本發明涉及生物醫學材料領域，特別涉及一種類彈性蛋白-蠶絲纖維多孔復合材料及其在制備組織工程骨和軟骨支架材料等中的應用。

背景技術：

腫瘤切除，創傷和先天性畸形是臨床上導致骨和軟骨缺損的主要原因。目前，修復骨及軟骨缺損的金標準是自體組織移植，但自體組織移植會給患者帶來二次創傷，而且取材量有限，因此，骨和軟骨缺損修復依然是醫學界的難點。組織工程(tissue engineering,TE)技術為骨和軟骨組織缺損修復提供了有效的方法。TE的基本原理是從機體內獲得少量的細胞(又稱種子細胞)在體外培養擴增，然后使擴增的細胞粘附在生物材料上形成細胞-材料復合物，將該復合物植入機體的組織或器官病損部位，修復創傷。TE的基本要素包括種子細胞，促進細胞和組織再生的生物活性分子，以及用以維持人工組織特定形態的支架材料。

近年來，出現了多種用于骨及軟骨組織工程的材料，如靜電紡絲高分子材料，其優點是構建了類似于細胞外基質的微米或納米拓撲結構，但材料孔徑較小，不利于細胞進入材料內部從而限制了組織向內生長。其次，還有水凝膠材料，其可以方便實現細胞的包埋，但其生物惰性和不可降解性以及難以塑形性限制了它的應用。

技術實現要素：

鑒于現有骨和軟骨組織工程材料的缺點和不足，本發明的目的是提供一種類彈性蛋白-蠶絲纖維多孔復合材料，該材料用于制備組織工程骨和軟骨支架材料，具有足夠的空隙結構，降解速率與骨或軟骨再生速度匹配、并且具有一定的彈性，且不易從缺損處脫落。

本發明的技術方案如下：

一種類彈性蛋白-蠶絲纖維多孔復合材料，所述多孔復合材料的制備原料中包括類彈性蛋白多肽和蠶繭。

所述多孔復合材料的制備方法，包括以下步驟，

將蠶繭剪碎，脫膠獲得蠶絲纖維；

將類彈性蛋白多肽與蠶絲纖維進行交聯制得所述多孔復合材料。

所述脫膠的步驟包括，蠶繭剪碎后浸泡于熱的脫膠劑中，經清洗、透析除鹽后干燥得到所述蠶絲纖維；或者蠶繭剪碎后置于去離子水中，在高于大氣壓條件下煮沸后取出干燥保存。

所述脫膠劑為0.01M～1M的鹽酸溶液、0.01M～1M的氫氧化鈉溶液、0.01M～1M的尿素溶液或0.01M～1.9M的碳酸鈉溶液。

所述浸泡或煮沸的時間均為0.5～24小時。

所述交聯的步驟包括，將蠶絲纖維浸沒在質量濃度為0.01％～5％的類彈性蛋白多肽溶液中凍干成型，37℃～65℃真空干熱交聯0.5～72小時后，真空狀態下溫度緩慢降至室溫后取出得到所述復合材料。

本發明提供另外一種交聯的步驟，包括，將蠶絲纖維浸沒在質量濃度為0.01％～5％的類彈性蛋白溶液中凍干成型后浸沒在交聯用溶液中反應得到交聯材料，交聯材料經清洗、真空干燥后得到所述多孔復合材料。

所述交聯用溶液為質量濃度為0.01％～2％京尼平、質量濃度為0.01％～2％原花青素溶液，或是質量濃度為0.01％～2％戊二醛和質量濃度為0.01％～2％聚乙二醇的混合溶液。

所述反應的條件為4℃～37℃反應0.5～72h。

本發明的多孔復合材料用于制備組織工程骨或軟骨支架。

本發明的有益效果是：

1本發明的多孔復合材料易于加工成型，采用鈷60輻照滅菌后未影響材料的理化特性及生物相容性；并且本發明的復合材料對周圍組織無不良影響，能與周圍組織融為一體；

2本發明的多孔復合材料具有良好的生物相容性，受試動物無炎癥反應，無疾病或死亡，其降解產物對細胞、組織、機體無毒性；

3本發明的多孔復合材料，其降解速率與骨或軟骨再生速度匹配，能持續穩定地為細胞生長提供支撐作用；

4本發明的多孔復合材料具有一定的彈性，不易從缺損處脫落；

5本發明的多孔復合材料孔隙率高且具有通孔結構，能為細胞均勻分布和生長提供足夠的空間。

附圖說明

圖1為對比例及各實施例的掃描電子顯微鏡圖。

圖2為對比例及各實施例：(a)斷裂強力；(b)斷裂伸長率測試結果；(c)類彈性蛋白(ELP)、蠶絲纖維(S)、類彈性蛋白-蠶絲纖維凍干材料(S-ELP)和類彈性蛋白-蠶絲纖維干熱交聯材料(S-ELP-DHT)的楊氏模量測試結果。每種材料測試4個樣品，統計結果以平均值±標準差表示(***p<0.001)。

