技術領域
本發明屬于醫藥科技領域，具體涉及從毛郁金的根莖中提取得到的用于治療冠心病、高脂血癥的中藥有效部位、其制備方法和從中分離有效成分的方法。
背景技術：
心臟病、惡性腫瘤、腦血管病變是當今嚴重威脅人類的生命3種疾病，上世紀90年代以來冠心病已排名我國健康殺手榜第一名，隨著我國經濟的飛速發展，人民生活水平不斷提高及生活方式、飲食結構發生的巨大改變，冠心病在我國的發病率呈不斷上升趨勢。冠心病是一種最常見的心臟病，是指因冠狀動脈狹窄、供血不足而引起的心肌機能障礙和器質性病變，故又稱缺血性心臟病(IHD)。誘發了冠心病的主要病因有：高脂血癥、高血壓、糖尿病、肥胖癥及吸煙等不良生活習慣。體內脂質代謝紊亂是冠心病最重要的起因，現代醫學研究表明氧化低密度脂蛋白膽固醇和載脂蛋白的水平和冠心病事件的危險性之間存在著密切的關系，高脂血癥與動脈粥樣硬化密切相關，是冠心病的重要誘因。冠心病患者除了有可能因冠脈阻塞引起心肌梗塞導致死亡外，心絞痛的頻繁發作也將使其學習、工作能力大大受限，嚴重時個人生活不能自理，對家庭和社會都帶來了沉重的負擔。因此，發現開發有效治療冠心病、心絞痛的藥物，以減少心血管疾病對人類健康的威脅是一項十分有意義的工作。
毛郁金為雙子葉植物姜科姜黃屬植物毛郁金(Curcuma aromatica salisb.)的根莖，分布在我國廣西、貴州等地，為地方野生藥用植物資源。毛郁金具有多種藥用功效，臨床上被習慣用于主治胸肋刺痛、經閉、風濕肩臂疼痛、跌撲腫痛等，現代藥理研究表明其具有抗炎及免疫抑制作用。但其用于治療心肌缺血、冠心病和高脂血癥的作用研究未見報道。
我們在收集民間驗方時，發現廣西南寧地區有將其與其它藥材配伍治療胸痹的臨床應用實踐，方法簡潔且療效顯著，收載的病例中不乏多名長年臥床不能行走、頭暈、全身無力、胸悶氣急、失眠的重癥患者及多年服用心血管常用藥物病情沒有明顯改善的久病患者。為了充分挖掘該藥材的臨床應用價值，對該藥材進行了深入的研究，通過對臨床經驗方進行拆方研究，對方中藥材的不同有效部位進行藥效篩選，應用大量的公認動物模型進行藥效學驗證，篩選出目標有效部位和有效成分，藥理研究證實毛郁金倍半萜類化合物能明顯降低受損心肌細胞中LDH和CK的水平、減少心肌梗死范圍，保護受損心肌，能有效治療冠心病，降低血液中的血脂水平，改善預后，有可預見的臨床獲益。
技術實現要素：
本發明通過對毛郁金的不同有效部位進行藥效篩選，發現了其用于治療目標冠心病和高脂血癥有效部位，通過對有效部位中倍半萜類成分進行全面深入地分析研究，從中分離出莪術二醇、原莪術醇、莪術二酮、zedoarondiol等四個倍半萜單體有效成分，經理化常數及波譜分析，它們的結構式分別如下：
在本發明的第一方面，提供了一種用于治療冠心病、高脂血癥的中藥有效部位，其特征在于：以姜黃科植物毛郁金(Curcuma aromatica salisb.)的干燥根莖為藥用部位，藥用部位經有機溶劑提取，提取物經分離、純化得到的含有倍半萜類成分的有效部位，有效部位中倍半萜類成分的含量(質量百分比)大于50％。
具體的，倍半萜類成分中的主要化合物為莪術二醇、原莪術醇、莪術二酮和zedoarondio，其中莪術二醇在有效部位中的含量為10～40％，原莪術醇在有效部位中的含量為15～35％，莪術二酮在有效部位中的含量為10～30％，zedoarondiol在有效部位中的含量為5～30％。
本發明的第二方面提供了一種中藥有效部位的制備方法，其特征在于包括如下步驟：
