含有槲皮素的聚合物膠束溶液及其制備方法和應用與流程
本發明涉及生物制藥技術領域，尤其是涉及一種含有槲皮素的兩親性聚合物酵素溶液及其制備方法和應用。
背景技術：
槲皮素，又名櫟精、槲皮黃素，可作為藥品，具有較好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用。此外還有降低血壓、增強毛細血管抵抗力、減少毛細血管脆性、降血脂、擴張冠狀動脈，增加冠脈血流量等作用。槲皮素廣泛用于治療慢性支氣管炎，并對冠心病及高血壓患者也有輔助治療作用。現代醫學研究表明，槲皮素還具有良好的抗腫瘤作用，在國外已有將其應用于臨床治療腫瘤。但槲皮素的穩定性差，在體內循環半衰期短，難以有效的到達病灶部位，并且槲皮素難溶于水，口服生物利用度較差。
技術實現要素：
基于此，有必要提供一種能夠提高槲皮素的生物利用度的含有槲皮素的聚合物膠束溶液及其制備方法和應用。
一種含有槲皮素的聚合物膠束溶液，包括具有如下質量百分含量的各組分：
其中，所述兩親性聚合物膠束材料包覆所述槲皮素形成核殼結構。
在其中一個實施例中，所述聚合物膠束溶液包括具有如下質量百分含量的各組分：
槲皮素 0.5％～1.0％；
兩親性聚合物膠束材料 10％；以及
穩定劑 1.5％～2.5％；
余量為水。
在其中一個實施例中，所述兩親性聚合物膠束材料選自聚乙二醇-乙烯基己內酰胺-醋酸乙烯酯共聚物、脫氧膽酸鈉、聚氧乙烯、聚乙二醇化殼聚糖、聚維酮、仿細胞膜磷酸膽堿、聚氨基酸和聚乳酸-羥基乙酸共聚物中的至少一種。
在其中一個實施例中，所述穩定劑選自天然水溶性維生素E、泊洛薩姆407和吐溫80至少一種。
在其中一個實施例中，所述槲皮素的質量百分含量為0.7％；所述兩親性聚合物膠束材料為聚乙二醇-乙烯基己內酰胺-醋酸乙烯酯共聚物；所述穩定劑是泊洛薩姆407，所述穩定劑的質量百分含量是2％。
一種上述任一實施例所述的含有槲皮素的聚合物膠束溶液的制備方法，包括如下步驟：
步驟一：將所述槲皮素與所述兩親性聚合物膠束材料按照相應的質量百分含量配比溶于有機溶劑中，攪拌使所述槲皮素及所述兩親性聚合物膠束材料完全溶解至混合均勻，得到含有槲皮素及兩親性聚合物膠束材料的有機溶液；
步驟二：揮發完全除去所述溶液中的所述有機溶劑，得到包含所述槲皮素與所述兩親性聚合物膠束材料的聚合物薄膜材料；
步驟三：按照相應的質量百分含量配比將所述聚合物薄膜材料加入含有所述穩定劑的水溶液中，渦旋并攪拌，得到所述含有槲皮素的聚合物膠束溶液。
在其中一個實施例中，所述有機溶劑為丙酮、甲醇、乙酸乙酯和冰醋酸中的至少一種。
在其中一個實施例中，所述有機溶劑與所述兩親性聚合物膠束材料的體積質量比為(0.1-0.3)mL:100mg。
在其中一個實施例中，所述步驟一中的攪拌是于水浴中磁力攪拌，水浴的溫度為40～60℃；
所述步驟三中的攪拌是磁力攪拌，攪拌速度為500～700rpm，攪拌時間為0.5～2h。
上述任一實施例所述的含有槲皮素的聚合物膠束溶液在制備抗腫瘤藥物中的應用。
上述含有槲皮素的聚合物膠束溶液中的兩親性聚合物膠束材料在水中可自發形成穩定的聚合物膠束，其具有疏水內核-親水外殼的結構，疏水內核可以作為疏水性藥物槲皮素的儲庫，將難溶性藥物槲皮素增溶在內核，可增加槲皮素的穩定性，提高其生物利用度，促進其吸收；親水外殼不僅使聚合物膠束的穩定性增強，而且影響著聚合物膠束與外部環境的作用，從而影響聚合物膠束在生物體內的行為。聚合物膠束具有非常高的熱力學穩定性，結構內多點間具有疏水性相互作用，這樣使聚合物膠束具有較高的動力學穩定性，因此其良好的熱力學穩定性和動力學穩定性，能夠防止藥物在體內析出，保證包裹藥物的穩定性。
