本發明屬于醫藥和/或保健品技術領域，具體涉及一種過山厥素在制備預防和改善肥胖癥藥物方面的新應用。
背景技術：
過山厥素，化學名稱山萘酚-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-7-o-α-l-鼠李糖苷，具有抗氧化、擴張冠狀動脈、腸平滑肌、阻斷α-受體，阻斷β-受體的作用，是一種已知的天然化合物，多從植物中提取分離獲得。
肥胖癥是遺傳、環境等多種因素引起的體內脂肪堆積過多、體重增加的慢性代謝性疾病。與2型糖尿病、血脂異常密切相關。攝入的能量超過消耗的能量會導致脂肪的堆積。脂肪組織的增大是由脂肪細胞數量的增多和體積增大引起的。脂肪組織的增殖、分化失常會引起脂肪組織的堆積。體內脂肪組織過多堆積會分泌一系列的激素和脂肪細胞因子干擾胰島素在細胞內信號傳導，引發胰島素抵抗，胰島素抵抗是指體內外周組織（肌肉、脂肪）對胰島素的敏感性降低，使得外周組織對葡萄糖的攝取減少，導致血糖升高，從而誘發2型糖尿病。肥胖癥和2型糖尿病的發病率不斷上升，已成為全球性的健康問題。開發預防和改善治療肥胖癥的天然產物意義尤為深遠。
技術實現要素：
本發明目的在于克服現有技術缺陷，提供一種過山厥素在制備預防和改善肥胖癥藥物方面的新應用。
為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
過山厥素在制備預防和和改善肥胖癥藥物方面的新應用，即其具有潛在的減肥功效。
上述的應用，具體的可以是：過山厥素在制備抑制前脂肪細胞分化的藥物和/或保健品方面的應用。
和現有技術相比，本發明通過試驗發現了過山厥素可以抑制前脂肪細胞分化，可能成為治療肥胖、2型糖尿病的一種新型化合物。因此，可被用作制備制備預防和改善肥胖癥藥物和/或保健品。
附圖說明
圖1為油紅o染色試驗結果，圖中，上部為對照組油紅分化形態圖，下部為過山厥素油紅分化染色圖。
具體實施方式
以下結合實施例對本發明的技術方案作進一步地詳細介紹，但本發明的保護范圍并不局限于此。
過山厥素是一種已知的天然化合物，多從植物中提取分離獲得。本發明中過山厥素從植物女貞花（于2015年6月采集于貴州省貴陽市花溪區濕地公園，由貴州大學張前軍教授鑒定為女貞（ligustrumlucidumait.）的花）中提取獲得。具體提取分離步驟如下：
1）取475g干燥女貞花，添加石油醚至浸沒女貞花，然后加熱回流提取2次，每次回流提取2h，回流提取結束后，過濾，所得殘渣揮干石油醚，用70%乙醇室溫下浸漬提取3次（70%乙醇添加量以浸沒殘渣為宜），每次浸漬提取3天，合并提取液并濃縮，得到女貞花總浸膏；
2）女貞花總浸膏用50%乙醇溶解后，用d101型大孔樹脂吸附分離，依次用水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，每個梯度洗脫五個柱體積，每個柱體積2000ml，洗脫液濃縮后，分別得到水部位浸膏、20%乙醇部位浸膏7g、40%乙醇部位浸膏60g、60%乙醇部位浸膏24g、95%乙醇部位16g；
3）40%乙醇部位浸膏（50g），經200-300目硅膠柱色譜進行分離，二氯甲烷/甲醇（v/v，100:0、50:1、25:1、20:1、15:1、5:1、2:1）進行洗脫，分離得到2個組分。其中的第1組分（10g）經過硅膠h減壓柱色譜，二氯甲烷/甲醇（v/v，10:1、7:1、5:1、3:1、2:1、1:1）洗脫，然后經過sephadexlh-20凝膠柱色譜純化，甲醇洗脫，分離得到化合物1（54mg），剩下的組分繼續用反相半制備高效液相色譜純化，用甲醇-水(0-40min,40%甲醇-100%甲醇；40-60min，100%甲醇，tr=46min)洗脫，分離得到化合物2(71mg)。其中的第2組分（5.6g）經過硅膠h減壓柱色譜和sephadexlh-20凝膠柱色譜分離純化得到化合物3（547mg）。化合物1、化合物2、化合物3經鑒定分別為山奈苷、10-羥基橄欖苦苷、過山蕨素，具體結構鑒定數據如下。