(1)毛郁金藥用部位加2～12倍(重量比)濃度為50～95％的乙醇、甲醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇或乙酸乙酯中的一種或任意幾種混合溶劑進行回流提取，提取液回收溶劑，濃縮得毛郁金粗提物；或將毛郁金藥用部位粉碎過篩后，以乙醇為夾帶劑，置超臨界CO2萃取，萃取物即為毛郁金粗提物；
(2)毛郁金粗提物用2～18倍量的水飽和正丁醇、乙酸乙酯或石油醚-乙酸乙酯萃取，萃取液回收溶劑，濃縮得毛郁金有效部位。
本發明還提供了另一種中藥有效部位的制備方法，其特征在于包括如下步驟：
(1)毛郁金藥用部位加2～12倍(重量比)濃度為50～95％的乙醇，或甲醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、乙酸乙酯中的一種或任意幾種混合溶劑進行回流提取，提取液回收溶劑，濃縮得毛郁金粗提物；或將毛郁金藥用部位粉碎過篩后，以乙醇為夾帶劑，置超臨界CO2萃取，萃取物即為毛郁金粗提物；
(2)將毛郁金粗提物經大孔樹脂吸附，分別用1～3倍柱體積的水、1～3倍柱體積的濃度為10～30％的乙醇沖洗樹脂柱，棄去水及稀醇洗脫液，再用80～95％的乙醇解析樹脂吸附的有效成分，分段收集80～95％的乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮得毛郁金有效部位。
優選的，大孔樹脂為苯乙烯型多孔性吸附樹脂，極性為弱極性或中等極性；例如可以選用D101、HPD-100、HPD-300、HPD-450、HPD-5000或H103型大孔樹脂。
本發明的第三方面提供了一種從毛郁金有效部位中分離有效成分的方法，包含以下步驟：
(1)制備得到毛郁金有效部位；
(2)將毛郁金有效部位經硅膠柱層析，洗脫液為8-20:1的石油醚-乙酸乙酯體系，收集洗脫液得莪術二酮粗品；莪術二酮粗品用制備型高效液相色譜法純化得莪術二酮精制品；
(3)將洗脫液更換為4-7:1的石油醚-乙酸乙酯體系，收集洗脫液得到zedoarondiol粗品，zedoarondiol粗品用制備型高效液相色譜法純化得zedoarondiol精制品；
(4)將洗脫液更換為3-2:1的石油醚-乙酸乙酯體系，收集洗脫液得到第三流分，收集所述第三流分通過制備型高效液相色譜分離純化可得莪術二醇和原莪術醇。
有益效果：
首次發現莪術二醇、原莪術醇、莪術二酮和zedoarondiol及毛郁金有效部位均有顯著治療心肌缺血作用，可明顯減小缺血所致大鼠心肌損傷心肌梗塞區范圍，對冠脈結扎大鼠心肌缺血損傷具有明顯的保護作用，對冠心病和高脂血癥也有很好的療效。
具體實施方式：
實施例1：
⑴、毛郁金根莖去泥沙、須根，洗凈，切片，曬干，制成藥用部位；
⑵、取毛郁金根莖飲片1800g，加6倍量80％的乙醇回流得取兩次，合并兩次提取液，濾過，濾過液回收乙醇，減壓濃縮至相對密度為1.10(45℃)左右，得毛郁金粗提物；
⑶、粗提物用2倍量的水飽和正丁醇萃取6次，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇，濃縮，真空干燥得有效部位121g。
實施例2：
⑴、毛郁金根莖去泥沙、須根，洗凈，切片，曬干，制成藥用部位；
⑵、取毛郁金根莖飲片2000g，加6倍量75％的乙醇回流得取兩次，合并兩次提取液，濾過，濾過液回收乙醇，減壓濃縮至相對密度為1.05～1.10(45℃)左右，得毛郁金粗提物；
⑶、粗提物用3倍量的乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯萃取液，減壓回收乙酸乙酯，濃縮，真空干燥得有效部位116g。