上述含有槲皮素的聚合物膠束溶液的制備方法工藝簡單，包封率高，生產成本較低，有利于工業化生產，具有良好的應用前景，同時有利于推進液晶納米的工業化發展。
附圖說明
圖1為實施例2中含有不同穩定劑的含有槲皮素的聚合物膠束的粒徑和電位；
圖2為實施例3中具有不同穩定劑濃度的含有槲皮素的聚合物膠束的粒徑；
圖3為實施例4中不同投藥量的含有槲皮素的聚合物膠束的粒徑、多分散系數、包封率、載藥量和電位；
圖4為實施例5不同磁力攪拌時間下含有槲皮素的聚合物膠束的粒徑和包封率；
圖5為實施例6中的含有槲皮素的聚合物膠束的電子掃描電鏡照片；
圖6為實施例7中的差示掃描量熱圖(A：槲皮素；B：含有槲皮素的聚合物膠束；C：空白聚合物膠束)；
圖7為實施例7中的粉末X-射線衍射圖(A：槲皮素；B：槲皮素和空白聚合物膠束的物理混合物；C：含有槲皮素的聚合物膠束；D：空白聚合物膠束)；
圖8為實施例8中的紅外吸收光譜圖(A：槲皮素；B：槲皮素和空白聚合物膠束的物理混合物；C：空白聚合物膠束；D：含有槲皮素的聚合物膠束)；
圖9為實施例9中含有槲皮素的聚合物膠束體外釋放示意圖；
圖10為實施例10中人工模擬胃腸液對Qu-PMs粒徑的影響示意圖；
圖11為實施例10中人工模擬胃腸液對Qu-PMs粒徑的影響示意圖(A：pH 1.2，2h；B：pH 7.4，4h；C：pH 7.4，6h；D：pH 7.4，8h)；
圖12為實施例11中Qu-PMs膠體溶液在室溫下存放粒徑和包封率穩定性示意圖；
圖13為實施例12中比格犬灌胃槲皮素原料藥和含有槲皮素的聚合物膠束的平均血藥濃度-時間變化曲線(n＝3)。
具體實施方式
為了便于理解本發明，下面將參照相關附圖對本發明進行更全面的描述。附圖中給出了本發明的較佳實施例。但是，本發明可以以許多不同的形式來實現，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發明的公開內容的理解更加透徹全面。
除非另有定義，本文所使用的所有的技術和科學術語與屬于本發明的技術領域的技術人員通常理解的含義相同。本文中在本發明的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在于限制本發明。本文所使用的術語“和/或”包括一個或多個相關的所列項目的任意的和所有的組合。
一實施方式的含有槲皮素的聚合物膠束溶液，其包含具有如下質量百分含量的各組分：
其中，兩親性聚合物膠束材料包覆槲皮素形成核殼結構。
優選的，該聚合物膠束溶液包括具有如下質量百分含量的各組分：
槲皮素 0.5％～1.0％；
兩親性聚合物膠束材料 10％；以及
穩定劑 1.5％～2.5％；
余量為水。
兩親性聚合物膠束材料選自聚乙二醇-乙烯基己內酰胺-醋酸乙烯酯共聚物(soluplus)、脫氧膽酸鈉、聚氧乙烯(PEO)、聚乙二醇化殼聚糖(PEG-CS)、聚維酮(PVP)、仿細胞膜磷酸膽堿、聚氨基酸和聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)中的至少一種。
槲皮素結構上帶有酚羥基，酚羥基易于和羰基之間形成分子間氫鍵。優選的，兩親性聚合物膠束材料為聚乙二醇-乙烯基己內酰胺-醋酸乙烯酯共聚物。聚乙二醇-乙烯基己內酰胺-醋酸乙烯酯共聚物具有親水段和聚乙烯基己內酰胺-醋酸乙烯酯疏水段的兩親性結構，CMC值(6.44×10-8mol·L-1)非常低，可以在水中自發形成穩定的聚合物膠束。疏水段聚乙烯基己內酰胺-醋酸乙烯酯形成疏水內核，包埋難溶性藥物，提高溶解性能的同時能夠加強其穩定性。聚乙二醇-乙烯基己內酰胺-醋酸乙烯酯共聚物形成的聚合物膠束疏水內核具有酰胺基和乙酰基的羰基結構，能夠與槲皮素的酚羥基形成氫鍵，因而能夠形成穩定包覆的核殼結構。
