本發(fā)明涉及高分子化學與生物醫(yī)學工程領域，具體涉及一種藥物載體聚合物及其在靶向siRNA輸送載體中的應用。

背景技術：

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis, AS）可以導致心肌梗塞、冠心病、腦卒中等缺血性心腦血管栓塞等疾病，一直以來是發(fā)達國家人口死亡的主要原因。在我國，由于人民生活水平提高，產生的不健康生活方式引起此病的相對和絕對發(fā)生率增高，導致動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥現(xiàn)已躍居于我國人口死亡的主要原因之列。對動脈粥樣硬化預防、診斷和治療一直是人們熱切關注的問題。隨著科技的進步以及政府相關部門單位的重視，在該方面取得了重大的進展。目前，常規(guī)的治療動脈粥樣硬化的方式主要包括降血脂藥物如他汀類藥物和貝特類藥物以及抗氧化藥物如植物酮類藥物和花青素類藥物等。然而這些藥物治療方法都有各自的不足，難以完全達到令人滿意的治療效果。

近年來，隨著技術的發(fā)展，RNA干擾技術成為一種重要的新型治療手段，其高效的基因沉默效果，表現(xiàn)出非常大的應用前景。然而，由于siRNA的輸送問題，其臨床應用仍然面臨著重大挑戰(zhàn)。首先，由于siRNA分子較大的分子量和本身所帶的負電荷，導致其極難穿過細胞膜實現(xiàn)胞吞；其次，siRNA極易被核酸酶降解的特性，通常不能到達病灶部位。上述問題阻礙了siRNA的臨床應用。因此，穩(wěn)定高效的siRNA傳輸系統(tǒng)是實現(xiàn)RNA干擾治療的關鍵。此外，siRNA傳輸系統(tǒng)的穩(wěn)定性和安全性也是一個需要關注的問題，傳統(tǒng)的輸送系統(tǒng)如脂質體和病毒分別因為其穩(wěn)定性和安全性的不足，在臨床上的應用受到了一定的影響。

焦永華等在《高等學校化學學報》，No.6，1280~1284中報道了關于超支化聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸芐酯共聚物的制備及性能。文章中利用超支化聚乙烯亞胺與聚天冬氨酸芐酯共聚物作為藥物載體，可以很好地與DNA復合，并且可以避免酶的降解，但是由于藥物在體內存留時間短，循環(huán)時間短，藥物與病灶結合的幾率不高，從而影響藥物的作用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中基因藥物載體在體內穩(wěn)定性差，存留時間短，循環(huán)時間短，藥物與病灶結合幾率不高的問題，提供一種siRNA藥物載體聚合物。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種siRNA藥物載體聚合物在siRNA靶向輸送的應用。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種治療動脈粥樣硬化的siRNA藥物。

本發(fā)明的目的通過如下技術方案予以實現(xiàn)：

一種siRNA藥物載體聚合物，其結構如式（I）所示：

(I)

其中，x為45，m為8~12，n為6~12，聚乙烯亞胺為線性結構。

式（I）所示siRNA藥物載體聚合物中引入生物相容性能很好的聚乙二醇，能提高藥物的穩(wěn)定性的同時，也屏蔽血清中負電蛋白等對藥物的攻擊，實現(xiàn)延長載體聚合物在血液中的循環(huán)時間，增大靶向幾率的作用；選用小分子量的線性聚乙烯亞胺負載基因可大大降低其陽離子毒性，解決超支化聚乙烯亞胺體內應用時因毒性過大引起的各類免疫反應等問題，然而，小分子量的線性聚乙烯亞胺復合基因的能力不強，因此我們創(chuàng)新性地將其接枝在可降解的聚天冬氨酸側鏈上，可以提高陽離子密度，增加其對基因的負載能力，同時進一步降低了陽離子聚合物的毒性。

優(yōu)選地，式（I）所示siRNA藥物載體聚合物中，m為10，n為10。合理控制聚度可以更有效提高藥物載體聚合物在血液中的循環(huán)時間，更有利于提高靶向幾率。

優(yōu)選地，式（I）所示siRNA藥物載體聚合物負載基因藥物后為納米級顆粒，粒徑為129.8 ± 23.9 nm。納米結構進一步提高聚合物的生物相容性。

一種式（I）所示siRNA藥物載體聚合物的制備方法，包括以下步驟：

S1. 聚乙烯亞胺的合成：2-乙基-唑啉的開環(huán)聚合合成聚(2-乙基-唑啉)（PEOX）；再用鹽酸脫去保護基可得到聚乙烯亞胺（PEI）；

S2. 聚乙二醇-聚天冬氨酸芐酯的合成：由聚乙二醇-氨基作大分子引發(fā)劑，引發(fā)天冬氨酸芐酯（BLA-NCA）的開環(huán)聚合，得到聚乙二醇-聚天冬氨酸芐酯；