實施例3：
⑴、毛郁金根莖去泥沙、須根，洗凈，切片，曬干，制成藥用部位；
⑵、取毛郁金根莖飲片2000g，加6倍量75％的乙醇回流得取兩次，合并兩次提取液，濾過，濾過液回收乙醇，減壓濃縮至相對密度為1.05～1.10(45℃)左右，得毛郁金粗提物；
⑶、粗提物用3倍量的由石油醚：乙酸乙酯(體積比為3～20：1)組成的混合溶劑萃取，萃取6次，合并由石油醚：乙酸乙酯萃取液，減壓回收溶劑，濃縮，真空干燥得有效部位105g。
實施例4
⑴、毛郁金根莖去泥沙、須根，洗凈，切片，曬干，制成藥用部位；
⑵、取毛郁金根莖飲片2000g，加6倍量75％的乙醇回流得取兩次，合并兩次提取液，濾過，濾過液回收乙醇，減壓濃縮乙醇至盡，得毛郁金醇提液；
⑶、毛郁金醇提液經D101型大孔樹脂吸附，樹脂柱子徑高比為1：8，上樣量為藥材：樹脂＝3：1，樹脂柱子先分別用2倍柱體積的水、2倍柱體積的濃度為30％的乙醇沖洗樹脂柱，棄去水及稀醇洗脫液；
⑷、樹脂柱子再用4倍柱體積90％的乙醇解析樹脂吸附的有效成分，分段收集乙醇洗脫液，洗脫液回收乙醇，濃縮，真空干燥得有效部位102g。
實施例5：
⑴、毛郁金根莖去須根、泥沙，洗凈，切片，曬干，制成藥用部位；
⑵、取毛郁金根莖飲片粉碎，過10目篩，稱取5Kg置超臨界CO2萃取裝置的萃取釜中；
⑵、以乙醇為夾帶劑(500g)，萃取壓力和超臨界CO2流體溫度為35MPa和50℃，分離釜Ⅰ壓力和溫度為8MPa和50℃，分離II壓力和溫度為5MPa和35℃，進行超臨界萃取，循環萃取1.5～2小時，從分離釜Ⅰ、分離釜II出料口放出萃取物。
⑶、超臨界CO2萃取物60℃、-0.09MPa減壓除去乙醇至盡，用2倍量的由石油醚：乙酸乙酯(體積比為3～20：1)組成的混合溶劑萃取4次，合并萃取液，減壓回收溶劑，濃縮得有效部位415g。
實施例6：毛郁金倍半萜單體化合物的工藝制法：
⑴、毛郁金根莖去泥沙、須根，洗凈，切片，曬干，制成藥用部位；
⑵、取毛郁金根莖飲片3000g，加6倍量80％的乙醇回流得取兩次，合并兩次提取液，濾過，濾過液回收乙醇，減壓濃縮至相對密度為1.10(45℃)左右，得毛郁金粗提物；
⑶、粗提物用2倍量的水飽和正丁醇萃取6次，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇，濃縮，真空干燥得有效部位204g。
⑷、取有效部位204g，與適量硅膠拌勻，干法上柱，經硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯體系洗脫，先用石油醚-乙酸乙酯(按20:1)洗脫，得莪術二酮粗品洗脫液，洗脫液回收溶劑至盡，再用制備液相(流動相為50％的乙腈-水溶液)制備得莪術二酮精制品5.7g，純度99.8％。硅膠柱層析再用石油醚-乙酸乙酯(按7:1)洗脫，得zedoarondiol粗品洗脫液，洗脫液回收溶劑至盡，再用制備液相(流動相10％-15％的乙腈-水溶液)制備得zedoarondiol精制品2.3g，純度98.5％。硅膠柱層析再用石油醚-乙酸乙酯(按2:1)洗脫，得莪術二醇及原莪術醇粗品洗脫液，洗脫液回收溶劑至盡，用制備液相(流動相15％-50％的乙腈-水溶液)制備得莪術二醇精制品2.5g，純度97.8％，經HPLC制備分離莪術二醇后的母液合并，回收溶劑后，再用制備液相(流動相30％的乙腈-水溶液)制備可得原莪術醇精制品6.1g，純度98.9％。
實施例7
