本發(fā)明屬于組織工程的技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于組織工程的三維復(fù)合支架及其制備方法，尤其涉及力學(xué)框架復(fù)合天然高分子及其衍生物復(fù)合支架的制備方法。

背景技術(shù)：

組織工程三大要素之一支架材料起到細(xì)胞外基質(zhì)作用。支架必須滿足良好的生物相容性、一定的孔隙率和良好的力學(xué)支撐。

支架的制備方法有相分離法、氣體發(fā)泡法、粒子瀝濾法等傳統(tǒng)方法和快速成型技術(shù)。相分離法是在一個(gè)多組分均相系統(tǒng)里，通過分離以聚合物為連續(xù)相和以溶劑為分散相。經(jīng)過冷凍干燥得到多孔支架。相分離的工藝較為復(fù)雜，不能得到孔徑精確控制支架。氣體發(fā)泡發(fā)是浸泡在高壓二氧化碳的片狀聚合物降壓到常態(tài)，使得氣泡增大成核，在聚合物內(nèi)部形成多孔結(jié)構(gòu)。雖然二氧化碳?xì)怏w發(fā)泡法避免了使用有機(jī)溶劑，但也難以精確控制支架的形狀和空隙，孔尺寸。顆粒瀝濾法是聚合物溶解后加入糖、氯化鈉等造孔劑攪拌均勻，然后放入模具成型至溶劑揮發(fā)，用去離子水除去造孔劑烘干形成多孔支架。這種方法除有溶劑殘留和無法精確控制空隙率外，還有可能導(dǎo)致閉孔、連通性差等問題。3d打印方法可以克服傳統(tǒng)支架制備方法的不足，如孔連通性不好、孔隙率無法控制、孔尺寸大小等問題。

支架材料可以為合成材料也可以為天然材料。但是合成材料由于缺乏能夠與細(xì)胞相互作用的識(shí)別位點(diǎn)，其生物活性也有待進(jìn)一步提高。天然材料具有良好的生物相容性和可降解性，天然材料成分接近細(xì)胞外基質(zhì)成分，為細(xì)胞的粘附和增殖提供了更加理想的材料環(huán)境，且材料降解之后有可能為細(xì)胞提供合成蛋白的營養(yǎng)成分，如膠原和纖維蛋白等，或提供碳水化合物等成分，如海藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和透明質(zhì)酸等。天然生物材料雖具有良好的生物相容性，但其機(jī)械強(qiáng)度差和降解速率不可控，在實(shí)際應(yīng)用中受到一定程度的局限。

將天然材料的生物活性與可降解合成材料良好的力學(xué)特性結(jié)合起來，充分利用兩者的優(yōu)勢(shì)，制備出復(fù)合支架能夠?yàn)槲磥響?yīng)用提供性能更加優(yōu)良的材料支架。由于合成可降解材料與天然材料相互之間的不相容性，以及天然材料的溫度敏感特性，很難用傳統(tǒng)的材料成型加工工藝將二者進(jìn)行復(fù)合。而采用表面改性的方法，可以將天然生物材料在合成材料表面進(jìn)行接枝修飾，但采用表面修飾的方法，天然材料的復(fù)合量較少，降解后期生物活性將受到一定程度的影響。

采用本發(fā)明的復(fù)合方法，分別利用天然材料以及合成材料的傳統(tǒng)成型方法，進(jìn)行同一復(fù)合支架的制備，使得復(fù)合支架既具有合成材料力學(xué)性能突出的優(yōu)勢(shì)，又具有天然材料生物活性優(yōu)良的特點(diǎn)，其相應(yīng)的孔徑孔隙率可以分別對(duì)成型方法工藝的調(diào)控進(jìn)行綜合控制，從而使得復(fù)合支架具有良好的力學(xué)性能及生物學(xué)性能，以及適于組織再生的孔徑與孔隙率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種用于組織工程的三維復(fù)合多孔支架的制備方法。本發(fā)明能夠?qū)⒘W(xué)性能優(yōu)異的材料和良好生物活性的材料進(jìn)行復(fù)合，使得復(fù)合后的材料具有良好的力學(xué)性能及生物活性，可用于組織工程研究。

本發(fā)明的另一目的在于提供由上述制備方法得到的用于組織工程的三維復(fù)合多孔支架。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種用于組織工程的三維復(fù)合多孔支架的制備方法，包括以下步驟：

(1)將高分子材料或高分子材料與無機(jī)粉體的混合物按照所需的結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維打印，得到具有孔隙的框架即支架；所述高分子材料為聚乳酸、聚乙醇酸、聚己內(nèi)酯或聚氨酯中的一種以上；

