本發明涉及GLP-1類似物和齊考諾肽組合物緩釋微球制劑及其制備方法，屬于藥物制劑領域。
背景技術：
：隨著社會的發展，世界范圍內糖尿病的發病率呈明顯增加的趨勢，2000年曾估計為2.8％，到2025年預計為4.3％，糖尿病患者人數也將從2000年的1.71億增加到2025年的3.8億。糖尿病的并發癥較多，已成為導致患者致死、致殘的主要原因，嚴重影響著人類健康。糖尿病并發癥包括糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病腎病、高血壓、痛性糖尿病神經病變(Painfuldiabeticneuropathy,PDN)等，其中PDN是糖尿病最常見、最嚴重的并發癥之一。慢性病變在PDN中常見，主要侵犯四肢及足部。患者主要表現為肢端疼痛，燒痛、刀割樣、撕裂性、針刺樣疼痛。PDN是目前臨床上最復雜、最難治的糖尿病周圍神經病變之一。糖尿病患者中大部分為2型糖尿病患者，占90-95％。GLP-1類似物是21世紀出現的新型治療藥物，因該類藥物具有良好的降糖效果、能夠減少低血糖的風險，同時具有適當的減重作用等優勢一直是糖尿病治療藥物研究的熱點。目前主要的GLP-1類似物降糖藥物包括利拉魯肽、艾塞那肽、度拉糖肽、阿必魯肽等，該類藥物主要經皮下注射給藥。然而，臨床上艾塞那肽、度拉糖肽、阿必魯肽等雖然有長效制劑，但單獨使用時，對糖尿病的治療效果仍不能令人滿意，無法緩解PDN并發癥的疼痛。利拉魯肽需每日皮下注射，給患者帶來極大的給藥痛苦。臨床上用于治療PDN的藥物主要有抗驚厥藥、抗抑郁藥、阿片類藥、醛糖還原酶抑制劑、血管緊張素轉化酶抑制劑、鈣離子拮抗劑及前列腺素等。然而阿片類鎮痛藥對慢性神經源性等疼痛的治療效果并不理想，而且有成癮性，快速耐受性(即幾次用藥后療效逐漸降低)，引起便秘和呼吸抑制等嚴重不良發應。齊考諾肽是人工合成的ω-MⅦA芋螺毒素，能可逆地阻斷N型鈣離子通道，成為第一種新型的神經治療藥物—N型鈣離子通道阻斷劑(NCCB)。作為一種非阿片類鎮痛劑，齊考諾肽與其他鎮痛藥物的區別在于其臨床應用的安全性和有效性，從而預示了其在嚴重慢性疼痛治療中重要的潛在價值，而在臨床研究中也沒有發現病人對齊考諾肽產生抗藥性。目前齊考諾肽采用鞘內滴注的方式給藥，鞘內給藥系統需植入，給患者帶來很大的不便，同時臨床管理要求也比較嚴格。臨床上降血糖及并發癥治療方案是分開給藥的，給患者帶來多次給藥的痛苦。目前，尚未發現將兩者聯合應用的報道。將GLP-1類似物和齊考諾肽進行聯用，能有效治療糖尿病及其PDN并發癥，明顯鎮痛，減輕患者痛苦，提高患者用藥依從性。技術實現要素：基于此，有必要提供一種具有緩釋效果的GLP-1類似物和齊考諾肽組合物緩釋微球制劑，以實現治療糖尿病及其PDN并發癥的作用，并減輕患者痛苦，提高患者用藥依從性，具有臨床現實意義。為實現上述目的，本發明提供以下技術方案：一種GLP-1類似物和齊考諾肽組合物緩釋微球制劑，包含GLP-1類似物、齊考諾肽、可生物降解且具生物相容性的高分子材料、穩定劑和凍干保護劑；在其中一個實施例中，所述GLP-1類似物選自利拉魯肽或其鹽、艾塞那肽或其鹽、度拉糖肽或其鹽、阿必魯泰或其鹽中的一種；在其中一個實施例中，所述GLP-1類似物與齊考諾肽的質量比為1:1～1:25。在其中一個實施例中，所述緩釋微球制劑由以下重量百分比含量的成份組成：GLP-1類似物0.02～1.35％、齊考諾肽0.02～1.58％、可生物降解且具生物相容性的高分子材料60.00～92.00％、穩定劑0.05～25％和凍干保護劑0.21～28.54％；所述GLP-1類似物與齊考諾肽的質量比為1:8～1:20。