穩定劑選自天然水溶性維生素E(TPGS)、泊洛薩姆407(F127)和吐溫80(Tween80)至少一種。
優選的，本實施方式的含有槲皮素的聚合物膠束溶液中，槲皮素的質量百分含量為0.7％；兩親性聚合物膠束材料為聚乙二醇-乙烯基己內酰胺-醋酸乙烯酯共聚物；穩定劑是泊洛薩姆407，穩定劑的質量百分含量是2％。
本實施方式還提供了一種上述含有槲皮素的聚合物膠束溶液的制備方法，其包括如下步驟：
步驟一：將槲皮素與兩親性聚合物膠束材料按照相應的質量百分含量配比溶于有機溶劑中，攪拌使槲皮素及兩親性聚合物膠束材料完全溶解至混合均勻，得到含有槲皮素及兩親性聚合物膠束材料的有機溶液；
步驟二：揮發完全除去溶液中的有機溶劑，得到包含槲皮素與兩親性聚合物膠束材料的聚合物薄膜材料；
步驟三：按照相應的質量百分含量配比將聚合物薄膜材料加入含有穩定劑的水溶液中，渦旋并攪拌，得到含有槲皮素的聚合物膠束溶液。
有機溶劑優選但不限于為丙酮、甲醇、乙酸乙酯和冰醋酸，且有機溶劑與兩親性聚合物膠束材料的體積質量比為(0.1-0.3)mL:100mg。
步驟一中的攪拌是于水浴中磁力攪拌，水浴的溫度為40～60℃。
步驟三中的攪拌是磁力攪拌，攪拌速度為500～700rpm，攪拌時間為0.5～2h。優選的，攪拌速度為650rpm，攪拌時間為2h。
上述含有槲皮素的聚合物膠束溶液可廣泛應用于制備抗腫瘤藥物中。得到的抗腫瘤藥物具有良好的穩定性，且生物利用度較之單一槲皮素大大提高，吸收效率也大大提高。
以下為具體實施例部分。
實施例1：含有槲皮素的聚合物膠束溶液的制備。
稱取一定量的槲皮素(Qu)和100mg載體soluplus(聚乙二醇-乙烯基己內酰胺-醋酸乙烯酯共聚物)溶于0.2mL丙酮中，磁力攪拌使其完全溶解，混合均勻，然后于50℃水浴磁力攪拌，揮發除去丙酮，得到包含槲皮素與兩親性聚合物膠束材料的聚合物薄膜材料；稱取穩定劑溶于水中，配制成一定濃度的水溶液；將含有穩定劑的水溶液加入所制備的聚合物薄膜材料中使體系總重為1g，渦旋，650rmp磁力攪拌，即得含有槲皮素的聚合物膠束溶液(Qu-NPs)。
實施例2：穩定劑種類對含有槲皮素的聚合物膠束(以下簡稱“聚合物膠束”)的影響。
考察不同種類穩定劑對聚合物膠束的影響，制備方法同實施例1，聚合物膠束溶液分別采用1％TPGS、1％F127、1％Tween80和去離子水。其中槲皮素用量0.7％(7mg)，磁力攪拌2h。以聚合物膠束粒徑、Zeta電位和包封率作為考察指標。
粒徑和電位測定方法，用超純水稀釋聚合物膠束溶液后，取0.5mL聚合物膠束溶液加入到樣品池中，25℃平衡2min，采用Zetasizer Nano ZS90粒徑測定儀測定聚合物膠束的粒徑大小、多分散系數(PDI)和Zeta電位。
采用膜過濾法測定槲皮素的包封率，膜過濾法是指未包封的藥物以游離微晶(絕大部分)和溶解在介質(極小部分)兩種形式存在，因此可以用微孔濾膜過濾截留游離微晶，對于已溶解的藥物濃度可以近似地認為是藥物的溶解度。
精密量取稀釋的Qu-PMs膠體溶液0.5mL，用0.45μm微孔濾膜濾去未包封的藥物，將濾液用甲醇破乳，定容10mL容量瓶，HPLC法測定含量；另精密量取稀釋的Qu-PMs膠體溶液0.5mL于10mL容量瓶中，加甲醇破乳、定容，采用HPLC測定藥物的含量，計算包封率(entrapment efficiency，EE)。