圖3(a)分別為S和S-ELP-DHT材料接種骨髓間充質干細胞后植入裸鼠皮下1個月和2個月后的大體形貌觀察圖；(b)為本發明方法制備的纖維多孔材料接種骨髓間充質干細胞后植入裸鼠皮下1個月和2個月后的顯微CT結果。

圖4分別為S和S-ELP-DHT材料接種骨髓間充質干細胞后植入裸鼠皮下1個月和2個月后的組織學染色結果(依次為蘇木精-伊紅(HE,haematoxylin and eosin)染色，蕃紅O(S-O,safranin O)染色，甲苯胺藍染色(TB,toluidine blue)，馬森三色染色(MTS,Masson’s trichrome staining)，I型膠原(Col I,collagen type I)和III型膠原(Col III,collagen type III)免疫熒光染色；標尺從上至下依次為1000μm，500μm和200μm)，在含有方框圖片的下方，所有圖片均是選取對應縱列方框內區域放大后拍攝。

圖5分別為S和S-ELP-DHT材料接種軟骨細胞后植入裸鼠皮下1個月和2個月后的形貌觀察及組織學染色結果(依次為大體觀察，蘇木精-伊紅(HE,haematoxylin and eosin)染色，蕃紅O(S-O,safranin O)染色，甲苯胺藍染色(TB,toluidine blue)，馬森三色染色(MTS,Masson’s trichrome staining)，II型膠原(Col II,collagen type II)和X型膠原(Col X,collagen type X)免疫熒光染色；標尺從上至下依次為10mm，1000μm，500μm和200μm)，在含有方框圖片的下方，所有圖片均是選取對應縱列方框內區域放大后拍攝。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

本發明在配制類彈性蛋白多肽溶液或其他溶液時或者清洗時所用去離子水可用普通生活用水、單蒸水、雙蒸水、生理鹽水或磷酸緩沖液替代。另外，本發明所用真空干燥的方法可以用加熱烘干、吸濕劑干燥、自然風干、低溫冷凍干燥、超臨界點干燥替代。

彈性蛋白(elastin)廣泛存在于軟骨、椎間盤、血管、肝臟等組織細胞外基質中，與微纖維共同組成彈性纖維(elastic fibre)，賦予組織回彈、抗張和變形伸縮的能力。依據天然彈性蛋白氨基酸序列設計合成的具有彈性蛋白特征的人工多肽，稱為類彈性蛋白(elastin-like polypeptide，ELP)(或類彈性蛋白多肽)。ELP是基于天然彈性蛋白的保守五肽串聯重復序列(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，VPGXG)制備的基因工程產物，其中Xaa可以是除了Pro以外的任一種氨基酸。

本發明類彈性蛋白多肽是利用基因工程、微生物發酵和常規蛋白質分離純化技術制備的凍干粉，具體的制取可參考專利(申請號：201110162563.7)，或者直接從西北大學生命科學學院陜西省生物技術重點實驗室購買得到。

本發明所述多孔復合材料是醫學植入物，優選支架，神經導管，疝網，維系帶，用于肌腱、氣管或支氣管的骨架，尤其前交叉韌帶，或骨以及軟骨的骨架植入。

本發明的蠶繭為家蠶蠶繭，來源不限。

實施例1

本實施例提供一種類彈性蛋白-蠶絲纖維多孔復合材料的制備方法，具體步驟為：

將B.mori蠶繭剪成碎片烘干，存于干燥器中，以去離子水為溶劑，配制1.9M的碳酸鈉溶液，加熱至100℃，將烘干的蠶繭碎片浸泡在煮沸的碳酸鈉溶液中30分鐘，取出后用去離子水超聲清洗3次(10分鐘/次)，用去離子水透析除鹽后干燥，獲得蠶絲纖維(或者也可將B.mori蠶繭剪成碎片后置于去離子水中，在高于大氣壓條件下煮沸0.5～24小時后取出得到蠶絲纖維，干燥保存)；