化合物1：黃色針晶（甲醇），分子量：578，分子式：c27h30o14，1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ:7.79(2h,d,j=8hz,h-2′,6′),6.92(2h,d,j=8hz,h-3′,5′),6.79(1h,d,j=4hz,h-8),6.46(1h,d,j=4hz,h-6),5.55(1h,d,7-o-rha,h-1),5.30(1h,d,j=4hz,3-o-rha,h-1),1.13(3h,d,j=4hz,7-o-rha,h-6),0.80(3h,d,j=8hz,3-o-rha,h-6).13c-nmr(dmso-d6,100mhz)δ:177.97(c-4),161.73(c-7),160.96(c-5),160.26(c-4′),157.84(c-9),156.14(c-2),134.56(c-3),130.76(c-2′,6′),120.38(c-1′),115.47(c-3′,5′),105.82(c-10),101.90(7-o-rha,c-1),99.51(3-o-rha,c-1),98.43(c-6),94.63(c-8),71.62(7-o-rha,c-4),71.13(3-o-rha,c-4),70.73(7-o-rha,c-3),70.34(3-o-rha,c-3),70.26(7-o-rha,c-2),70.11(3-o-rha,c-2),70.11(7-o-rha,c-5),69.85(3-o-rha,c-5),17.97(7-o-rha,c-6),17.52(3-o-rha,c-6)。以上數據和文獻（陳艷,鄧虹珠,梁磊.細梗胡枝子黃酮類成分的研究[j].南方醫科大學學報,2008,28(05):858-860.）中化合物ⅳ比對，數據基本一致，故鑒定化合物1為山奈苷。
化合物2：白色固體，分子量：556，分子式：c25h32o14。1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ:6.64(1h,d,j=8hz),6.60(1h,s),6.47(1h,d,j=8hz)為苯環上的質子，7.53(1h,s),6.00(1h,t)為兩個烯氫質子，4.66(1h,d,j=8hz)為葡萄糖端基質子，3.64(1h,s,c-11-och3)。13c-nmr(dmso-d6,100mhz)δ:170.70(c-7),166.15(c-11),153.42(c-3),145.15(c-3′),143.82(c-4′),129.24(c-1′),128.36(c-8),128.26(c-9),119.54(c-6′),116.22(c-2′),115.59(c-5′),107.61(c-4),99.14(glc-1″),92.66(c-1),77.42(glc-3″),76.63(glc-5″),73.32(glc-2″),69.95(glc-4″),65.16(c-β),61.13(glc-6″),57.28(c-10),51.34(c-11-och3),39.90(c-6),33.71(c-α),30.69(c-5)。以上數據與文獻（馮雪松,許磊,高慧媛,吳立軍.關東丁香化學成分的分離與鑒定[j].沈陽藥科大學學報,2009,26(09):697-700）中化合物5比對，數據基本一致，故鑒定化合物2為10-羥基橄欖苦苷。