HPLC條件如下：色譜柱：Odyssil C18(250×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇：0.2％磷酸(60：40)；柱溫：35℃；檢測波長：375nm；流速：1.0mL·min-1；進樣量：20μL。
如圖1A和1B所示，結果表明，加入不同穩定劑TPGS、F127、Tween80的條件下，均可得到小于100nm的聚合物膠束，且包封率均較好，均大于80％。使用1％TPGS作為穩定劑，制備聚合物膠束粒徑(62.11±0.53nm)和PDI(0.081±0.02)均較小，但是包封率相對最低(83.02±3.46％)，Zeta電位為-5.19±1.83mV，放置過程中發現容易聚集。使用1％F127作為穩定劑，制備聚合物膠束粒徑(61.64±0.35nm)和PDI(0.017±0.02)均較小，且包封率最高(95.85±2.86)，Zeta(-13.63±1.45)最小。使用1％Tween80作為穩定劑制備聚合物膠束的特點與使用1％F127作為穩定劑相似，但是放置過程中發現容易聚集，不加穩定劑制備聚合物膠束粒徑和PDI均相對較大。
實施例3：穩定劑濃度對聚合物膠束的影響。
考察不同穩定劑濃度對聚合物膠束的影響，制備方法同實施例1，聚合物膠束溶液分別采用質量百分含量為0.5％F127、1％F127、2％F127和3％F127。其中槲皮素用量0.7％(7mg)，磁力攪拌2h。以聚合物膠束粒徑和包封率作為考察指標，方法同實施例2。
如圖2所示，結果表明，0.5-2％F127濃度對聚合物膠束的粒徑和包封率影響較小，包封率都大于85％。3％F127制備的聚合物膠束粒徑較大(107nm)，0.5％、1％和2％F127制備的聚合物膠束粒徑均較小。
實施例4：投藥量對聚合物膠束的影響。
考察不同投藥量對聚合物膠束的影響，制備方法同實施例1，槲皮素的投藥量分別為聚合物膠束溶液總重的0.3％(3mg)、0.5％(5mg)、0.7％(7mg)、1.0％(10mg)、1.5％(15mg)。其中穩定劑為2％F127，磁力攪拌2h。以聚合物膠束粒徑、PDI、載藥量和包封率作為考察指標，方法同實施例2。
結果見圖3。圖3A粒徑結果表明，隨著投藥量的增加，聚合物膠束粒徑逐漸增大，當投藥量為10mg時，含有槲皮素的聚合物膠束粒徑明顯的增大。在投藥量為15mg時，粒徑急劇增加為559.23±19.41nm，PDI為0.427±0.104，這表明未包載的藥物在溶液中形成了微晶。
圖3B包封率結果表明，隨著投藥量增大，藥物的包封率呈上升趨勢，當投藥量為0.7％時，藥物的包封率最大，當投藥量為1.0％時，包封率小于60％，有一半藥物未被包封，藥物利用率較低。當投藥量為1.5％時，包封率只有2.29％。
圖3B載藥量結果表明，隨著投藥量增大，藥物的載藥量呈上升趨勢，當投藥量為0.7％時，藥物的載藥量最大，當投藥量為1.0％時，載藥量開始下降，載藥量有5.01％，當投藥量為1.5％時，載藥量只有0.34％。
圖3C電位結果表明，隨著投藥量增大，藥物的Zeta電位呈上升趨勢，當投藥量達到7％時，聚合物膠束的Zeta電位最小，然后隨著投藥量的增加，Zeta電位有變大趨勢。