(2)將天然材料溶液或天然材料與無機(jī)粉體的混合溶液進(jìn)行抽真空處理，然后灌注入步驟(1)的支架的孔隙中，得到支架與混合溶液的混合物；所述天然材料為天然高分子和/或天然高分子衍生物；

(3)將步驟(2)的混合物進(jìn)行冷凍干燥，得到三維復(fù)合多孔支架；

(4)或者將步驟(2)的混合物進(jìn)行冷凍干燥和交聯(lián)處理，得到三維復(fù)合多孔支架；所述交聯(lián)處理是指在冷凍干燥前或冷凍干燥后將混合物進(jìn)行交聯(lián)處理，交聯(lián)處理的方式為采用交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)或真空熱交聯(lián)；當(dāng)采用交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)時(shí)，交聯(lián)后需除雜，冷凍干燥。

步驟(1)中所述高分子材料的數(shù)均分子量為30000～100000。

步驟(1)中所述無機(jī)粉體為羥基磷灰石或磷酸三鈣中一種以上。

步驟(1)中所述無機(jī)粉體的粒徑為20～100nm。

步驟(1)中所述高分子材料與無機(jī)粉體的重量比為(3～9):1。

步驟(2)中所述天然高分子為膠原、透明質(zhì)酸、殼聚糖或海藻酸鈉中一種以上；所述天然高分子衍生物是指上述所述天然高分的衍生物，如：接枝多肽的膠原。

步驟(2)中所述無機(jī)粉體為羥基磷灰石或磷酸三鈣中一種以上。

步驟(2)中所述無機(jī)粉體的粒徑為20～100nm。

步驟(2)中所述天然材料溶液的濃度為0.1-10mg/ml；所述混合溶液的濃度為0.1-10mg/ml，天然材料與無機(jī)粉體的質(zhì)量比為1:1。

步驟(1)中所述三維打印的溫度高于高分子材料的熱熔溫度，但低于高分子材料分解溫度。

步驟(3)中所述冷凍干燥的溫度為-80～-20℃，冷凍干燥的時(shí)間為36～48h。

步驟(4)中所述交聯(lián)劑為edc/nhs體系，戊二醛溶液或氯化鈣溶液，交聯(lián)劑的質(zhì)量濃度為0.1％～1％。

步驟(4)中所述交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)時(shí)，交聯(lián)的溫度為-8℃～常溫，當(dāng)交聯(lián)劑為edc/nhs體系或戊二醛溶液時(shí)，交聯(lián)的溫度優(yōu)選為-8℃～4℃；當(dāng)交聯(lián)劑為氯化鈣溶液時(shí)，交聯(lián)的溫度為常溫。

步驟(4)中所述交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)時(shí)，交聯(lián)的時(shí)間為4～24h。

步驟(4)中所述真空交聯(lián)的溫度為90℃～160℃；真空交聯(lián)的時(shí)間為24～48h。

步驟(1)中所述支架的平均孔尺寸為0.1mm-1.5mm，孔隙率為20％-90％。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明通過三維打印的方式制備支架，孔結(jié)構(gòu)和孔隙率可控，便于實(shí)現(xiàn)；本發(fā)明提供三維復(fù)合多孔支架的制備方法，工藝簡單、操作方便；三維復(fù)合多孔支架具有良好的力學(xué)性能和生物活性。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中聚氨酯支架即未填充膠原的支架的光學(xué)顯微鏡照片；

圖2為實(shí)施例2中聚氨酯支架即未填充膠原的支架的光學(xué)顯微鏡照片；

圖3為實(shí)施例1中三維復(fù)合多孔支架即三維打印聚氨酯填充膠原之后的sem圖；

圖4為實(shí)施例2中三維復(fù)合多孔支架即三維打印聚氨酯填充膠原之后的sem圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

聚氨酯/膠原三維復(fù)合多孔支架的制備：

(1)將聚氨酯(數(shù)均分子量mn＝61148)進(jìn)行三維打印(打印框架時(shí)的條件：溫度為t＝205℃，壓力p＝3.5bar)，得到聚氨酯框架即聚氨酯支架，平均孔尺寸為200μm；該聚氨酯支架即未填充膠原的支架的光學(xué)顯微鏡照片如圖1所示；