在其中一個實施例中，所述緩釋微球制劑由以下重量百分比含量的成份組成：GLP-1類似物0.05～1.25％、齊考諾肽0.06～1.58％、可生物降解且具生物相容性的高分子材料75.00～92.00％、穩定劑0.05～20.00％和凍干保護劑0.35～20.30％；所述GLP-1類似物與齊考諾肽的質量比為1:10～1:20。在其中一個實施例中，所述可生物降解且具生物相容性的高分子材料選自聚丙交酯—乙交酯、聚羥基丁酸戊酸酯、聚乳酸-羥基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇中的一種或多種，分子量為5000～90000道爾頓。在其中一個實施例中，所述可生物降解且具生物相容性的高分子材料優選自聚丙交酯—乙交酯、聚羥基丁酸戊酸酯、聚乳酸-羥基乙酸(50∶50～85∶15)、聚乳酸-聚乙二醇(5∶1～20∶1)中的一種或多種，分子量為8000～80000道爾頓。在其中一個實施例中，所述緩釋微球的平均粒徑為10μm～100μm。在其中一個實施例中，所述穩定劑為聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸鈉、聚丙烯酸鈉中的至少一種；所述凍干保護劑選自山梨醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、泊洛沙姆中的至少一種。在其中一個實施例中，所述穩定劑優選為聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一種；所述凍干保護劑優選自甘露醇、乳糖、泊洛沙姆中的至少一種。一種GLP-1類似物和齊考諾肽組合物緩釋微球制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟1)將GLP-l類似物和齊考諾肽加水配成藥物溶液A；將可生物降解且具生物相容性的高分子材料加有機溶劑配成溶液B；步驟2)將溶液A和溶液B混合超聲形成初乳，初乳加入到用有機混合溶劑飽和過的穩定劑水溶液中，均質乳化得復乳；步驟3)將復乳室溫攪拌1小時后升溫至40℃～45℃保持1小時，再降溫至10℃，加入凍干保護劑，過篩收集顆粒，凍干，經輻射滅菌。在其中一個實施例中，步驟1)中的有機溶劑選自乙酸乙酯、苯甲醇混合溶液或二氯甲烷、苯甲醇混合溶液中的一種。在其中一個實施例中，步驟1)中的有機溶劑乙酸乙酯和苯甲醇的體積比為2.5～8∶1；二氯甲烷和苯甲醇的體積比為2.5～7∶1。在其中一個實施例中，步驟2)中的有機混合溶劑為苯甲醇和乙酸乙酯，有機混合溶劑的濃度為1％～3％。在其中一個實施例中，步驟3)中的復乳室溫攪拌1小時后升溫至45℃保持1小時，再降溫至10℃。所述的GLP-1類似物和齊考諾肽組合物緩釋微球制劑，用于治療糖尿病及其痛性糖尿病神經病變并發癥。附圖說明圖1為實施例1、3、7、9制備的緩釋微球體外釋放曲線。具體實施方式以下實施例是對本發明的進一步說明，但絕不是對本發明范圍的限制。下面參照實施例進一步詳細闡述本發明，但是本領域技術人員應當理解，本發明并不限于這些實施例以及使用的制備方法。而且，本領域技術人員根據本發明的描述可以對本發明進行等同替換、組合、改良或修飾，但這些都將包括在本發明的范圍內。一實施方式的GLP-1類似物和齊考諾肽組合物緩釋微球制劑，包括GLP-1類似物、齊考諾肽、可生物降解且具生物相容性的高分子材料、穩定劑和凍干保護劑。其中，GLP-1類似物選自利拉魯肽或其鹽、艾塞那肽或其鹽、度拉糖肽或其鹽、阿必魯泰或其鹽中的一種。例如，GLP-1類似物可以是利拉魯肽、醋酸利拉魯肽或利拉魯肽的醋酸鹽。