化合物3：黃色粉末（甲醇），分子量：594，分子式：c27h30o15，mp243～246℃,1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ:8.09(2h,d,j=8hz,h-2′,6′),6.89(2h,d,j=8hz,h-3′,5′),6.83(1h,s,h-8),6.44(1h,d,j=4hz,h-6),5.55(1h,s,3-o-glu,h-1),5.49(1h,d,j=8hz,7-o-rha,h-1),1.12(3h,d,j=4hz,7-o-rha,h-6).13c-nmr(dmso-d6,100mhz)δ:177.70(c-4),161.62(c-7),160.92(c-5),160.17(c-4′),156.80(c-9),156.03(c-2),133.51(c-3),130.07(c-2′,6′),120.82(c-1′),115.20(c-3′,5′),105.71(c-10),100.77(3-o-glu,c-1),99.44(7-o-rha,c-1),98.41(c-6),94.54(c-8),77.62(3-o-glu,c-5),76.45(3-o-glu,c-3),74.26(3-o-glu,c-2),71.64(7-o-rha,c-4),70.28(3-o-glu,c-4),70.12(7-o-rha,c-3),69.95(7-o-rha,c-2),69.87(7-o-rha,c-5),60.89(3-o-glu,c-6),17.98(7-o-rha,c-6)。以上數據和文獻（袁琳,黃文忠,梁德強,馬銀海,杜芝芝.合柄鐵線蓮中黃酮苷類化學成分研究[j].中國藥學雜志,2015,50(06):497-501.）中化合物3比對，數據基本一致，故鑒定化合物3為過山蕨素（山萘酚-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-7-o-α-l-鼠李糖苷）。
應用試驗1、過山厥素對3t3-l1前脂肪細胞活性的影響
儀器材料：儀器：制備型高效液相色譜儀（waters2535q）；旋轉蒸發儀（eyela，東京理化器械株式會社）；lc-3000高效液相制備柱色譜（北京創新通恒科技有限公司）；am-400超導核磁共振儀（bruker）；電子天平（美國mettler-toledo公司）；tgl-16gr高速臺式冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；雙人單面凈化工作臺（型號：sw-cj-2fd型廠家：蘇州凈化設備有限公司）；二氧化碳培養箱（型號：3111型，廠家：thermoscientific）；倒置顯微鏡（ckx31型，olympus）；全溫振蕩培養箱（hzp型上海精宏實驗設備有限公司）；離心沉淀器（800型上海手術器械廠）；各種規格移液槍（transferpette）；數碼相機（canoneos450d）倒置顯微鏡（nikoneclipsets100）；gf254硅膠薄層板（煙臺匯友硅膠開發有限公司）；40~80目硅膠、200~300目硅膠和硅膠h（煙臺匯友硅膠開發有限公司）；sephadexlh-20（瑞典pharmacia公司）；d101型大孔樹脂（天津海光化工有限公司）；c-18（德國merk公司）；其余試劑均為分析純；葡萄糖測定試劑盒（上海榮盛生物藥業有限公司，20161105147）；葡萄糖標準品（上海榮盛生物藥業有限公司，批號：20161001）；小鼠游離脂肪酸測定試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，批號：201609）；胎牛血清（浙江天航生物科技股份有限公司，批號：20160923）；dmem高糖培養液（北京索萊寶科技公司，批號：f08hv090）；青霉素鏈霉素混合液（solarbio，批號：20161029）；胰酶細胞消化液（碧云天，編號：c0210）二甲基亞砜（sigmashbc3313v）；胰島素（sigma）；噻唑藍（上海華藍科技有限公司）；油紅o（sigmaslbp5248v）；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（sigma，bcbh1214v）；地塞米松（sigmabcbm4557v）。羅格列酮片（成都恒瑞制藥有限公司）；洛伐他汀膠囊（揚子江藥業集團有限公司，20160109）；細胞株：3t3-l1小鼠胚胎成纖維細胞購于中科院細胞庫。