S3. 合成siRNA藥物載體：將聚乙烯亞胺直接氨解聚乙二醇-聚天冬氨酸芐酯得到siRNA藥物載體（mPEG-PAsp-g-PEI）。

式（I）所示siRNA藥物載體聚合物中引入生物相容性良好的聚乙二醇（PEG），可以增加載體在血液中循環(huán)效果。聚乙烯亞胺結構可以很好的和siRNA結合，實現(xiàn)了siRNA的傳輸。

式（I）所示siRNA藥物載體聚合物作為靶向siRNA輸送載體的應用。

優(yōu)選地，式（I）所示siRNA藥物載體聚合物中的聚乙烯亞胺結構與siRNA藥物相連接。

一種治療動脈粥樣硬化的siRNA藥物，包括式（I）所示siRNA藥物載體聚合物，與載體聚合物中聚乙烯亞胺結構相連接的siRNA，與載體聚合物中聚天冬氨酸結構相連接的靶向分子。

在siRNA藥物載體中聚乙烯亞胺結構上連接siRNA，聚天冬氨酸結構上連接靶向分子。siRNA作為基因藥物可以對動脈粥樣硬化起到治療作用，而靶向分子可以引導藥物聚集在病灶出，提高靶向性，提高治療效果。

優(yōu)選地，所述siRNA能夠下調動脈粥樣硬化斑塊中PAK1基因的表達。

優(yōu)選地，所述siRNA的序列為：正義鏈5′GCU UCA GGC ACA GUG UAU ATT3′ ，反義鏈5′UAU ACA CUG UGC CUG AAG CTT 3′。

上述siRNA可以下調動脈粥樣硬化斑塊中PAK1基因的表達，下調PAK1的表達，下調泡沫細胞中PAK1基因并減少下游炎癥因子的表達，起到治療動脈粥樣硬化的作用。

優(yōu)選地，所述靶向分子為CD36抗體。實現(xiàn)動脈粥樣硬化斑塊泡沫細胞的靶向，選取單鏈抗體CD36修飾納米藥物，實現(xiàn)其在斑塊位置的富集和介導高效的細胞攝取。

優(yōu)選地，所述靶向分子，是修飾在馬來酰亞胺上，再連接到siRNA藥物載體。通過馬來酰亞胺連接靶向分子與siRNA藥物載體，馬來酰亞胺具有豐富的官能團很容易和藥物分子結合。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供一種藥物載體聚合物，并應用于siRNA輸送載體。聚合物中具有聚乙二醇結構增加了生物相容性，增強了載體在血液中的循環(huán)效果，增加了藥物的靶向幾率。將聚乙烯亞胺接枝到可降解的天冬氨酸側鏈上提高陽離子密度，增加了聚合物對基因的負載能力，降低了陽離子聚合物的毒性。在使用時在聚合物主鏈伯氨基上連接抗體，抗體可以在相應病灶處聚集，進一步增加了藥物的靶向性。

附圖說明

圖1為藥物載體聚合物的結構式。

圖2為凝膠阻滯電泳驗證非靶（A）和靶向（B）聚合物對siRNA的復合能力圖。

圖3為非靶復合物（A, C）和靶向復合物（B, D）納米粒子的粒徑和TEM圖。

圖4為非靶（A, C）和靶向（B,D）聚合物、復合物的細胞毒性測試： MTT法。

圖5為mRNA水平（A）和蛋白水平（B,C）評價siRNA復合物的干擾效果。

具體實施方式

下面結合說明書附圖和具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下例實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照本領域常規(guī)條件或按照制造廠商建議的條件。本領域的技術人員在本發(fā)明的基礎上所做的任何非實質性的變化及替換均屬于本發(fā)明所要求保護的范圍。

實施例1

一種siRNA藥物載體聚合物，其結構如下所示：

（I）

其中，x為45，m為8，n為6，聚乙烯亞胺為線性結構。

聚合物負載基因藥物后為納米級顆粒，粒徑為129.8 ± 23.9 nm。

式（I）所示siRNA藥物載體聚合物的合成

S1. 聚乙烯亞胺的合成：2-乙基-唑啉的開環(huán)聚合合成聚(2-乙基-唑啉)（PEOX）；再用鹽酸脫去保護基可得到聚乙烯亞胺（PEI）；

線性聚乙烯亞胺（PEI）的合成，反應機理及過程如下：

先合成聚(2-乙基-唑啉) （PEOX）。對甲苯磺酸甲酯（2 mmol）經常溫真空干燥2 h后用15 mL新蒸的乙腈溶解，再將 2-乙基-唑啉(24 mmol)加入反應瓶中，85 ^○C回流72 h；冷卻后將反應瓶浸入冰水浴中，通入干燥的氨氣（經過氧化鈣和氫氧化鈉干燥塔）1 h終止聚合反應，旋蒸除去乙腈，用三氯甲烷溶解，再沉淀在大量乙醚中，離心、干燥得淡黃色聚(2-乙基-唑啉)（PEOX）。