GLP-1類似物和齊考諾肽混合形成緩釋微球的內核，可生物降解且具生物相容性的高分子材料包覆在內核的表面形成緩釋微球的包衣。可生物降解且具生物相容性的高分子材料作為包衣，使得該GLP-1類似物和齊考諾肽組合物緩釋微球具有較好的緩釋性能，能夠克服普通的GLP-1類似物制劑給藥次數多、不利于患者接受的缺點。GLP-1類似物能夠治療糖尿病。齊考諾肽能夠有效減輕嚴重慢性疼痛。GLP-1類似物和齊考諾肽聯合使用，能有效治療糖尿病及其PDN并發癥，明顯減輕慢性疼痛而不會產生耐藥性，減輕患者痛苦，提高患者用藥依從性。優選地，GLP-1類似物和齊考諾肽的質量比為1:1～1:25，以充分發揮GLP-1類似物和齊考諾肽的優點，起到較好的協調作用，以較好地治療糖尿病及其PDN并發癥。優選地，GLP-1類似物和齊考諾肽組合物緩釋微球制劑主要由以下重量百分比含量的成份組成：GLP-1類似物0.02～1.35％、齊考諾肽0.02～1.58％、可生物降解且具生物相容性的高分子材料60.00～92.00％、穩定劑0.05～2.84％和凍干保護劑0.21～28.54％；所述GLP-1類似物與齊考諾肽的質量比為1:8～1:20。更優選地，GLP-1類似物和齊考諾肽組合物緩釋微球制劑主要由以下重量百分比含量的成份組成：GLP-1類似物0.05～1.25％、齊考諾肽0.06～1.58％、可生物降解且具生物相容性的高分子材料75.00～92.00％、穩定劑0.05～2.00％和凍干保護劑0.35～20.30％；所述GLP-1類似物與齊考諾肽的質量比為1:10～1:20。采用上述重量百分比，能夠發揮活性組分GLP-1類似物和齊考諾肽的聯用的療效，且使得該GLP-1類似物和齊考諾肽組合物緩釋微球具有較好的緩釋效果，不僅能夠顯著減少給藥次數，方便臨床使用和患者接受，而且能夠消除普通制劑多次給藥產生的藥物濃度峰谷現象，有利于獲得平穩長時間的有效濃度，降低毒副作用。優選地，可生物降解且具生物相容性的高分子材料選自聚丙交酯—乙交酯、聚羥基丁酸戊酸酯、聚乳酸-羥基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇中的一種或多種，分子量為5000～90000道爾頓。更優選地，可生物降解且具生物相容性的高分子材料選自聚丙交酯—乙交酯、聚羥基丁酸戊酸酯、聚乳酸-羥基乙酸(50∶50～85∶15)、聚乳酸-聚乙二醇(5∶1～20∶1)中的一種或多種，分子量為8000～80000道爾頓。上述可生物降解且具生物相容性的高分子材料的生物相容性較好，且可生物降解，使得該GLP-1類似物和齊考諾肽組合物緩釋微球制劑的安全性較好。優選地，上述緩釋微球的平均粒徑為10μm～100μm，使得該GLP-1類似物和齊考諾肽組合物緩釋微球制劑有利于在體內的有效擴散，能夠有效地控制體內血糖含量和減輕PDN并發癥疼痛，減少給藥次數和藥物耐受性，提高病人的順應性，方便臨床使用和患者用藥。優選地，穩定劑為聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸鈉、聚丙烯酸鈉中的至少一種；凍干保護劑選自山梨醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、泊洛沙姆中的至少一種。更優選地，穩定劑為聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一種；凍干保護劑選自甘露醇、乳糖、泊洛沙姆中的至少一種。該GLP-1類似物和齊考諾肽組合物緩釋微球制劑能夠有效治療糖尿病及其PDN并發癥。由于使用了緩釋微球，使得該GLP-1類似物和齊考諾肽組合物緩釋微球制劑具有緩釋效果，能夠顯著發揮GLP-1類似物和齊考諾肽的協調效應，提高療效。