對四種化合物進行理化常數及波譜學分析：對化合物莪術二酮采用LC-MS、1H-NMR、13C-NMR、Dept、1H-1H COSY、13C-1H COSY鑒定手段，得分子式C15H24O2，如化學結構式所示。對化合物zedoarondiol采用LC-MS、1H-NMR、13C-NMR、Dept、1H-1H COSY、13C-1H COSY鑒定手段，得分子式C15H24O3，如化學結構式所示。對化合物莪術二醇采用LC-MS、1H-NMR、13C-NMR、Dept、1H-1H COSY、13C-1H COSY鑒定手段，得分子式C15H22O3，結構式如化學結構式所示。對化合物原莪術醇采用LC-MS、1H-NMR、13C-NMR、Dept、1H-1H COSY、13C-1H COSY鑒定手段，得分子式C15H22O2，如化學結構式所示。其中莪術二酮的13C-NMR為13C NMR(400MHz,CDCl3)δ16.57,18.54,19.86,21.12,26.41,30.00,34.05,44.24,46.81,53.61,55.92,129.90,131.59,211.14,214.37；zedoarondiol的13C-NMR為13C NMR(400MHz,CDCl3)δ20.17,21.16,22.06,22.21,22.38,28.47,39.67,51.83,56.15,60.61,71.28,78.49,135.57,139.18,202.55；莪術二醇的13C-NMR為13C NMR(400MHz,CDCl3)δ21.93；22.00；22.71；24.09；27.19；36.98；37.16；60.94；83.19；86.44；127.97；132.89；143.30；151.03；194.09；原莪術醇的13C-NMR為13C NMR(400MHz,CDCl3)δ20.35；21.52；22.49；23.39；26.02；27.75；39.04；49.62；53.01；79.39；128.27；135.40；135.88；154.22；198.26。碳譜數據與核磁共振碳譜數據庫(上海微譜信息技術有限公司)中收錄的化合物碳譜一致。
實施例8：有效部位中倍半萜類成分的含量檢測分析
(一)、儀器與試劑
Dionex UltiMate 3000高效液相色譜儀，LPG-3400SD高壓泵，WPS-3000(RS)自動進樣器，TCC-3x00(RS)柱溫箱，VWD-3x00(RS)紫外檢測器，Chromeleon 6.8工作站。
乙腈，TEDIA公司，色譜純；水為Hi-Tech水純化系統自制的去離子水(18.2MΩ)。
對照品：莪術二酮、zedoarondiol、莪術二醇、原莪術醇
(二)、溶液的制備
對照品溶液的制備：精密稱取莪術二酮、zedoarondiol、莪術二醇、原莪術醇自制對照品適量，加甲醇溶解制成每lmL含莪術二酮、zedoarondiol、莪術二醇、原莪術醇約100μg的對照品溶液。
(三)、供試品溶液的制備：精密稱取制備的有效部位適量，加甲醇溶解制成每lmL含約2mg的供試品溶液。
(四)、色譜條件：
采用反相高效液相色譜SymmetryC18(5μm，250×4.6mm)，以水為流動相A，以乙腈為流動相B，流速1.0mL/min，梯度洗脫程序見表1，檢測波長230nm，柱溫25℃。
表1梯度洗脫程序
(五)、測定法：精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μ1，注入液相色譜儀，測定，分別計算四種倍半萜類化合物的含量，四種倍半萜類化合物的含量的和為有效部位的含量。