實驗方法：
細胞培養與凍存：
3t3-l1前脂肪細胞，用含15%胎牛血清的dmem高糖培養液（青霉素：10u/ml、鏈霉素10μg/ml）在37℃、5%co2飽和濕度的二氧化碳培養箱中培養，2d換液一次，當細胞融合至80%后，棄培養瓶中培養液，加入0.25%胰蛋白酶液1ml，作用1min左右，加入2倍體積培養液終止消化，用吹打管將貼壁細胞吹打入培養液。將細胞懸液移入無菌離心管，1000rpm離心5min，棄上清。細胞傳代：1個培養瓶收集的細胞沉淀用1ml新培養液吹散，按1：2比例傳代。細胞凍存：2個培養瓶收集的細胞沉淀用1.2ml凍存液（含10%dmso的胎牛血清）吹散轉入凍存管放入程序降溫盒，然后放入-80℃冰箱過夜，取出凍存管放入液氮罐中保存。
細胞毒活性檢測：
收集對數生長期的3t3-l1前脂肪細胞，調整細胞懸液濃度，以每孔2×105的密度接種于96孔培養板，每孔加入100μl細胞懸液。將細胞置于37℃、5%co2及飽和濕度的二氧化碳培養箱中培養24h，待細胞融合至60%-70%，加入濃度梯度的藥物，每個板設正常對照組、溶媒對照組（0.1%dmso）、給藥組，設6個復孔，繼續培養48h后，每孔加入10μlmtt溶液（5g/l），繼續培養4h。小心吸去孔內培養液，每孔加入100μldmso置震蕩培養箱（100r/min）中震蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶標儀570nm波長處測量各孔的吸光度值（od值）。
表1：過山厥素對3t3-l1前脂肪細胞細胞毒活性的影響（n=6）
由表1可知，正常對照組和溶媒對照組吸光度值相比，差異沒有統計學意義，說明溶媒對細胞活力不產生影響。過山蕨素300μm劑量組吸光度值低于正常對照組，差異具有統計學意義（p＜0.001）。說明過山蕨素在300μm時具有細胞毒性，不能作為給藥劑量。過山蕨素100、33和11μm劑量組與正常對照組相比，差異沒有統計學意義，說明過山蕨素在100、33和11μm劑量時均沒有細胞毒作用。即過山蕨素100μm劑量范圍以下均可設為給藥劑量。
應用試驗2、過山厥素對3t3-l1前脂肪細胞分化的影響
以3t3-l1前脂肪細胞為細胞模型，在誘導分化過程中加入過山厥素，油紅o染色鑒定3t3-l1前脂肪細胞分化程度。
取對數生長期的3t3-l1前脂肪細胞傳代培養，按1.5×105的密度接種到96孔板中，細胞完全融合后，接觸抑制48h，然后更換含分化誘導劑a（0.5mmibmx、1μmdex、10μg/mlinsulin）的dmem高糖培養液，同時加藥（分為空白組，模型組、洛伐他汀組（50μm），給藥組）。3d后換成含誘導分化劑b（含有10μg/mlinsulin）的dmem高糖培養液（含15%的胎牛血清），2d后換常規培養液，此后隔天換液，培養至12d，小心吸除培養液，冰冷pbs洗2次，晾干，每孔加入50μl4%多聚甲醛固定40min，pbs再洗2遍，晾干，加入油紅o染色30min，pbs洗2次，超純水洗2次，倒置顯微鏡下數碼相機拍照（100×）。每孔加入100μl異丙醇，40min后使用酶標儀在495nm波長下測定吸光度。結果如下。
數據處理：結果采用均值±sd值表示，數據統計采用spss19.0軟件單因素方差分析法（one-wayanova）比較其顯著性差異。
表2：過山厥素對3t3-l1前脂肪細胞分化的影響（n=6）
由圖1、表2可知，與模型組相比，洛伐他汀組油紅染色水平顯著降低（p<0.05），說明洛伐他汀組能夠抑制3t3-l1前脂肪細胞分化。過山蕨素100、33μm劑量組油紅染色水平顯著降低（p<0.01），說明過山蕨素100、33μm劑量組能夠抑制3t3-l1前脂肪細胞的分化，說明過山厥素具有用于預防和改善肥胖癥的潛質。
結論：過山厥素能夠抑制3t3-l1前脂肪細胞的分化，說明其具有用于預防和改善肥胖癥的潛質。