GLP-1類似物和齊考諾肽組合物緩釋微球制劑經皮下注射給藥，經實驗表明，釋放時間長達1個月，累計釋放度達90％以上。通過一次皮下注射上述GLP-1類似物和齊考諾肽組合物緩釋微球制劑進行給藥，同時實現GLP-1類似物和齊考諾肽的給藥，解決了單獨給藥時臨床給藥不便的問題。一種GLP-1類似物和齊考諾肽組合物緩釋微球制劑的制備方法，包括如下步驟：步驟1)將GLP-l類似物和齊考諾肽加水配成藥物溶液A；將可生物降解且具生物相容性的高分子材料加有機溶劑配成溶液B；步驟2)將溶液A和溶液B混合超聲形成初乳，初乳加入到用有機混合溶劑飽和過的穩定劑水溶液中，均質乳化得復乳；步驟3)將復乳室溫攪拌1小時后升溫至40℃～45℃保持1小時，再降溫至10℃，加入凍干保護劑，過篩收集顆粒，凍干，經輻射滅菌。優選地，步驟1)中的有機溶劑選自乙酸乙酯、苯甲醇混合溶液或二氯甲烷、苯甲醇混合溶液中的一種。優選地，步驟1)中的有機溶劑乙酸乙酯和苯甲醇的體積比為2.5～8∶1；二氯甲烷和苯甲醇的體積比為2.5～7∶1。優選地，步驟2)中的有機混合溶劑為苯甲醇和乙酸乙酯，有機混合溶劑的濃度為1％～3％。優選地，步驟3)中的復乳室溫攪拌1小時后升溫至45℃保持1小時，再降溫至10℃。通過該方法能夠解決普通復乳法制備水溶性藥物過程中最常見的突釋問題以及在洗滌微球外部時導致的藥物損失問題；能夠提高微球表面的平滑度從而使得血藥濃度更加穩定平滑。以下通過具體實施例進一步闡述。實施例1稱取0.2mg利拉魯肽和0.2mg齊考諾肽加水配成濃度為40％的藥物溶液，將1g聚丙交酯-乙交酯用25mL乙酸乙酯和10mL苯甲醇溶解，將二者混合超聲2min，形成白色均質初乳。初乳在1600rpm的均質下通過注射器加入到6℃的1000mL0.01％(重量體積比)的聚乙烯醇水溶液(含1％苯甲醇和1％乙酸乙酯)中，均質乳化2min得復乳。將復乳移至懸臂攪拌機上，轉速為600rpm，攪拌1h，然后升溫到40℃保持1小時，再降低到10℃，加入山梨醇0.1g得混合物，篩網過濾，凍干得粉末狀微球。經JSM-5600型掃描電子顯微鏡觀察，微球孔洞連續完整，微球均呈圓球狀，且大小均勻規整，粒徑范圍10～40μm，平均粒徑18μm。經Zeta電位分析儀測定，微球的Zeta電位置為(-28.5±1.23)mV，其表面所帶電荷為負電荷。實施例2稱取0.25mg艾塞那肽和0.3mg齊考諾肽加水配成濃度為20％的藥物溶液，將1g聚羥基丁酸戊酸酯用30mL乙酸乙酯和10mL苯甲醇溶解，將二者混合超聲2min，形成白色均質初乳。初乳在1600rpm的均質下通過注射器加入到6℃的1000mL0.02％的聚乙烯醇溶液(含0.5％苯甲醇和1％乙酸乙酯)中，均質乳化2min得復乳。將復乳移至懸臂攪拌機上，轉速為600rpm，攪拌1h，然后升溫到45℃保持1小時，再降低到10℃，加入乳糖0.1g得混合物，篩網過濾，凍干得粉末狀微球。經JSM-5600型掃描電子顯微鏡觀察，微球孔洞連續完整，微球均呈圓球狀，且大小均勻規整，粒徑范圍10～55μm，平均粒徑25μm。經Zeta電位分析儀測定，微球的Zeta電位置為(-33.2±1.06)mV，其表面所帶電荷為負電荷。實施例3稱取5mg利拉魯肽和0.1g齊考諾肽加水配成濃度為18％的藥物溶液，將6g聚丙交酯-乙交酯用25mL二氯甲烷和10mL苯甲醇溶解，將二者混合超聲2min，形成白色均質初乳。初乳在1600rpm的均質下通過注射器加入到6℃的1000mL0.2％的聚乙烯吡咯烷酮溶液(含1％苯甲醇和1.5％乙酸乙酯)中，均質乳化2min得復乳。