本發明涉及生物組織工程領域，特別是涉及一種梯度組織工程支架制作方法。

背景技術：

組織工程是是一門以細胞生物學和材料科學相結合，進行體外或體內構建組織或器官的新興學科。通過細胞、支架結構與生長因子的混合培養，制造適用于修復人體組織或器官缺損的移植材料，可以實現缺損部位結構的再生和功能的重建。用于人體內的組織工程技術對材料生物特性、物理化學特性等方面提出了較高的要求，其中骨和軟骨組織的重建對力學強度的要求最高，也對微觀組織形態提出了一定的要求。

骨和軟骨是人體中較為重要的承力組織，具有力學強度高，結構非均質的特征。復雜的非均質結構，或稱為梯度結構，提供了非均勻的力學強度，適于支撐人體的重量和運動導致的應力。軟骨組織具有優秀的梯度、非線性、粘彈性的力學性能；骨組織則具備皮質骨-松質骨的二級結構，在減輕重量的基礎上具有極高的力學強度。在骨和軟骨的組織工程重建中，如修復材料力學強度過弱，則難以承受恢復過程中的體內應力，導致材料變形、修復效果變差；如力學強度過強，也可能出現應力遮擋效應，令修復材料以外的正常組織承擔應力減弱，造成骨質疏松等負面影響。

因此，仿生的，非線性梯度化的力學強度，對于組織工程支架的設計制造提出了苛刻和重要而要求。此外，微觀組織形態的仿生化，對于重建過程中的細胞長入具有積極意義，也具有優化設計的價值。

生物3D打印(又稱增材制造、快速成形)是一種新興、靈活的組織工程技術，可以在不產生明顯分界面的前提下實現分級/梯度軟骨支架的制造。3D打印技術的核心是，依據離散/堆積成形原理的數字化成形——即在計算機的控制管理下，根據零件的CAD模型，通過材料的精確堆積，制造原型或零件，在產品開發與設計、快速工具(Rapid Tooling)、三維復制和臨床醫學領域均有應用。

定向冷凍是一種控制流體解凍時的溫度場實現定向結晶，以令冷凍產物具有定向微觀結構的加工方法。與冷凍干燥技術結合，可以獲得具有定向微觀組織的生物支架。

軟骨組織具有結構較為簡單、組織內無血管等有利條件，在組織工程研究中發展較快，具有較早進入臨床應用的前景。然而，常見的軟骨支架多為均質或準均質結構，力學強度的仿生性不夠。多篇論文及專利CN201410097482中介紹了具有梯度化結構的軟骨支架，但其制作方法多為分層粘接、分層澆鑄或多材料打印，具有工藝繁瑣，粘接/澆鑄界面強度較差，難以進行定量力學強度優化等問題。

技術實現要素：

本發明的主要目的在于針對現有技術的不足，提供一種梯度組織工程支架制作方法。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種梯度組織工程支架制作方法，包括采用生物高分子材料和水凝膠，利用低溫沉積3D打印機打印三種網格，形成分層結構，分別為對應于淺層切向纖維的切向型網格、對應于中層過渡纖維的均勻網格以及對應于底層法向纖維的法向型網格，形成網格支架，其在力學強度上具有抗壓力從淺到深逐漸增加，抗剪力從淺到深逐漸降低的特征；打印完后對網格支架進行第一次冷凍干燥，之后在成形的網格支架孔隙內灌入dECM溶液，并進行第二次冷凍干燥，除去dECM中的溶劑成分，獲得具有接近正常軟骨定向微觀組織的復合的梯度組織工程支架。

進一步地：

所述生物高分子材料為PLGA在1，4-二氧六環溶劑中的分散系，所述水凝膠為天然軟骨脫細胞基質dECM在乙酸中的分散系、膠原、殼聚糖或明膠，優選地，PLGA的粘度1.7，濃度0.15g/ml；優選地，打印材料在-20℃下擠出，并進行8h的第一次冷凍干燥。

打印時，通過以下任一者或多者來改變網格的壓縮和剪切力學強度：(1)提高或降低單層網格的疏密程度；(2)增加或降低單一方向連續打印的網格層數；(3)改變不同方向網格的層數比例。

打印使得所述切向型網格的剪切模量略高于真實軟骨，法向型網格的壓縮模量略高于真實軟骨，其余各模量則與真實軟骨相當或略低。

還包括力學測量確定各層的力學強度，其中針對正面承壓的軟骨或骨缺損修補的需求，對網格支架各層上下加載壓縮或剪切載荷；針對側面承壓的軟骨或骨缺損修補的需求，將網格支架繞水平軸旋轉90度再進行相應壓縮或剪切載荷的加載。