(2)將0.4mg/ml的膠原水溶液真空脫氣泡后，灌注到聚氨酯支架內(nèi)部，冷凍干燥(-40℃干燥48h)獲得未交聯(lián)的復(fù)合支架；

(3)將未交聯(lián)的復(fù)合支架浸沒在碳化二亞胺(edc)和琥珀酰胺(nhs)的交聯(lián)水溶液(交聯(lián)水溶液的總質(zhì)量的濃度為0.3％，edc/nhs的摩爾比＝1:1)中進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)的溫度為4℃，交聯(lián)時(shí)間為4h，交聯(lián)完畢后，用甘氨酸中和未反應(yīng)的edc，超清洗10次后，-40℃冷凍干燥48h，得到聚氨酯支架/膠原一體化支架即三維復(fù)合多孔支架。所述三維復(fù)合多孔支架即三維打印聚氨酯填充膠原之后的sem圖如圖3所示。本實(shí)施例所制備的三維復(fù)合多孔支架壓縮模量為6.3±0.5mpa，孔隙率為62.3％。

實(shí)施例2

聚氨酯/膠原三維復(fù)合多孔支架的制備：

(1)將聚氨酯(數(shù)均分子量mn＝61148)進(jìn)行三維打印(打印框架時(shí)的條件：溫度為t＝205℃，壓力p＝3.5bar)，得到聚氨酯框架即聚氨酯支架，平均孔尺寸為400μm；聚氨酯支架即未填充膠原的支架的光學(xué)顯微鏡照片如圖2所示；

(2)將0.4mg/ml的膠原水溶液真空脫氣泡后，灌注到聚氨酯支架內(nèi)部，采用冷凍干燥(-40℃冷凍干燥48h)獲得未交聯(lián)的復(fù)合支架；

(3)將未交聯(lián)的復(fù)合支架浸沒在碳化二亞胺(edc)和琥珀酰胺(nhs)的交聯(lián)溶液(交聯(lián)水溶液的總質(zhì)量的濃度為0.3％，edc/nhs的摩爾比＝1:1)中進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)的溫度為4℃，交聯(lián)時(shí)間為4h，交聯(lián)完畢后，用甘氨酸中和未反應(yīng)的edc，超清洗10次后，-40℃冷凍干燥48h，得到聚氨酯支架/膠原一體化支架即三維復(fù)合多孔支架。本實(shí)施例的三維復(fù)合多孔支架即三維打印聚氨酯填充膠原之后的sem圖如圖4所示。本實(shí)施例所制備的三維復(fù)合多孔支架的壓縮模量為6.,2±0.5mpa，孔隙率為81.2％。

實(shí)施例3

聚氨酯/海藻酸鈉三維復(fù)合多孔支架的制備：

(1)將聚氨酯(數(shù)均分子量mn＝61148)進(jìn)行三維打印(打印框架時(shí)的條件：溫度為t＝205℃，壓力p＝3.5bar)，得到聚氨酯框架即聚氨酯支架，平均孔尺寸為1500μm；

(2)將0.2mg/ml的海藻酸鈉水溶液真空脫氣泡后，灌注到聚氨酯支架內(nèi)部，然后浸泡在質(zhì)量濃度為1％的氯化鈣溶液中交聯(lián)12h，用去離子水洗滌5次，在-20℃冷凍干燥48h，得到三維復(fù)合多孔支架。本實(shí)施例所制備的三維復(fù)合多孔支架的壓縮模量為6.3±0.5mpa,孔隙率為62.1％。

實(shí)施例4

聚己內(nèi)酯/膠原三維復(fù)合多孔支架的制備

(1)將聚己內(nèi)酯(聚己內(nèi)酯的數(shù)均分子量mn＝90000)進(jìn)行三維打印(打印框架時(shí)的條件：溫度為t＝160℃，壓力p＝3.5bar)，得到聚己內(nèi)酯框架即聚己內(nèi)酯支架，平均孔尺寸為200μm；

(2)將0.4mg/ml的膠原水溶液真空脫氣泡后，灌注到聚己內(nèi)酯支架內(nèi)部，冷凍干燥(-40℃干燥48h)，得到未交聯(lián)的復(fù)合體；

(3)將未交聯(lián)的復(fù)合體(即聚己內(nèi)酯支架/膠原復(fù)合體)浸沒在碳化二亞胺(edc)和琥珀酰胺(nhs)的交聯(lián)溶液(交聯(lián)水溶液的總質(zhì)量的濃度為0.3％，edc/nhs的摩爾比＝1:1)進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)的溫度為4℃，交聯(lián)時(shí)間為4h，交聯(lián)完畢后，用甘氨酸中和未反應(yīng)的edc，超清洗10次后冷凍干燥(-40℃冷凍干燥48h)，得到聚己內(nèi)酯支架/膠原一體化支架即三維復(fù)合多孔支架。本實(shí)施例所制備的三維復(fù)合多孔支架的壓縮模量為12.5±0.5mpa,孔隙率為62.1％。