將復乳移至懸臂攪拌機上，轉速為600rpm，攪拌1h，然后升溫到42℃保持1小時，再降低到10℃，加入甘露醇0.5g得混合物，篩網過濾，凍干得粉末狀微球。經JSM-5600型掃描電子顯微鏡觀察，微球孔洞連續完整，微球均呈圓球狀，且大小均勻規整，粒徑范圍12～70μm，平均粒徑20μm。經Zeta電位分析儀測定，微球的Zeta電位置為(-26.1±1.27)mV，其表面所帶電荷為負電荷。實施例4稱取4mg度拉糖肽和90mg齊考諾肽加水配成濃度為18％的藥物溶液，將8g聚乳酸羥基乙酸(50:50)用40mL二氯甲烷和10mL苯甲醇溶解，將二者混合超聲2min，形成白色均質初乳。初乳在1600rpm的均質下通過注射器加入到6℃的1000mL0.1％的聚丙烯酸鈉溶液(含1.5％苯甲醇和1.5％乙酸乙酯)中，均質乳化2min得復乳。將復乳移至懸臂攪拌機上，轉速為600rpm，攪拌1h，然后升溫到40℃保持1小時，再降低到10℃，加入泊洛沙姆2g得混合物，篩網過濾，凍干得粉末狀微球。經JSM-5600型掃描電子顯微鏡觀察，微球孔洞連續完整，微球均呈圓球狀，且大小均勻規整，粒徑范圍27～78μm，平均粒徑35μm。經Zeta電位分析儀測定，微球的Zeta電位置為(-29.4±1.54)mV，其表面所帶電荷為負電荷。實施例5稱取1g阿必魯肽和1g齊考諾肽加水配成濃度為20％的藥物溶液，將50g聚乳酸-聚乙二醇(280:50)用50mL乙酸乙酯和20mL苯甲醇溶解，將二者混合超聲2min，形成白色均質初乳。初乳在1600rpm的均質下通過注射器加入到6℃的1000mL1％的聚乙烯醇溶液(含1％苯甲醇和1.5％乙酸乙酯)中，均質乳化2min得復乳。將復乳移至懸臂攪拌機上，轉速為600rpm，攪拌1h，然后升溫到45℃保持1小時，再降低到10℃，加入蔗糖12g得混合物，篩網過濾，凍干得粉末狀微球。經JSM-5600型掃描電子顯微鏡觀察，微球孔洞連續完整，微球均呈圓球狀，且大小均勻規整，粒徑范圍15～40μm，平均粒徑25μm。經Zeta電位分析儀測定，微球的Zeta電位置為(-22.4±1.68)mV，其表面所帶電荷為負電荷。實施例6稱取80mg艾塞那肽和120mg齊考諾肽加水配成濃度為25％的藥物溶液，將48g聚丙交酯-乙交酯用80mL乙酸乙酯和15mL苯甲醇溶解，將二者混合超聲2min，形成白色均質初乳。初乳在1600rpm的均質下通過注射器加入到6℃的1000mL0.15％的聚乙烯吡咯烷酮溶液(含0.5％苯甲醇和1.5％乙酸乙酯)中，均質乳化2min得復乳。將復乳移至懸臂攪拌機上，轉速為600rpm，攪拌1h，然后升溫到50℃保持1小時，再降低到10℃，加入甘露醇5g得混合物，篩網過濾，凍干得粉末狀微球。經JSM-5600型掃描電子顯微鏡觀察，微球孔洞連續完整，微球均呈圓球狀，且大小均勻規整，粒徑范圍15～60μm，平均粒徑30μm。經Zeta電位分析儀測定，微球的Zeta電位置為(-29.3±1.61)mV，其表面所帶電荷為負電荷。實施例7稱取20mg度拉糖肽和0.5g齊考諾肽加水配成濃度為30％的藥物溶液，將80g聚羥基丁酸戊酸酯用50mL乙酸乙酯和12mL苯甲醇溶解，將二者混合超聲2min，形成白色均質初乳。初乳在1600rpm的均質下通過注射器加入到6℃的1000mL0.15％的聚乙烯吡咯烷酮溶液(含1.5％苯甲醇和1.5％乙酸乙酯)中，均質乳化2min得復乳。將復乳移至懸臂攪拌機上，轉速為600rpm，攪拌1h，然后升溫到50℃保持1小時，再降低到10℃，加入乳糖12g得混合物，篩網過濾，凍干得粉末狀微球。經JSM-5600型掃描電子顯微鏡觀察，微球孔洞連續完整，微球均呈圓球狀，且大小均勻規整，粒徑范圍10～90μm，平均粒徑35μm。