三種分層網格在組合時近似于等截面疊加。

將三種分層網格相互間進行固接約束，邊界和加載條件為周邊無約束，上下使用剛體壓頭的壓縮或剪切，調節三種網格在厚度方向的分布比例，通過力學仿真的形變量，反比例換算復合支架力學強度。

對于正面承壓復合支架，通過下式確定三層的分層比例：

對于側面承壓復合支架，通過下式確定三層的分層比例：

E＝aE₁+bE₂+cE₃

其中E為期望達到的真實軟骨力學強度、E1、E2、E3為各分層的力學強度，a+b+c＝1。

第二次冷凍時，將灌入dECM的網格支架置放入定向冷凍匣進行定向冷凍，所述定向冷凍匣具有高熱導率部分優選紫銅，和低熱導率部分優選PLA，在外圍具有用PLA隔開的隔熱空氣層。

在dECM和PLGA溶液中加入水溶性致孔劑，在加工完畢后，通過溶解除去致孔劑，以獲得微觀孔徑，實現連通度高的分級孔隙結構；優選地，在dECM中加入特定營養物質，如誘導軟骨形成的IGF-1蛋白等，以促進軟骨組織的形成。

本發明的有益效果：

本發明的梯度組織工程支架制作方法，從力學強度和微觀組織結構出發進行工藝設計，實現了梯度復合支架的一次性成形，并顯著優化了仿生效果，可以很好地進行定量力學強度優化，本發明提出的具有梯度結構的組織工程支架制造工藝，能更好地促進組織再生，提供具有非均質梯度特征的組織工程支架，適用于臨床應用和研究。

本發明通過3D打印和定向冷凍技術的結合，實現了一次性成形具有梯度結構的軟骨支架，便于進行力學強度的仿生優化，且具有宏觀網格和微觀組織的二級仿生結構。推廣地，這種工藝手段也可以用于制造其他具有力學強度要求的組織工程支架，包括但不限于骨組織和骨-軟骨復合組織。

附圖說明

圖1為本發明實施例軟骨打印的三種網格設計思想，提高或降低單層網格的疏密程度(101)；增加或降低單一方向連續打印的網格層數(102)；改變不同方向(通常為橫縱兩向)網格的層數比例(103)；

圖2為真實軟骨的梯度組織結構示意圖；

圖3為本發明實施例三種網格結構示意圖，分別為強調切向的切向型網格(301)，均勻網格(302)和強調法向的法向型網格(303)；

圖4為本發明實施例針對正面承壓的軟骨或骨缺損修補的需求，作為正面承壓復合支架(401)，對網格各層上下加載壓縮或剪切載荷，以及針對側面承壓的軟骨或骨缺損修補的需求，作為側面承壓復合支架(402)，將網格支架繞水平軸旋轉90度再進行相應壓縮或剪切載荷的加載；

圖5為本發明實施例將灌入dECM的網格置放入定向冷凍匣進行定向冷凍的示意圖；

圖6為本發明實施例制作的實際復合支架的切片SEM觀察驗證圖。

具體實施方式

以下對本發明的實施方式作詳細說明。應該強調的是，下述說明僅僅是示例性的，而不是為了限制本發明的范圍及其應用。

參閱圖1至圖6，在一種實施例中，一種梯度組織工程支架制作方法，包括采用生物高分子材料和水凝膠，利用低溫沉積3D打印機打印三種網格，形成分層結構，分別為對應于淺層切向纖維的切向型網格、對應于中層過渡纖維的均勻網格以及對應于底層法向纖維的法向型網格，形成網格支架，其在力學強度上具有抗壓力從淺到深逐漸增加，抗剪力從淺到深逐漸降低的特征；打印完后對網格支架進行第一次冷凍干燥，之后在成形的網格支架孔隙內灌入dECM溶液，并進行第二次冷凍干燥，除去dECM中的溶劑成分，獲得具有接近正常軟骨定向微觀組織的復合的梯度組織工程支架。

3D打印使用的材料為生物高分子材料和水凝膠，具有較好的生物活性，對進一步臨床研究有積極意義。

在打印軟骨的實施例中，材料優選為：所述生物高分子材料為粘度1.7，濃度0.15g/ml的PLGA溶質，在1，4-二氧六環溶劑中的分散系。此外，溶質也可選擇PCL等其他生物高分子材料，溶劑也可選擇三氯甲烷等其他常見有機溶劑。所述水凝膠為天然軟骨脫細胞基質dECM在乙酸中的分散系。此外，水凝膠也可選擇膠原、殼聚糖、明膠等其具有生物活性的材料。

在打印骨的實施例中，材料優選為：羥基磷灰石、磷酸三鈣等鈣磷陶瓷材料，與上述生物高分子材料的混合溶液，陶瓷與高分子材料的質量比為1～10:1。該配比參考自專利文獻CN201210344908。水凝膠具體可采用前述材料。