(六)、含量測定結果：見下表2
表2不同制備方法得到的有效部位中倍半萜類成分的含量
注：以上有效部位中倍半萜類成分主要為莪術二酮、zedoarondiol、莪術二醇、原莪術醇四種。
結論：以上檢測結果表明，本發明工藝具有實際意義。
藥效實施例：
在本發明還提供了用5種方法制備的毛郁金有效部位、莪術二酮、zedoarondiol、莪術二醇和原莪術醇在制備防治心肌缺血、冠心病和高脂血癥中的應用。
藥理實驗表明：莪術二醇、原莪術醇、莪術二酮、zedoarondiol及毛郁金有效部位對SD大鼠冠狀動脈結扎所致的實驗性心肌缺血模型有顯著的治療作用，通過測定模型動物的心肌梗塞范圍及CK和LDH證實，藥物可明顯減小缺血所致大鼠心肌損傷心肌梗塞區范圍，對冠脈結扎大鼠心肌缺血損傷具有明顯的保護作用。
灌胃給予毛郁金有效部位能明顯降低高脂血癥家兔肝臟和血清TG、TC值，降低HDL-C、LDL-C，升高H/L，可改善其肝臟脂肪變性程度，各試驗組動物的肝臟脂肪變性程度明顯減輕，其降脂作用與辛伐他汀基本相當。
(一)、降脂實驗：
1、供試品：毛郁金有效部位(來源于上海捌加壹醫藥科技有限公司)
2、陽性對照品Ⅰ：復方益肝靈片(來源于江蘇中興藥業有限公司)
批號：130303161；規格：0.32g/片，每片含水飛薊素21mg
3、陽性對照品II：辛伐他汀片(來源于杭州默沙東制藥有限公司)
批號：120333；規格：20mg/片×7片/盒
4、陰性對照：CMC-Na(國藥集團化學試劑有限公司)
批號：F20091021(用試驗用水配制成0.5％溶液使用)
5、實驗動物
種系：新西蘭兔(上海生旺實驗動物養殖有限公司)
許可證號：SCXK(滬)2012-0007；合格證號：200700071847
6、實驗方法
雄性新西蘭大白兔100只，初始體重：2,188.4±227.9g，適應性喂養2周后，除正常對照組飼喂標準飼料外，其余動物每日上午定量給予高脂飼料150g。連續飼喂至33天后，隔夜禁食，耳緣靜脈采血分離血清測定TG、TC、HDL-C、LDL-C，以確認造模成功與否。
確認模型成功后，剔除血脂水平不合格的動物，根據上述指標和體重將模型動物均衡分至模型對照組，方法1～5制得的有效部位給藥組(相當10g生藥/kg)，復方益肝靈片組(30mg/kg)，辛伐他汀組(3mg/kg)，于分組后開始給藥，空白對照組和模型組灌胃給予4mL/kg空白溶劑，其余組灌胃給予相應的樣品，每天一次，連續給藥至陽性對照組出現明顯降脂作用。給藥期間不停高脂飼料。
試驗期間每周稱一次體重，根據體重調整給藥劑量。給藥2周后，動物隔夜禁食不禁水12h，耳靜脈采血，離心分離血清，檢測TG、TC、HDL-C、LDL-C值，并計算HDL-C/LDL-C比值；給藥3周后，再次隔夜禁食采血測定上述指標，采血后第二天家兔用3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔麻醉，解剖取肝臟400mg，加脂質提取液(正庚烷：異丙醇＝2：3.5)4mL勻漿，振蕩提取脂質，離心沉淀后取上清液測定肝臟TG和TC。
7、統計學處理：所有計量數據均以表示，數據的統計學分析用t檢驗；
8、實驗結果
各實驗組家兔肝脂質含量實驗結果見表3。結果顯示，模型組肝組織TG、TC含量均明顯高于正常對照組(p<0.01)，說明造模成功。毛郁金有效部位各組可明顯降低肝組織TG和TC含量。