將10mg凍干蠶絲纖維浸沒在1mL質量濃度為1％的類彈性蛋白溶液中凍干成型，記作S-ELP，之后S-ELP于65℃真空干熱交聯(真空干熱交聯即真空、干燥及加熱同時滿足時交聯)48小時。真空狀態下緩慢降溫至室溫后將材料取出，得到多孔復合材料，記作S-ELP-DHT，4℃下密閉保存。

實施例2

本實施例提供一種類彈性蛋白-蠶絲纖維多孔復合材料的制備方法，具體步驟為：

將B.mori蠶繭剪成碎片烘干，存于干燥器中，以去離子水為溶劑，配制1M的鹽酸溶液，加熱至100℃，將烘干的蠶繭碎片浸泡在煮沸的鹽酸溶液中24小時，取出后用去離子水超聲清洗3次(10分鐘/次)，用去離子水透析除鹽后干燥，獲得蠶絲纖維；

將10mg凍干蠶絲纖維浸沒在1mL質量濃度為0.01％的類彈性蛋白溶液中凍干成型后浸沒在質量濃度0.01％京尼平溶液中，4℃反應48小時后得到京尼平交聯復合材料(記做S-ELP-Genipin)，用去離子水震蕩清洗3次，真空干燥，4℃密閉保存。

實施例3

本實施例提供一種類彈性蛋白-蠶絲纖維多孔復合材料的制備方法，具體步驟為：

將B.mori蠶繭剪成碎片烘干，存于干燥器中，以去離子水為溶劑，配制0.01M的氫氧化鈉溶液，加熱至100℃，將烘干的蠶繭碎片浸泡在煮沸的氫氧化鈉溶液中30分鐘，取出后用去離子水超聲清洗3次(10分鐘/次)，用去離子水透析除鹽后干燥，獲得蠶絲纖維；

將10mg凍干蠶絲纖維浸沒在1mL質量濃度為1％的類彈性蛋白溶液(用去離子水配制)中凍干成型，記作S-ELP，將凍干成型的S-ELP浸沒在2％原花青素溶液(用去離子水配制)中，37℃反應0.5小時后得到原花青素交聯復合材料(S-ELP-PA)，用去離子水震蕩清洗3次，真空干燥，4℃密閉保存。

實施例4

本實施例提供一種類彈性蛋白-蠶絲纖維多孔復合材料的制備方法，具體步驟為：

將B.mori蠶繭剪成碎片烘干，存于干燥器中，以去離子水為溶劑，配制1M的尿素溶液，加熱至100℃，將烘干的蠶繭碎片浸泡在煮沸的尿素溶液中30分鐘，取出后用去離子水超聲清洗3次(10分鐘/次)，用去離子水透析除鹽后干燥，獲得蠶絲纖維；

將10mg凍干蠶絲纖維浸沒在1mL質量濃度為5％的類彈性蛋白溶液中凍干成型后浸泡于含0.2％GA和0.2％PEG溶液中，4℃交聯處理72小時，取出材料，用去離子水反復沖洗，凍干，得到多孔復合材料，記作S-ELP-GA/PEG，4℃密閉保存。

對比例1

本對比例提供一種蠶絲纖維支架，該蠶絲纖維支架也可用于醫學植入物，具體制備步驟為：

將B.mori蠶繭剪成碎片烘干，存于干燥器中，以去離子水為溶劑，配制1.9M的碳酸鈉溶液，加熱至100℃，將烘干的蠶繭碎片浸泡在煮沸的碳酸鈉溶液中30分鐘，取出后用去離子水超聲清洗3次(10分鐘/次)，用去離子水透析除鹽后干燥，獲得蠶絲纖維支架，記做Silk(S)。

效果驗證

圖1分別為對比例1、實施例1中的S-ELP、實施例1—4的材料掃描電子顯微鏡觀察圖(放大500倍圖片中標尺為100μm，1000倍圖片中標尺為50μm，3000倍圖片中標尺為50μm)，依次為蠶絲纖維支架、S-ELP、S-ELP-DHT、京尼平交聯(S-ELP-Genipin)、原花青素交聯(S-ELP-PA)和戊二醛/聚乙二醇交聯(S-ELP-GA/PEG)的材料形貌。圖2分別為對比例1、實施例1中的S-ELP、實施例1-4的材料力學性能測試結果。圖3、圖4和圖5是實施例1制備的多孔復合材料S-ELP-DHT的動物實驗結果。