打印骨軟骨復合支架時，優選采取雙噴頭打印。

在制造軟骨的實施例中，實現工藝路徑如下：

利用低溫沉積3D打印機打印三種網格，材料選取為適用于生物實驗，且具備一定力學強度的PLGA和1，4-二氧六環溶液，-20℃下擠出，并進行8h冷凍干燥。獲得的支架具有常溫下的穩定性、與真實軟骨數量級接近的力學強度和宏觀/微觀上的孔隙率，有利于細胞長入。之后，在成形的網格支架孔隙內灌入dECM溶液，并進行第二次冷凍干燥，獲得生物性能改良的雙材料支架。

優選地，在打印中，可以通過以下的路徑編程設計來改變網格設計的壓縮和剪切力學強度，以供優化使用，如圖1：

提高或降低單層網格的疏密程度(101)；增加或降低單一方向連續打印的網格層數(102)；改變不同方向(通常為橫縱兩向)網格的層數比例(103)。

在進一步優選中，針對正面承壓的軟骨或骨缺損修補的需求，考慮到真實軟骨具有如圖2所示的梯度組織結構，包括淺層切向纖維201，中層過渡纖維202，底層法向纖維203，箭頭定性表示纖維走向；力學強度上，具有抗壓力從淺到深逐漸增加，抗剪力從淺到深逐漸降低的特征。故，設計如圖3所示的三種網格結構，分別為強調切向的網格301(簡稱切向型網格)，均勻網格302和強調法向的網格303(簡稱法向型網格)，并通過路徑編程打印復合的梯度支架304。對應于圖3中，三種網格結構分別采用多橫少縱周期交錯的結構，橫縱均勻長周期交錯的結構，橫縱均勻短周期交錯的結構。

并為了進一步進行力學強度優化，通過分層打印和力學測量確定各層的關鍵力學強度E1、E2、E3，可以為抗壓模量或剪切模量；并通過打印路徑設計，規劃各層的厚度占比a、b、c(a+b+c＝1)，如圖4的401所示。進行力學設計和優化時，可直接上下加載壓縮或剪切載荷。

在另一種優選方案中，針對側面承壓的軟骨或骨缺損修補的需求，同樣設計如圖3所示的三種網格結構，并打印復合支架304，但在進行力學設計和優化時，將網格繞水平軸旋轉90度再進行相應壓縮或剪切載荷的加載，各層厚度占比轉為寬度占比a、b、c，如圖4的402。

優選地，對上述三種網格進行力學強度測量和局部優化設計，令網格301的剪切模量略高于真實軟骨，網格303的壓縮(楊氏)模量略高于真實軟骨，其余各模量則與真實軟骨相當或略低，以通過三種網格在復合支架中所占比例的調節，使復合支架的力學性能接近真實軟骨。

如上所述的工藝流程，既可以單獨打印特征固定的均質網格支架，如網格301；也可以通過路徑編程，在一次打印中成形各部分分別具有301、302、303特征的復合梯度支架304，而無需其他附加工藝。

由此，實現了均質支架和非均質支架具有相同的制造流程，均可一次性制造成形，省去了多材料打印、分步粘接等工藝中的切換材料和粘接步驟。因此，可以改善分級界面性能，避免因粘接和分層鑄造出現的力學強度缺陷或力學性能突變，對于力學強度的定量研究和定量優化具有積極意義。

對于骨和骨-軟骨復合組織的制造而言，只需針對皮質骨和松質骨的特性，選用適宜的分層網格結構與打印材料。

力學優化工藝路徑如下：

對用所述工藝獲得的分層網格，分別測量其關鍵力學性能，主要為壓縮模量，剪切模量和抗壓強度。將獲得的三種力學性能作為參數，計算并優化復合網格的力學強度。

優選地，三種分層網格在組合時近似于等截面疊加，組合支架抗壓強度可用三種網格中的最低者代表。

優選地，壓縮模量、剪切模量優化方案有以下兩種，并通過實際復合網格的力學測試驗證(兩種方案也可以互為驗證)：

1.利用計算機進行力學仿真。將三種分層網格作為均質材料，相互間進行固接約束，邊界和加載條件為周邊無約束，上下使用剛體壓頭的壓縮或剪切。調節三種網格在厚度方向的分布比例，通過力學仿真的形變量，反比例換算復合支架力學強度。

2.近似為等截面疊加，通過簡化公式計算。

對于401所示的正面承壓復合支架，已知壓縮/剪切模量等于相應條件下的應力除以應變。因此，等截面疊加下，應力與壓/剪力為正比例關系，又壓/剪力恒定，則壓縮/剪切模量反比于厚度方向上的應變，即形變率。