綜合分析以上結果，隨著槲皮素投藥量的增大，粒徑、載藥量、包封率及Zeta電位絕對值都有所增加。聚合物膠束載藥量的增加，即聚合物膠束內核包載的藥物量增多，更多的藥物包入內核，造成內核直徑變大，所以聚合物膠束粒徑就增大。同時，由于疏水內核的空間有限，增大槲皮素的投入量，超出內核載藥能力時，必然有部分槲皮素不能包入核內，這樣會使原料的利用率降低。當投藥量為1.0％時，含有槲皮素的聚合物膠束的粒徑超過100nm，可能是由于當投藥量增多，疏水內核直徑增大的緣故。當投藥量為1.5％時，這時超過了聚合物膠束載藥的能力，藥物在水溶液中形成了微晶。因此從粒子的粒徑、包封率、載藥量及Zeta電位考慮，適宜的投藥量應該控制在0.7％(7mg)。
實施例5：磁力攪拌時間對聚合物膠束的影響。
考察不同磁力攪拌時間對膠束的影響，制備方法同實施例1，攪拌時間分別為0.5、1、1.5和2h。其中穩定劑為2％F127，投藥量為0.7％(7mg)。以聚合物膠束粒徑和包封率作為考察指標，方法同實施例2。
如圖4所示，結果顯示，隨著磁力攪拌時間延長聚合物膠束粒徑變小，沒有顯著性變化，PDI隨磁力攪拌時間延長而變小。磁力攪拌時間對包封率的影響不大。磁力攪拌時間為2h得到聚合物膠束粒粒徑小，而且分布范圍較窄，包封率也較好。綜合考慮選擇磁力攪拌2h。
綜合上面處方和工藝各個實施例的結果，優化出最佳制備工藝及處方：投藥量為7mg，以2％F127為穩定劑，650rpm磁力攪拌2h。
實施例6：聚合物膠束的形態表征。
為了考察聚合物膠束的形態和粒子的大小，采用電子掃描電鏡(SEM)方法觀察。
含有槲皮素的聚合物膠束凍干粉樣品制備。取聚合物膠束膠體溶液，加入5％的甘露醇凍干保護劑，放入-80℃冰箱預凍12h，然后置于冷凍干燥儀中凍干24h，即可得到餅狀含有槲皮素的聚合物膠束凍干粉。
將實施例1所制備含有槲皮素的聚合物膠束凍干粉樣品置于粘有絕緣膠的銅制盤上，噴金2.5min，真空干燥，用電子掃描電鏡掃描成像、觀察并拍照。其結果如圖5所示，結果顯示掃描電鏡顯示制備的含有槲皮素的聚合物膠束呈球形或類球形，平均粒徑約100nm。
實施例7：槲皮素在聚合物膠束體系中的晶型研究。
為了考察槲皮素在聚合物膠束中的存在狀態，采用DSC和X-射線衍射(XRD)進行分析測定。
DSC：分別取適量5mg槲皮素(Qu)、空白聚合物膠束凍干粉和實施例1所制備載藥聚合物膠束凍干粉(Qu-PMs)凍干粉進行DSC分析。DSC條件為：升溫速度10℃/min，測量范圍30-400℃，空鋁盤為空白對照，爐內氣體為氮氣。
DSC結果見圖6。結果表明，槲皮素原料藥在是以晶型的形式存在的，DSC圖中顯示在134℃和325℃出現2個峰，134℃的峰是藥物一個脫水峰，325℃的峰是藥物一個明顯的熔融吸熱峰；空白聚合物膠束出現四個吸熱峰，而含有槲皮素的聚合物膠束與空白聚合物膠束的吸熱峰是一致的，這與載體的玻璃轉化溫度和相互之間聯系有關，在134℃和325℃處沒有出現原料藥的吸熱峰。DSC結果顯示槲皮素在聚合物膠束中的分散與原料藥晶型是不同的。從DSC圖還可以看出，含有槲皮素的聚合物膠束在大約350℃的峰與空白聚合物膠束相比峰形位置發生了移動，這說明了槲皮素和兩親性聚合物膠束材料之間可能存在一定的作用力。
X-射線衍射(XRD)：取適量槲皮素(Qu)、空白聚合物膠束凍干粉(PMs)、空白聚合物膠束凍干粉和原料藥的物理混合物及實施例所制備載藥聚合物膠束凍干粉(Qu-PMs)樣品，進行XRD分析。XRD條件為：掃描角度為3°≤2θ≤50°，步長0.9min-1，停留時間2秒，電壓為40KV，電流為25mA。