對比例1的蠶絲纖維雖具有三維結構，但纖維之間的交叉節點沒有力的作用，因此斷裂強力、彈性模量(楊氏模量)較低，面臨無法承重和不易塑形的問題。相較于對比例1的蠶絲纖維，實施例1中的S-ELP、實施例1—4的復合材料中的蠶絲纖維被ELP和(或)交聯劑包裹，特別是在蠶絲纖維之間的交叉點，整個交叉部位被包裹(見圖1)。在圖2中，驗證了根據圖1推測的結果，S-ELP與對比例1的蠶絲纖維相比，斷裂強力大幅提高，但由于ELP凍干后易發生脆性斷裂，韌性較低，使得其斷裂伸長率較低，并且由于ELP和蠶絲纖維是通過單純的物理吸附作用而結合，附著不均一也導致了測試結果的標準差偏大。綜合斷裂強力和斷裂伸長率的結果，實施例1—4中制備復合材料的方法(干熱交聯、京尼平交聯、原花青素交聯、戊二醛/聚乙二醇交聯)可提高單一材料(ELP或S)的力學性能，提高了單純共混材料(S-ELP)力學性能的穩定性。

將本對比例方法制備的蠶絲纖維支架以及S-ELP-DHT材料接種骨髓間充質干細胞后的復合物分別植入裸鼠皮下，分別在1個月和2個月后取出。飼養的裸鼠在試驗期內無死亡，傷口愈合良好，無感染。取出樣品形貌見圖3(蠶絲纖維支架/骨髓間充質干細胞復合物以及S-ELP-DHT/骨髓間充質干細胞復合物分別植入裸鼠皮下1個月和2個月后的形貌觀察(a)大體觀察；(b)顯微CT，標尺為2mm)。圖3中顯微CT結果表明該纖維多孔材料接種骨髓間充質干細胞后的復合物中有新生骨組織形成。對比例1中，蠶絲材料/MSCs復合物中出現了少量骨組織，通過用VG Studio軟件旋轉該樣品的三維影像，可觀察到新生骨組織大部分分布在材料的邊緣，材料內部基本無新生骨形成，大部分為結締軟組織；實施例1中，S-ELP-DHT/MSCs復合物表面被基質包裹而變得光滑，在薄薄的結締組織下有骨組織形成，可觀察到骨小梁，通過用VG Studio軟件可觀察到骨小梁的三維空間排列、密度分布和骨小梁間的連接特點。

如圖4(蠶絲纖維支架/骨髓間充質干細胞復合物以及S-ELP-DHT/骨髓間充質干細胞復合物分別植入裸鼠皮下1個月和2個月后的組織學染色結果)，圖4的組織學染色結果確認復合物成骨，且觀察到骨組織中有未降解蠶絲。可見，本發明方法制備的多孔復合能夠滿足組織工程骨支架材料的要求，能夠用于組織工程骨支架材料的構建。對比例1中，蠶絲纖維/MSCs復合物植入裸鼠皮下1個月和2個月后，在材料邊緣形的致密組織，形成新生骨組織類骨質。實施例1的S-ELP-DHT/MSCs復合物植入裸鼠皮下1和月和2個月后，在材料內部形成的致密組織，為軟骨和新生骨組織類骨質。制備的蠶絲纖維支架以及S-ELP-DHT材料接種軟骨細胞后的復合物分別植入裸鼠皮下，分別在1個月和2個月后取出。飼養的裸鼠在試驗期內無死亡，傷口愈合良好，無感染。取出樣品形貌及組織學染色結果見圖5。如圖5所示(蠶絲纖維支架/軟骨細胞復合物以及類彈性蛋白-蠶絲纖維干熱交聯復合材料(S-ELP-DHT)/軟骨細胞復合物分別植入裸鼠皮下1個月和2個月后的組織學染色結果)，該纖維多孔材料接種軟骨細胞后的復合物中有新生軟骨組織形成，且觀察到軟組織中有未降解蠶絲。可見，本發明方法制備的纖維多孔材料能夠滿足組織工程軟骨支架材料的要求，能夠用于組織工程軟骨支架材料的構建。相較于對比例1的蠶絲纖維/軟骨細胞復合物，實施例1的S-ELP-DHT/軟骨細胞復合物植入裸鼠皮下1個月和2個月后，在材料內部形成更多新生軟骨組織。