此關系對單一分層和整體支架均成立，因此復合網格的壓縮/剪切模量之倒數，等于各分層相應模量之倒數的加權平均，權重為分層厚度占比。

即：由比例a的分層1，比例b的分層2和比例c的分層3構成的復合網格(a+b+c＝1)，其模量

對壓縮模量和剪切模量都成立。

又，對于402所示的側面承壓復合支架，可以近似為三種分層支架的等厚并聯，容易推得壓縮/剪切模量等于三種分層相應模量的加權平均，權重為分層寬度占比。

即：由比例a的分層1，比例b的分層2和比例c的分層3構成的復合網格(a+b+c＝1)，其模量

E＝aE₁+bE₂+cE₃

對壓縮模量和剪切模量都成立。

因此，對于所述的兩種承壓形式的優化例，均可找出以E1、E2、E3為實測參數，a、b、c中的任意兩個為可調參數的簡化公式，為力學優化提供理論計算或理論參考。

根據如上所述的兩種優化方案，可以看出：三級復合的網格結構，提供了厚度分布比例a、b、c中的任意兩個作為一對獨立參數。需要優化的主要參數有兩個，為壓縮模量和剪切模量；需要保證下限的次要參數有一個，為抗壓強度。因此，在保證抗壓強度滿足要求的條件下，可以通過一對獨立參數的調整，實現雙自由度的參數優化，令壓縮模量和剪切模量都符合真實力學強度。

因此，在分層網格力學強度互有差異，且與真實軟骨相當的基礎上，可以通過合理的優化，實現整體力學強度接近真實軟骨，受壓/剪復合應力時應力云仿生的復合支架，理想的優化結果如圖2所示的204。

在一個正面承壓的實施例中，測得真實軟骨壓縮力學強度E＝37MPa，分層1與分層3力學強度相等，為40MPa，分層2力學強度為35MPa。故有

又a+b+c＝1，算得

故分層2占復合支架比例為0.57。再代入剪力的測試公式，可解出a和c，獲得優化的層數比例。

對于骨和骨-軟骨復合組織的優化而言，目標優化數值需選取骨組織的相應模量和強度。

組織學優化工藝路徑如下：

與PLGA相比，dECM的力學強度較低，同等條件下僅有真實軟骨的10％左右，但由于為天然軟骨提取物，具有優秀的生物活性和可降解性。同時，由于較弱的力學強度，對其單獨進行組織梯度化處理對整體力學強度影響不大，卻能夠提供適合細胞長入的定向微觀纖維結構。

設計如圖5所示的定向冷凍匣，其中含有高熱導率(紫銅)部分501，和低熱導率(PLA)部分502，外圍具有用PLA隔開的隔熱空氣層503，冷凍下溫度場分布近似504。

其中，熱導率為紫銅最高386.4w/(m.k)，支架本身次之，參考主體成分水為0.55w/(m.k)，PLA再次，為0.25w/(m.k)，隔熱空氣層最低，為0.023w/(m.k)。

將灌入dECM的網格置入此匣，并整體放于冷環境中，通過紫銅的高熱導率，可令dECM由銅的表面開始結凍，生長表層切向、中層過渡、底層法向的定向晶體結構。隔熱空氣層對側面PLA的傳熱起到限制，提高了冷凍溫度場的形狀精確度。

優選地，所設計的溫度場和定向纖維結構通過溫度場的計算機仿真進行優化設計，并通過實際復合支架的切片SEM觀察驗證，如圖6。

之后，通過冷凍干燥，可以除去dECM中的溶劑成分，獲得具有接近正常軟骨定向微觀組織的復合支架。

通過如上所述的兩條優化路徑，可完成梯度結構軟骨的制造與優化。所制造的軟骨支架，具有被dECM充填的宏觀孔徑，尺寸為500微米左右；及PLGA與dECM內部的微觀孔徑，尺寸在5～50微米。

優選地，在dECM和PLGA溶液中加入水溶性致孔劑，典型的如糖、鹽等。在加工完畢后，通過溶解除去致孔劑，以獲得更小的微觀孔徑，實現連通度高的分級孔隙結構，便于營養物質輸送。

優選地，在dECM中加入特定營養物質，如誘導軟骨形成的IGF-1蛋白等，以促進軟骨組織的形成。

這樣制造的支架具有近似于真實軟骨的力學強度和微觀定向組織，在植入人體后能夠較好地維持機體功能，并促進軟骨細胞長入和軟骨再生，在臨床上具有應用價值。

此外，通過一次性成形支架結構的打印路徑設計，實現了適用于定量優化的簡單工藝流程。能夠通過計算機仿真或理論計算對力學強度、組織結構進行定量優化，以在植入后更貼近真實人體，能夠支持機體、促進組織再生。

以上內容是結合具體/優選的實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，其還可以對這些已描述的實施方式做出若干替代或變型，而這些替代或變型方式都應當視為屬于本發明的保護范圍。