PEOX經鹽酸脫去保護基可得到線性聚乙烯亞胺。PEOX (2 mmol)用10 mL鹽酸（10%）溶解，100 ^○C回流反應12 h，冷卻后反應體系變?yōu)槿榘咨脷溲趸c溶液調節(jié)pH值至12，當pH值為5-9時溶液澄清，當pH﹥9時又恢復成乳白色渾濁。離心取下層沉淀，用去離子水洗滌三次后凍干，得淡黃色粉末端氨基線性聚乙烯亞胺（PEI-NH₂）。

S2. 聚乙二醇-聚天冬氨酸芐酯的合成：由聚乙二醇-氨基作大分子引發(fā)劑，引發(fā)天冬氨酸芐酯（BLA-NCA）的開環(huán)聚合，得到聚乙二醇-聚天冬氨酸芐酯；

聚乙二醇-聚天冬氨酸芐酯的合成，反應機理及過程如下：

PEG-NH₂ (0.6 mmol) 70 ^oC真空干燥4 h，冷卻后氮氣保護下，先用20 mL新蒸CH₂Cl₂溶解，再加入芐氧羰基天冬氨酸酸酐（BLA-NCA）的DMF溶液（6 mmol溶解在2 mL無水DMF中），充分攪拌，反應開始有大量小氣泡生成。密封反應瓶，35 ^oC的油浴中加熱攪拌反應72 h。反應結束后，沉淀在大量的冷無水乙醚（約500 mL）中，經離心和無水乙醚洗滌，真空干燥得到PEG-PBLA-NH₂。

S3. 合成siRNA藥物載體聚合物：將聚乙烯亞胺直接氨解聚乙二醇-聚天冬氨酸芐酯得到siRNA藥物載體聚合物。

藥物siRNA載體聚合物（mPEG-PAsp-(g-PEI)）的合成，反應機理及過程如下：

mPEI-PBLA (0.2 mmol)和PEI（10 mmol）溶解在30 mL無水DMSO中，35 ^oC的油浴中加熱攪拌反應48 h后，用透析袋（3.5 kDa）在去離子水中透析三天除去多余的PEI，然后凍干得到siRNA藥物載體聚合物（mPEG-PAsp-(g-PEI)）。

實施例2

一種siRNA藥物載體聚合物，其結構如下所示：

其中，x為45，m為12，n為12，聚乙烯亞胺為線性結構。

合成方法與實施例1不同之處在于，步驟S1 85℃回流反應時間為130h，步驟S2中35 ℃的油浴中加熱攪拌反應為144 h。

實施例3

一種siRNA藥物載體聚合物，其結構如下所示：

其中，x為45，m為10，n為10，聚乙烯亞胺為線性結構。

合成方法與實施例1不同之處在于，步驟S1 85℃回流反應時間為100h，步驟S2中35 ℃的油浴中加熱攪拌反應為100h。

實施例4

siRNA載體聚合物在siRNA輸送中的應用。

一種治療動脈粥樣硬化的siRNA藥物，包括所述的siRNA藥物載體聚合物，與載體聚合物中聚乙烯亞胺結構相連接的siRNA，與載體聚合物中聚天冬氨酸結構相連接的靶向分子。

所述siRNA能夠下調動脈粥樣硬化斑塊中PAK1基因的表達。

siRNA序列為：正義鏈5′GCU UCA GGC ACA GUG UAU ATT3′ ，反義鏈5′UAU ACA CUG UGC CUG AAG CTT 3′。

述靶向分子為CD36抗體。

所述靶向分子，是修飾在馬來酰亞胺上，再連接到siRNA藥物載體。

取實施例1制備得到的聚合物，在主鏈伯氨基上連上馬來酰亞胺（Mal）得到mPEG-PAsp-(g-PEI)-Mal，然后溶解在水中，按比例與siRNA的水溶液混合，強烈震蕩30 s，靜置30 min后即制得復合物。抗體CD36連接在馬來酰亞胺（MAl）端。然后通過凝膠阻滯電泳實驗驗證其負載siRNA的能力（如圖2）。用TEM測定復合物連上siRNA前后的形貌結構（如圖3）。

采用MTT法檢測了聚合物及復合物與Raw264.7細胞孵育后細胞的存活率，評價納米粒子對細胞的毒性，結果如圖4所示，單純納米復合物及負載siRNA的納米復合物均顯示了極小的細胞毒性。

通過實時PCR和Western blot實驗分別在mRNA水平和蛋白水平評估納米聚合物負載anti-PAK1 siRNA在氧化低密度脂蛋白（oxLDL)誘導的Raw264.7細胞沉默PAK1基因的效果，如圖5所示。在實時PCR實驗中，經納米復合物治療后，PAK1的mRNA表達水平與oxLDL誘導組相比有明顯的降低。Western blot實驗也得到了類似的結果，同時，對比于非CD36靶向納米復合物組，靶向組明顯提高了沉默氧化低密度脂蛋白（oxLDL)誘導的Raw264.7細胞PAK1基因的效率，即相對于氧化低密度脂蛋白（oxLDL)誘導組和非CD36靶向納米復合物組孵育的細胞，攜帶anti-PAK1 siRNA的靶向復合物孵育oxLDL誘導的Raw264.7細胞明顯下調PAK1基因表達。