X射線衍射分析的結果見圖7。結果表明，槲皮素原料藥呈現明顯的晶型結構的衍射峰；在槲皮素原料藥與空白聚合物膠束凍干粉的物理混合物中槲皮素仍呈現藥物的晶型結構的衍射峰，說明在物理混合物中槲皮素仍然以晶型的結構存在；而含有槲皮素的聚合物膠束的XRD中也有許多峰，但是不同于原料藥或物理混合中藥物的晶型衍射峰，這表明了槲皮素在聚合物膠束中存在不同于槲皮素原料藥的晶型結構。從物理混合、空白聚合物膠束和含有槲皮素的聚合物膠束中衍射峰的移動說明了槲皮素與聚合物之間存在著一定的相互作用。XRD結果也表明，槲皮素在聚合物膠束中可能以分子狀態或無定形狀態存在。
實施例8：槲皮素與兩親性聚合物膠束材料的相互作用(FTIR)。
為了考察槲皮素和兩親性聚合物膠束材料的相互作用，采用紅外光譜分析方法，對槲皮素(Qu)、空白聚合物膠束凍干粉(PMs)、空白聚合物膠束凍干粉和原料藥的物理混合物及實施例1所制備載藥聚合物膠束凍干粉(Qu-PMs)進行樣品結構特征分析。
首先將冷凍干燥樣品壓成粉末，加入一定量的溴化鉀(KBr)，混合均勻，紅外燈下干燥除去多余的水分，壓成薄片，置于紅外光譜分析儀，在400～4000cm-1范圍測定樣品的紅外光譜。
紅外光譜結果見圖8A、圖8B、圖8C及圖8D。通過紅外光譜位移和強度可以觀察分子間是否存在相互作用。結果顯示，槲皮素原料藥的紅外光譜出現許多特征吸收峰：OH伸縮振動峰(3700-3300cm-1)；C＝O吸收峰(1670cm-1)；C-C伸縮振動峰(1612cm-1)；C-H彎曲振動峰(1456，1383，和866cm-1)；在環結構上的C-O伸縮振動峰(1272cm-1)和C-O伸縮振動峰(1070-1050cm-1)，這與文獻的報道相一致的。空白膠束也出現許多特征吸收峰：OH伸縮振動峰(3500-3250cm-1)；sp3CH伸縮振動峰(2932cm-1，亞甲基)；C＝O吸收(1742cm-1，酯基)，C＝O吸收(1641cm-1，酰胺基)。空白聚合物膠束和槲皮素原料藥的物理混合物的紅外吸收圖中可以看出，既顯現了空白膠束的特征吸收，還顯現了槲皮素的特征吸收峰；含有槲皮素的聚合物膠束出現特征吸收峰：C＝O吸收(1737cm-1，1636cm-1)，與空白膠束中C＝O吸收峰(1742cm-1，1641cm-1)相比較，位移改變了，C＝O吸收(1636cm-1)峰變寬，這說明在槲皮素膠束中槲皮素酚羥基和聚合物的羰基之間形成了氫鍵。
實施例9：含有槲皮素的聚合物膠束的釋放行為及釋放模型。
采用透析袋法研究含有槲皮素的聚合物膠束的藥物釋放行為。由于槲皮素難溶于水，而且在胃腸液中溶解度很小，很難達到漏槽條件，因此，選用35％的乙醇作為釋放介質以滿足漏槽條件，比對原料藥槲皮素和含有槲皮素的聚合物膠束的釋放情況，為體內實驗研究提供參考。
分別按照最優處方制備投藥量為5％，7％和9％制備Qu-PMs溶液，同時制備槲皮素的丙二醇溶液，各取一定樣品置于透析袋(截留分子量14000)中，扎緊透析袋兩端，將含藥透析袋置于100mL 35％乙醇釋放介質中，在37±0.5℃、轉速為100rpm條件下進行釋放，定時取樣4mL，并及時補充相應量同溫度的釋放介質，經0.45μm微孔濾膜過濾，得續濾液，采用HPLC測定藥物的含量。計算不同時間點時藥物的累積釋放百分率，繪制累積釋放曲線。
高效液相色譜條件：色譜柱：Odyssil C18(250×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇：0.2％磷酸(60：40)；柱溫：35℃；檢測波長：375nm；流速：1.0mL·min-1；進樣量：20μL。
其釋放結果見圖9。結果表明，槲皮素原料藥在24h內基本釋放完全，達到96.13％；而含有槲皮素的聚合物膠束在24h內僅僅釋放26.22％，在240h內釋放了57.78％，與原料藥相比，含有槲皮素的聚合物膠束具有明顯的緩釋作用。實驗結果表明，soluplus聚合物膠束可以作為緩釋制劑的載體。
