代培養基終止消化，吹打后100μm濾網過濾。濾液經1000r/min離心10min，細胞沉淀加入EpSCs原代培養基制成2～4×10⁵個/ml的單細胞懸液，接種于預包被IV型膠原的培養皿中，37℃靜置10min；吸棄未貼壁細胞，用PBS輕柔漂洗培養皿一次，再次加入EpSCs原代培養基，置37℃，5％CO₂和100％濕度的黑暗環境培養；3日后更換為EpSCs繼代培養基，繼續培養，每3～4天更換新鮮EpSCs繼代培養基一次。

c.表皮干細胞條件培養基的制備：待貼壁細胞生長融合率達到80～90％時，用0.25％胰蛋白酶-0.1％EDTA/PBS溶液消化，按照1：4的比例傳代，傳到第3-5代可用于檢測或制備條件培養基：待表皮干細胞貼壁生長融合率達到70～80％時，全量換液為新鮮的EpSCs繼代培養基，24～36h后收集培養基，3000r/min離心30min去除細胞碎片，0.22μm濾膜過濾除菌后備用；

d.細胞因子活性穩定劑的配制：將殼聚糖粉末溶解在0.1mol/L的鹽酸溶液中，制成1.5～2.5％(W/V)的殼聚糖溶液，加入甘露醇粉末使其終濃度為0.1～0.5％，加入聚乙二醇粉末使其終濃度為0.5～1％，加入120-140萬分子量的大分子透明質酸使其終濃度為0.5～1％(W/V)，加入海藻酸鈉使其終濃度為3～5％(W/V)，最后使用1M的NaOH水溶液調整pH值為6～6.5，高壓蒸汽滅菌備用為A液；將β-甘油磷酸鈉粉末溶于三蒸水中配成50％(W/V)溶液，再加入人白蛋白溶液使其終濃度為0.5～1％(W/V)，經0.22μm濾網過濾除菌為B液；在冰浴條件下將制備的A液和B液按體積比5：1比例充分混合后得到細胞因子活性穩定劑，

e.膠原蛋白交聯液的配制：在冰水浴中，將臍帶膠原蛋白粉末溶于三蒸水中配成制備0.5～2mg/mL的臍帶膠原蛋白蛋白溶液，調整pH值至7.0～7.2，經0.22μm濾網過濾除菌。

f.在冰浴攪拌條件下，將細胞因子活性穩定劑、表皮干細胞條件培養基與膠原蛋白交聯液以1:2:1的體積比混合，制成表皮干細胞條件培養基溫敏水凝膠，此水凝膠在37℃溫箱放置20分鐘即可形成固態的凝膠狀。

上述所有操作均在無菌條件下進行。

本發明的有益效果在于：本發明所述溫敏水凝膠在37℃放置20分鐘即可形成固態的凝膠狀，可被機體吸收，消除了揭除敷料時造成的疼痛；可以非特異性免疫反應增強肌體的免疫功能、促進成纖維細胞增殖、利于新生皮膚表觀和功能恢復，使傷口得到高質量愈合。另外，本發明所述制備方法具有快速、高效、方法簡便、所得溫敏水凝膠中細胞因子活性保持好，修復作用強、組織相容性好，具備了應用到臨床上的基本條件。

附圖說明

圖1是本發明實施例1中表皮干細胞形態、表型檢測及特征蛋白檢測圖，其中A為表皮干細胞形態圖，B為表皮干細胞和角質形成細胞中CK19和Intergrin-β1蛋白的表達情況，C為角質化細胞中α6-intergrin和CD71蛋白的表達情況，D為表皮干細胞中α6-intergrin和CD71蛋白的表達情況；

圖2是本發明實施例2中所制備的溫敏水凝膠在25℃與37℃條件下的狀態圖，其中A為溫敏水凝膠在25℃下呈現液態，B為溫敏水凝膠在37℃下呈現固態；

圖3是本發明實施例3中溫敏水凝膠對細胞因子活性保持效果的柱形圖；

圖4是本發明實施例4中溫敏水凝膠對小鼠皮膚燙傷實驗治療愈合效果示意圖。

具體實施方式

為更好的說明本發明的目的、技術方案和優點，下面將結合具體實施例及附圖對本發明作進一步說明。

實施例1表皮干細胞EpSCs的分離與培養

實驗方法：

1)、將新鮮手術取下的正常人皮片用含有100U/mL青霉素和鏈霉素的生理鹽水沖洗10次，剪成約5mm×5mm的皮片，去除皮下脂肪組織后將分離表皮和真皮，得到表皮組織后，再次剪成1mm×1mm的碎片；