經Zeta電位分析儀測定，微球的Zeta電位置為(-27.2±1.39)mV，其表面所帶電荷為負電荷。實施例8稱取50mg阿必魯肽和0.8g齊考諾肽加水配成濃度為25％的藥物溶液，將80g聚乳酸-羥基乙酸(75:15)用30mL二氯甲烷和12mL苯甲醇溶解，將二者混合超聲2min，形成白色均質初乳。初乳在1600rpm的均質下通過注射器加入到6℃的1000mL0.2％的聚乙烯醇溶液(含0.8％苯甲醇和1.5％乙酸乙酯)中，均質乳化2min得復乳。將復乳移至懸臂攪拌機上，轉速為600rpm，攪拌1h，然后升溫到50℃保持1小時，再降低到10℃，加入乳糖5g得混合物，篩網過濾，凍干得粉末狀微球。經JSM-5600型掃描電子顯微鏡觀察，微球孔洞連續完整，微球均呈圓球狀，且大小均勻規整，粒徑范圍15～70μm，平均粒徑25μm。經Zeta電位分析儀測定，微球的Zeta電位置為(-32.0±1.34)mV，其表面所帶電荷為負電荷。實施例9稱取0.5g艾塞那肽和8g齊考諾肽加水配成濃度為25％的藥物溶液，將500g聚乳酸-聚乙二醇(18:2)用60mL乙酸乙酯和12mL苯甲醇溶解，將二者混合超聲2min，形成白色均質初乳。初乳在1600rpm的均質下通過注射器加入到6℃的1000mL10％的聚乙烯醇溶液(含2％苯甲醇和1％乙酸乙酯)中，均質乳化2min得復乳。將復乳移至懸臂攪拌機上，轉速為600rpm，攪拌1h，然后升溫到50℃保持1小時，再降低到10℃，加入海藻糖40g得混合物，篩網過濾，凍干得粉末狀微球。經JSM-5600型掃描電子顯微鏡觀察，微球孔洞連續完整，微球均呈圓球狀，且大小均勻規整，粒徑范圍10～80μm，平均粒徑30μm。經Zeta電位分析儀測定，微球的Zeta電位置為(-23.6±1.97)mV，其表面所帶電荷為負電荷。實施例10體外累計釋放度的測定剪取長度約為5cm的透析袋(8000-14000)，放入盛有適量水的燒杯中，加熱煮沸5min(從水沸騰開始計時)，將煮沸后的透析袋一端用細線扎緊，檢漏。采用動態透析法進行體外累計釋放度的測定。精密稱實施例1、3、7、9制備的緩釋微球40mg置入透析袋中，加入2mLPBS緩沖液(0.1M，pH＝7.4，含0.02％疊氮化鈉)，封口，置于裝有48mLPBS緩沖液的具塞錐形瓶中，放入(37.0±0.5)℃的恒溫水浴搖床，以轉速為100r·min-1的速度振搖，分別于0，5，10，15，20，25，30d各取出5mL，同時補加等量新鮮同溫的PBS緩沖液，用紫外分光光度儀測定吸光度，計算累積釋放百分率，繪制釋放曲線如圖1所示。圖1的釋放曲線可以看出，本發明的緩釋微球制劑在30天內可持續穩定的釋放藥物，保證血藥濃度的穩定，達到了本發明的目的。取實施例2、4、5、6、8制得的緩釋微球制劑進行釋放度測定，結果與實施例1、3、7、10測得的結果相近，表明實施例2、4、5、6、8、9提供的緩釋微球制劑同樣具有明顯的緩釋作用，保證血藥濃度的穩定，達到了本發明的目的。實施例11體內藥效學動物模型建立及分組清潔級雄性SD大鼠210只(180±20)g，適應性喂養1周后，按體重層次隨機取30只，分為三組，分別為2w、4w、8w正常對照組(每組10只)，其余180只大鼠造模。模型組飼以高糖高脂飼料(在標準全價混合飼料的基礎上添加蔗糖、煉豬油和蛋黃，熱能含量21.6kJ/kg)。高糖高脂飼料組喂養4周后，腹腔注射鏈脲佐菌素枸櫞酸緩沖液(臨用前溶解在pH＝4.0的0.1mmol/L枸櫞酸緩沖液內，25mg/kg，1次/d，連續2d)；正常對照組普通飼料喂養4周，再注射等量枸櫞酸緩沖液，1次/d，連續2d。