從結果還可知，在240h內投藥量7mg和9mg的Qu-PMs釋放大約70％，而投藥量5mg的Qu-PMs釋放不到60％，投藥量越大，釋放越快，前期釋放較快，后期釋放變得緩慢。
緩釋制劑的體外釋放特征基本可按照下列方程并根據其相關系數來評價：
零級藥物釋放模型：y＝k1t+a1
一級藥物釋放模型：ln(100-y)＝k2t+a2
Higuchi方程(擴散方程)：y＝k3t0.5+a3
其中，y為累積釋放百分率，t為取樣時間，a1～a3為常數，k1～k3為釋放常數。將槲皮素的釋放參數按上述方程進行擬合考察藥物從聚合物膠束中的釋放機制，以相關系數r確定制劑的最佳擬合模型。擬合所得到回歸方程見表1。
表1 Qu-PMs的不同釋放模型擬合方程
注:y，累計釋放百分率；t，取樣時間；R，相關系數。
結果表明，按Higuchi方程擬合，相關系數(R2＞0.98)大，擬合效果較好，表明Qu-PMs釋放是以擴散為主的釋藥方式，藥物分子從膠束的疏水內核部位慢慢地擴散到釋放介質。由于可能藥物分子結構上羥基和疏水內核的羰基之間存在氫鍵作用，導致藥物釋放更加緩慢。投藥量不同的含有槲皮素的聚合物膠束的釋放呈類似趨勢，隨著投藥量的增加槲皮素的釋放稍有加快的趨勢。相對于槲皮素原料藥，含有槲皮素的聚合物膠束總體呈現明顯的緩釋效果。
實施例10：含有槲皮素的聚合物膠束在模擬胃腸液中的穩定性。
為了確保納米載體能將藥物輸送到吸收部位，有必要考察納米載體在不同pH值的人工模擬胃腸液中的穩定性，方法如下。
精密取9mL人工模擬胃液(不含酶)，加入1mL實施例1制備的Qu-PMs溶液，振蕩混合，放置2h，采用Zetasizer Nano ZS90粒徑儀測定Qu-PMs粒徑。
精密取9mL人工模擬腸液(不含酶)，加入實施例1制備1mL Qu-PMs溶液，振蕩混合，放置4h、6h、8h，采用Zetasizer Nano ZS90粒徑儀測定Qu-PMs粒徑。
結果如表2、圖10和圖11A-11D所示，結果表明，載藥聚合物膠束的里在不同pH值的人工模擬胃腸液中的變化是不同的。在pH1.2的人工模擬胃液中孵化2h，粒徑從61.54±0.494nm變為70.72±2.77nm；在pH7.4的人工模擬腸液中孵化4h、6h、8h，粒徑分別為60.38±0.64nm、61.07±0.47nm和61.03±0.94nm。總之，在人工模擬胃腸液中粒徑雖有變化，但是均小于100nm，這表明含有槲皮素的聚合物膠束在人工模擬胃腸液中較為穩定。這為含有槲皮素的聚合物膠束在體內的吸收打下了良好的基礎。
表2人工模擬胃腸液對Qu-PMs粒徑的影響
實施例11：含有槲皮素的聚合物膠束在模擬室溫下的穩定性。
考察Qu-PMs在模擬室溫下的穩定性。將實施例1所制備的含有槲皮素的聚合物膠束膠體溶液在室溫下放置3個月，分別在30天、60天和90天取樣，測定含有槲皮素的聚合物膠束的粒徑和包封率(方法同實施例5)。結果如圖12和表3所示，結果表明，Qu-PMs的粒徑、包封率和外觀在90天沒有出現明顯的變化，制備的Qu-PMs膠體溶液具有良好的穩定性。
表3 Qu-PMs膠體溶液在室溫下存放穩定性
實施例12：含有槲皮素的聚合物膠束的藥代動力學研究。
考察制備的Qu-PMs膠體溶液的藥代動力學性質，方法如下。