各實驗組家兔血清TG、TC實驗結果見表4。結果顯示，給藥前，各給藥組和模型組的血清TG、TC值非常顯著高于正常對照組(p<0.01)；而各給藥組的血清TG、TC值與模型組基本一致，提示造模成功，分組均勻。
各實驗組家兔HDL-C、LDL-C含量和比值(H/L)實驗結果見表5。結果顯示，給藥前，各實驗組血清HDL-C和LDL-C含量均非常顯著高于正常對照組(p<0.01)；H/L比值非常顯著低于正常對照組(p<0.01)；各給藥組的血清HDL-C、LDL-C和H/L比值與模型組基本一致，提示模型成功動物分組較為均勻。給藥后第2周和第3周，模型組的HDL-C、LDL-C非常顯著高于正常組(p<0.01)，H/L非常顯著低于正常組(p<0.01)。
9、結論
以上實驗結果提示，給藥3周結束后，五種方法制備的毛郁金有效部位(相當10g生藥/kg)和復方益肝靈片30mg/kg灌胃給藥能明顯降低高脂血癥家兔肝臟和血清TG、TC值，降低HDL-C、LDL-C，升高H/L，可改善肝臟脂肪變性程度，且毛郁金有效部位各試驗組動物的肝臟脂肪變性程度均減輕。辛伐他汀組3mg/kg灌胃給藥可明顯降低高血脂家兔血清TG、TC、HDL-C、LDL-C值，升高H/L，對肝臟TG、TC亦有明顯降低作用。結果提示在本模型上，毛郁金有效部位可降低動物血脂水平，其降脂作用與辛伐他汀基本相當。
表3.各實驗組家兔肝臟組織脂質含量結果
*p<0.05；**p<0.01，與模型組比較；#p<0.05；##p<0.01，與復方益肝靈片組比較；△p<0.05；△△p<0.01，與辛伐他汀組比較
表4.各實驗組家兔血脂含量結果
*p<0.05；**p<0.01，與模型組比較；#p<0.05；##p<0.01，與復方益肝靈片組比較；△p<0.05；△△p<0.01，與辛伐他汀組比較。
表5.各實驗組家兔血清高低密度脂蛋白膽固醇含量和比值結果
*p<0.05；**p<0.01，與模型組比較；#p<0.05；##p<0.01，與復方益肝靈片組比較；△p<0.05；△△p<0.01，與辛伐他汀組比較。
(二)、對心肌缺血再灌注大鼠的治療作用
1、受試物
用本發明方法一、方法二、方法三、方法四、方法五制備的毛郁金有效部位(以下簡稱方法一制、方法二制、方法三制、方法四制、方法五制)及用本發明方法六制備的四個倍半萜單體化合物莪術二醇、原莪術醇、莪術二酮、zedoarondiol，臨用時以CMC-Na溶液配制成所需濃度的藥液，供動物給藥用。
2、陽性藥
地奧心血康膠囊(以下簡稱心血康)：成都地奧制集團有限公司生產，規格100mg/粒，批號1306022。臨用時以CMC-Na溶液配制成所需濃度的藥液供動物給藥。
單硝酸異山梨酯片(以下簡稱單硝酯)，商品名欣康，魯南貝特制藥有限公司生產，規格20mg，批號07130313。臨用時研碎，以CMC-Na溶液配制成相應濃度的藥液供大鼠灌胃給藥用。
3、藥盒與試劑
乳酸脫氫酶(LDH)分析試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司生產，批號130521。
大鼠肌酸激酶同工酶(CK-MB)酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒，Bio-Swamp公司產品，批號201310。
大鼠乳酸脫氫酶(LDH)酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒，Bio-Swamp公司產品，批號201310。