2)、在表皮碎片中加入0.25％胰蛋白酶-PBS溶液消化30min，加入EpSCs原代培養基終止消化，吹打后100μm濾網過濾；濾液經1000r/min離心10min，細胞沉淀加入EpSCs原代培養基(K-SFM培養基，含10ng/ml的EGF、2ng/ml的FGF和IGF-1、30μg/ml的BPE、0.05mM的CaCl₂、0.5μg/mL的氫化可的松，100U/ml的青-鏈霉素)制成3×10⁵/ml的單細胞懸液，接種于預包被IV型膠原的培養皿中，37℃靜置10min；吸棄未貼壁細胞，用PBS輕柔漂洗培養皿一次，再次加入EpSCs原代培養基，置37℃，5％CO2和100％濕度的黑暗環境培養；3日后更換為EpSCs繼代培養基(K-SFM培養基，含2ng/ml EGF、20μg/ml BPE、0.05mMCaCl2、0.5μg/mL氫化可的松，100U/ml青-鏈霉素)，繼續培養，每3～4天更換新鮮EpSCs繼代培養基一次；

3)、將步驟2)所得細胞用倒置顯微鏡觀察照相，使用流式細胞術檢測EpSCs表面標志物α6-intergrin和CD71的表達情況；使用western-blot檢測，檢測角質形成細胞及表皮干細胞中CK19、intergrin-β1的蛋白水平。

實驗結果：鏡檢結果如圖1A所示，可見細胞為扁平多角形，形成小克隆呈鋪路石樣成片生長，符合EpSC的形態生長特點；western-blot檢測結果如圖1B所示，顯示表皮干細胞中CK19和Intergrin-β1蛋白表達均高于角質形成細胞(keratinocyte)；流式細胞術檢測結果如圖1C和圖1D所示，證明表皮干細胞高表達EpSC標志物α6-intergrin，低表達角質化細胞標志物CD71。

實施例2溫敏水凝膠的制備

(1)、表皮干細胞條件培養基的制備：取培養第4代生長良好的EpSC貼壁細胞，待其融合率達到70～80％時，全量換液為新鮮的EpSCs繼代培養基，24～36h后收集培養基，3000r/min離心30min去除細胞碎片，0.22μm濾膜過濾除菌后備用，為EpSC條件培養基；

(2)、細胞因子活性穩定劑的制備：將殼聚糖粉末溶解在0.1mol/L的鹽酸溶液中，制成2％(W/V)的殼聚糖溶液，再加入甘露醇粉末使其終濃度為0.25％，再加入聚乙二醇粉末使其終濃度為1％，再加入120-140萬分子量的大分子透明質酸使其終濃度為0.5％(W/V)，再加入海藻酸鈉使其終濃度為4％(W/V)，最后使用1M的NaOH水溶液調整pH值為6.15，高壓蒸汽滅菌備用為A液；將β-甘油磷酸鈉粉末溶于三蒸水中配成50％(W/W)溶液，再加入40％的人白蛋白溶液使其終濃度為0.75％(W/V)，經0.22μm濾網過濾除菌為B液；在冰浴條件下將制備的A液和B液按體積比5：1比例充分混合后得到細胞因子活性穩定劑；

(3)、膠原蛋白交聯液的制備：在冰水浴中，將臍帶膠原蛋白粉末溶于三蒸水中配成制備1mg/mL的臍帶膠原蛋白蛋白溶液，調整pH值至7.2，經0.22μm濾網過濾除菌；

(4)、在冰浴攪拌條件下，將表皮干細胞條件培養基、細胞因子活性穩定劑、膠原蛋白交聯液以1:2:1的體積比混合，即得溫敏水凝膠。

本發明所述溫敏水凝膠在37℃溫箱放置20分鐘即可形成固態的凝膠狀，其結果如圖2所示，溫敏水凝膠在25℃下呈現液態(圖2A)，在37℃下呈現固態(圖2B)。

實施例3溫敏水凝膠對細胞因子活性保持效果

(1)、將實施例2所得溫敏水凝膠置于4℃環境中，分別于第0、7、14、21天取一份，擠壓得浸出液，采用ELISA法檢測VEGF、EGF、IGF-1的含量；

(2)、將實施例2步驟(1)中得到的EpSC條件培養基稀釋一倍，置于4℃環境中，分別于第0、7、14、21天取一份，采用ELISA法檢測VEGF、EGF、IGF-1的含量；

檢測結果如圖3所示，可見與條件培養基相比，本發明所述溫敏水凝膠能在21天期間內，更好地保持細胞因子VEGF、EGF、IGF-1的濃度。

實施例4溫敏水凝膠對小鼠皮膚燙傷實驗治療愈合效果

實驗方法：首先構建小鼠深II度皮膚燙傷模型，每只老鼠燙傷腹部左右兩側(如圖4)，將采用本發明實施例2所述方法制備的溫敏水凝膠每天均勻地涂于老鼠燙傷表面的右側部分作為實驗組，以表皮干細胞條件培養基涂于老鼠燙傷表面的左側部分作為對照組，每天涂抹一次，連續7天；然后分別于燙傷后7、14、21、28天檢測兩組傷口愈合情況，同時做第14天皮膚組織的Ki-67染色觀察創面及創緣組織學變化。

實驗結果：結果發現，如圖4A所示，實驗組創口愈合時間明顯短于對照組，且傷口恢復更為整潔，瘢痕增生較少；切片顯示較對照組相比，實驗組創面表皮層和真皮層組織結構完整，損傷更少，棕色陽性信號的旺盛增殖細胞排列較對照組更加有序，如圖4B。

最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質。