取健康的雄性比格犬6只，給藥前禁食12h，自由飲水。6只比格犬隨機分成2組：第一組以16mg·kg-1劑量的槲皮素膠束給比格犬灌胃；第二組以16mg·kg-1劑量的槲皮素混懸溶液(0.3％CMCNa)給比格犬灌胃作為對照組。給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、48h從后肢靜脈血管取血約3mL，全血置于肝素的管中，5000rpm離心l0min分離血漿，-20℃保存；準確吸取空白血漿0.1mL于1.5mL離心管中，加入甲醇0.3mL，25％鹽酸0.1mL，旋渦混合2min，于50℃水浴加熱10min，12000rpm離心10min，取上清液100μL進樣，用HPLC法測定含量。
高效液相色譜條件如下：色譜柱：Odyssil C18(250×4.6mm，5μm)，預柱(4.6×12.5mm，5μm)；流動相：甲醇：0.2％磷酸(60：40)；柱溫：35℃；檢測波長：375nm，流速：1.0mL·min-1；進樣量：100μL。
采用3P87程序對單劑量血藥濃度數據進行處理，根據血藥濃度，計算出槲皮素口服后的Cmax、Tmax、T1/2、AUC0-∞等藥代動力學參數。Qu-PMs膠體溶液的相對生物利用度按下式計算：F＝AUCQu-PMs/AUCQu×100％。兩種制劑均是以單室模型和權重為1/C2時擬合后與實際曲線最相符。
兩種制劑灌胃給藥后的平均藥時曲線見圖13。模型的藥物動力學參數和相對生物利用度結果見表4，其中，Cmax和Tmax采用實測值，其他參數由3p87軟件計算而得。比格犬體內血藥濃度結果顯示，槲皮素原料藥(Qu)組達峰時間短(Tmax為5.31±1.08h)，達峰濃度(Cmax)為5.24±1.32μg·mL-1，隨后濃度迅速下降，波動較大，至24h時已檢測不到藥物。藥物的生物半衰期(T1/2)為4.94±2.03h，藥-時曲線下面積(AUC0～∞)為37.68±16.8μg·h-1·mL-1。平均滯留時間(MRT)為7.18±2.25h，24h已基本從體內完全消除，表明其在體內代謝迅速。而含有槲皮素的聚合物膠束實驗組(Qu-PMs)口服給藥后，Tmax為7.02±2.02h，Cmax為7.56±3.28μg·mL-1，T1/2為10.81±3.7h，MRT為7.18±2.25h，AUC0～∞為107.84±54.4μg·h-1·mL-1。Qu-PMs的T1/2和MRT分別是Qu的2.19倍和3.77倍，表明聚合物膠束使藥物在體內消除變慢，滯留時間延長，以至于在48h還維持較高濃度，說明Qu-PMs在體內具有良好的緩釋特性，且生物利用度明顯提高(AUC0～∞是槲皮素的2.86倍)。實驗結果表明口服Qu-PMs溶液能明顯改善槲皮素在比格犬體內吸收過程，促進藥物的吸收，有效地提高藥物生物利用度，為槲皮素口服制劑的研究提供了理論依據。
表4槲皮素口服后的藥代動力學參數(n＝3)
注：AUC，藥時曲線下面積；T1/2，消除半衰期；Cmax，血漿峰濃度；Tmax，血漿濃度達峰時間。
以上實施例所使用的物質及其濃度只是作為示例，可理解，在其他實施例中，相應的物質及其濃度不限于實施例中所述，如兩親性聚合物膠束材料還可以選自脫氧膽酸鈉、聚氧乙烯、聚乙二醇化殼聚糖、聚維酮、仿細胞膜磷酸膽堿、聚氨基酸或聚乳酸-羥基乙酸共聚物中的一種，或者選自soluplus與這些聚合物材料中的兩種或兩種以上的混合物等。
以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。
以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
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