水合氯醛，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號20120110。
4、動物
SD大鼠，SPF級，雄性，253.9±10.4(230～276)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產許可證號SCXK(京)2012-0001。
5、模型制備
大鼠，在腹腔注射12％水合氯醛360mg/kg全麻的條件下，仰臥位固定于手術臺上。胸部前外側手術野去毛，常規消毒。切開皮膚、肌層，肌層行荷包縫合，左側第四肋間隙開胸，以環形鉤拉出心臟。在左心耳下方3～4mm處的冠脈前降支位置，以6/0無損傷絲線穿線，并置直徑1.6mm尼龍線，連同冠狀動脈前降支一起結扎，另一端留于體外備用。將心臟放回胸腔，排空胸腔內空氣，關閉胸腔(假手術組動物僅在相應冠脈位置穿線，不進行結扎,其它手術過程與結扎動物相同)。結扎30min后小心移除尼龍線進行再灌注。縫合肌層及皮膚，肌注青霉素，每天一次，連續3天。
與正常II導聯心電圖(ECG-II)比較，冠脈結扎后10min，ECG-II的ST段抬高0.2mV以上者作為缺血成功；再灌注后10min，ECG-II中抬高的ST段下降30％以上者作為再灌注成功。不滿足上述缺血或缺血再灌注標準的動物表明造型不成功，從實驗中剔除。
6、分組及給藥
選取造型成功的動物隨機分為13組，每組10只。分別為假手術組、模型對照組、受試藥物組，以及中藥陽性藥組、西藥陽性藥組。
造型成功后30min開始灌胃給藥，每天1次，連續7天；每次給藥體積為10ml/kg。假手術組和模型對照組給予溶劑對照液(CMC-Na溶液)；受試藥組分別給予用本發明方法一、方法二、方法三、方法四、方法五制備的毛郁金有效部位及用本發明方法六制備的四個倍半萜單體化合物莪術二醇、原莪術醇、莪術二酮、zedoarondiol，劑量(按有效部位及單體有效成分的收率折算成相當的生藥量)為9g生藥/kg及西藥單硝酸異山梨酯片，劑量為0.0062g(片重)/kg(相當于臨床等效量)；心血康0.144g/kg(相當于臨床等效量)。
7、梗死范圍測量
實驗結束后，取大鼠心臟，以生理鹽水沖洗，-20℃進行冷凍處理。在結扎線下將心臟均勻切成2mm厚的切片，置2％TTC 37℃染色10min，經病理圖像分析系統測定梗死區占左心室的百分比。
8、血清心肌酶檢測
實驗結束后，大鼠經腹主動脈取血，4℃，3000rpm×10min離心，取上層血清，Elisa法測定LDH、CK-MB。
9、統計學處理
所有數據均表示為均數±標準差表示，給藥前后配對或兩組間比較用student’s t-test，P<0.05為差異有統計學意義。
表6對大鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌梗死范圍的影響(n＝10)
注：1.與假手術組比較：△△△P<0.001；2.與模型組比較：*P<0.05；3.與陽性藥組比較：P>0.05.
10、對血清心肌酶的影響
模型組缺血再灌注后7天，血清LDH活性均明顯升高。5種方法制備的毛郁金有效部位及分離的四個單體倍半萜類化合物(相當于9g生藥/kg)治療7d后，與模型組相比，均能顯著降低LDH(P<0.05)。結果見表7。
表7對大鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌酶的影響(n＝10)
實驗結果表明：藥物可明顯減小缺血所致大鼠心肌損傷心肌梗塞區范圍，對冠脈結扎大鼠心肌缺血損傷具有明顯的保護作用。