注射藥物兩天后間隔1d血糖測試儀測查大鼠空腹血糖(測試前禁食12h)，即注射后血糖，以血糖含量16.7mmol/L為糖尿病大鼠模型判定標準，大于16.7mmol/L的大鼠被作為觀察對象，繼續飼以普通飼料4周之后使用Vonfrey纖維測定大鼠后足的機械性痛閾值，下降50％者認為PDN造模成功。將造模成功的大鼠按血糖層次隨機分為2w、4w、8w模型組(每組10只)，2w、4w、8w本實施例1、3、5、7、9緩釋微球組(每組10只)。給藥方法正常組：按生理鹽水10mL/kg/d皮下注射；模型組：按生理鹽水10mL/kg/d皮下注射；緩釋微球組：5mg/kg每月一次性皮下注射，注射前微球先用混懸劑(3％羧甲基纖維素鈉+0.1％Tween20)混懸；所有組都從PDN大鼠模型成立后，除緩釋微球組，開始每日皮下注射一次，直到各組實驗結束。實驗期間各組大鼠均在相同條件之下飼養。統計學處理采用SPSS13.0軟件進行統計學處理，計量資料用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05表示有統計學意義，P＜0.01表示有顯著性差異。血糖測定分別于治療后2周末、4周末、8周末三個時間點，各組隨機取8只大鼠，應用穩步型血糖儀來測定大鼠尾靜脈空腹血糖。各組血糖在各時間點的變化，如表1所示。表1各組大鼠血糖(mmol/L)在各時間點的變化(n＝8)組別2w4w8w正常組5.21±1.245.14±0.565.32±0.45模型組21.34±4.45**24.25±3.12**28.98±2.91**實施例112.65±0.87**△6.84±1.23*△△6.65±0.54△△實施例311.45±0.25**△7.33±0.71*△△6.27±1.26△△實施例510.35±0.51**△7.45±0.73*△△5.93±0.26△△實施例710.01±0.41**△8.02±0.66*△△7.01±0.26△△實施例910.25±0.12**△7.65±0.27*△△6.15±0.54△△注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。實驗期間，隨著時間延長，模型組大鼠尾靜脈血糖明顯升高，與正常組比較，2周，4周和8周時都有顯著性的差異(P＜0.01)，而在實驗期間，治療組大鼠大鼠尾靜脈血糖值呈降低的趨勢，與模型組相比，2周時有統計學意義(P＜0.05)，4周和8周時，具有顯著性的差異(P＜0.01)，與正常組相比，2周時具有顯著性的差異(P＜0.01)，4周時有統計學意義(P＜0.05)，8周時無統計學意義(P＞0.05)。說明本發明的緩釋微球組合物可以明顯抑制血糖升高的作用。機械性痛閾測定分別于治療后2周末、4周末、8周末，各組隨機取8只大鼠，采用標準的Vonfrey纖維，采用up-down方法來檢測大鼠后足的機械性痛閾值(MPT)。各組大鼠機械性痛閾(MPT)在各時間點的變化，如表2所示。表2各組大鼠MPT(g)在各時間點的變化(n＝10)注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。可見模型組隨著實驗時間延長，大鼠機械性痛閾值呈現明顯降低趨勢，與正常組相比，2周，4周，8周時具有顯著性的差異(P＜0.01)；而在實驗期間，治療組大鼠機械性痛閾值呈升高的趨勢，與模型組相比，2周時有統計學意義(P＜0.05)，4周和8周時，具有顯著性的差異(P＜0.01)，與正常組相比，2周和4周時有統計學意義(P＜0.05)，8周時無統計學意義(P＞0.05)。說明本發明的緩釋微球組合物可以明顯提高糖尿病大鼠神經機械性痛閾值。當前第1頁1 2 3