實(shí)施例5

聚己內(nèi)酯/磷酸三鈣三維復(fù)合多孔支架制備：

(1)將聚己內(nèi)酯(數(shù)均分子量mn＝90000)與磷酸三鈣(粒徑為20～100nm)進(jìn)行擠出共混，得到聚己內(nèi)酯/磷酸三鈣復(fù)合材料(聚己內(nèi)酯與磷酸三鈣的質(zhì)量比為90:10)；將聚己內(nèi)酯/磷酸三鈣復(fù)合材料進(jìn)行三維打印(打印框架時(shí)的條件：溫度為t＝180℃，壓力p＝3.5bar)，得到三維聚己內(nèi)酯/磷酸三鈣支架，平均孔尺寸為100μm；

(2)將3mg/ml殼聚糖的乙酸溶液(采用0.1wt％的醋酸水溶液配制成殼聚糖的濃度為3mg/ml)真空脫氣泡后，灌注到聚己內(nèi)酯/磷酸三鈣多孔支架內(nèi)部，然后在-20℃冷凍干燥48h獲得聚己內(nèi)酯/磷酸三鈣/殼聚糖三維復(fù)合支架即三維復(fù)合多孔支架。本實(shí)施例所制備的三維復(fù)合多孔支架的壓縮模量為6.3±0.5mpa,孔隙率為62.1％。

實(shí)施例6

聚氨酯/膠原/羥基磷灰石三維復(fù)合多孔支架制備：

(1)將聚氨酯(數(shù)均分子量mn＝61148)進(jìn)行三維打印(打印框架時(shí)的條件：溫度為t＝205℃，壓力p＝3.5bar)，得到聚氨酯框架即聚氨酯支架，平均孔尺寸為200μm；

(2)采用水將膠原和羥基磷灰石(粒徑為20～100nm)配制成漿料(膠原：羥基磷灰石質(zhì)量比為1:1，漿料中膠原和羥基磷灰石總的濃度為1mg/ml)，得到膠原/羥基磷灰石漿料；

(3)將膠原/羥基磷灰石漿料真空脫氣泡后，灌注到聚氨酯框架中，得到未交聯(lián)的復(fù)合體；

(4)將未交聯(lián)的復(fù)合體浸沒在質(zhì)量濃度為0.2％戊二醛的乙酸水溶液(溶液中乙酸的濃度為0.05mol/l)中，4℃下，交聯(lián)24h，然后在-20℃冷凍干燥48h，獲得聚氨酯/膠原/羥基磷灰石復(fù)合支架即三維復(fù)合多孔支架。本實(shí)施例所制備的三維復(fù)合多孔支架的壓縮模量為6.3±0.5mpa,孔隙率為62.1％。

實(shí)施例7

(1)將聚乳酸(分子量為70000)進(jìn)行三維打印(打印框架時(shí)的條件：溫度為t＝150℃，壓力p＝3.5bar)，得到三維聚乳酸框架即聚乳酸支架，平均孔尺寸為200μm；

(2)將膠原溶液真空脫氣泡后，灌注到三維聚乳酸框架內(nèi)部，采用冷凍干燥(-40℃冷凍干燥48h)，得到未交聯(lián)的復(fù)合體；

(3)將未交聯(lián)的復(fù)合體于110℃真空熱交聯(lián)48h，保持真空降溫得到熱交聯(lián)的聚乳酸支架/膠原一體化支架即三維復(fù)合多孔支架。本實(shí)施例所制備的三維復(fù)合多孔支架的壓縮模量為7.6±0.4mpa，孔隙率為80.3％。

實(shí)施例8

聚氨酯支架/膠原三維復(fù)合多孔支架制備：

(1)將聚氨酯(數(shù)均分子量mn＝61148)進(jìn)行三維打印(打印框架時(shí)的條件：溫度為t＝205℃，壓力p＝3.5bar)，得到聚氨酯框架即聚氨酯支架，平均孔尺寸為200μm；

(2)將膠原溶液真空脫氣泡后，灌注到聚氨酯支架內(nèi)部，冷凍干燥(-40℃冷凍干燥48h)，得到未交聯(lián)的復(fù)合體；

(3)將未交聯(lián)的復(fù)合體即聚氨酯支架/膠原復(fù)合體浸沒在質(zhì)量濃度為0.2％戊二醛的乙酸水溶液(溶液中乙酸的濃度為0.05mol/l)中，4℃下，交聯(lián)24h，交聯(lián)完畢后，用pbs緩沖液和去離子水超清洗10次，然后冷凍干燥(-40℃冷凍干燥48h)，得到聚氨酯支架/膠原一體化支架即三維復(fù)合多孔支架。本實(shí)施例所制備的三維復(fù)合多孔支架的壓縮模量為6.3±0.5mpa,孔隙率為62.1％。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但是本發(fā)明的實(shí)施方式不受上述實(shí)例限制，其他的任何未背離本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化均為等效。