本發明屬于生物醫用無機材料技術領域，具體涉及一種納米磷酸鈣骨水泥及其制備方法。

背景技術：

口腔頜面部先天畸形、創傷、腫瘤、炎癥等所致的頜骨缺損不僅造成顏面畸形，還可引起語言、咀嚼、呼吸等口腔功能障礙，給患者生理、心理等方面帶來許多不良影響。因此，頜骨缺損一直是臨床治療的重點和難點。骨移植是最常用的治療方法，植骨材料包括自體骨、異體骨、異種骨和人工骨等。其中自體骨被認為是治療骨缺損的“金標準”。但自體骨和異體骨來源有限，異種骨又存在抗原性強等問題，使其臨床應用受到限制。骨組織工程技術以人工骨修復骨缺損，具有損傷小、無抗原性或抗原性甚微，可以準確重建缺損骨的形態等優點。

磷酸鈣骨水泥是20世紀90年代初研制成功的一種具有生物活性的自固型、非陶瓷羥基磷灰石類人工骨材料。其生物相容性好，在固化結晶過程中不產熱，可任意塑形和逐漸降解，并可誘導骨組織長入，符合臨床骨缺損修復的需要。磷酸鈣骨水泥也被用作生長因子的緩釋載體和構建組織工程骨。但其存在缺點，如凝固速度慢，強度低、力學性能差，脆性大且承受載荷的能力差，成骨速度慢，大大限制了應用。

以納米材料對磷酸鈣骨水泥進行改良是一條可行之路。目前開發的納米磷酸鈣骨水泥主要集中在無機非金屬類納米材料，如納米二氧化硅、納米殼聚糖、納米晶體纖維素等。這些無機非金屬類納米材料的添加使磷酸鈣骨水泥中的孔隙和裂紋減少，顆粒尺寸減少，同時納米材料可以發揮補強增韌的作用，從而提高了磷酸鈣骨水泥的強度。但是對其成骨性能方面，還需要通過添加藥物或者生長因子的方式進行進一步改良。基于此，開發可以同時改良物理機械性能又可增強成骨活性的納米磷酸鈣骨水泥亟待解決。

金屬納米材料在生物醫學領域有著廣泛的應用，其具有增強添加物和活性藥物的雙重功能。比如具有超順磁性的γ三氧化二鐵，作為磁共振造影劑已通過fda的認證。近年來，其也開始被添加入骨組織工程的支架材料中以提高支架的機械強度和生物活性。添加的鐵元素隨支架的降解而在局部逐步釋放，可提高干細胞線粒體活性和成骨相關基因的表達。γ三氧化二鐵賦予支架超順磁性，可作為磁性標記的生長因子或干細胞的靶目標而實現定向作用。磁性支架在外加磁場的輔助下可固定于植入的骨缺損區，減少移位。納米金具有良好的納米表面效應、量子效應以及宏觀量子隧道效應，它具有很多良好的化學特性，比如抗氧性和生物相容性，因此在生物醫學領域極具應用潛力。

技術實現要素：

解決的技術問題：本發明的目的是提供一種具有良好機械性能和成骨活性的磷酸鈣骨水泥。同時還提供該納米骨水泥的制備方法。

技術方案：一種納米磷酸鈣骨水泥，是由水溶性納米材料添加到磷酸鈣骨水泥中，調拌均勻后自固化制得。

上述磷酸鈣骨水泥為磷酸四鈣[ca4（po4）2o]和無水磷酸氫鈣[cahpo4]體系；所述磷酸四鈣顆粒尺寸范圍為1μm~80μm；無水磷酸氫鈣尺寸范圍為0.4μm~3μm；磷酸四鈣與無水磷酸氫鈣的摩爾比為1:1-1:3，混合后得到磷酸鈣骨水泥的粉體。

上述水溶性納米材料為表面修飾的納米金、納米γ三氧化二鐵、納米α三氧化二鐵，及上述材料穩定的單分散性膠體溶液或干燥后得到的固體顆粒。

上述表面修飾物為二巰丁二酸（dmsa）、聚葡萄糖山梨醇羧甲醚（psc）、聚乙二醇（peg）或檸檬酸，尺寸為5nm~100nm。

納米磷酸鈣骨水泥的制備方法，步驟為：準備固化液：所述固化液為水、血液、水溶性納米材料的水溶液或5-20wt.%的殼聚糖水溶液；制備固相：按照水溶性納米材料占磷酸鈣骨水泥質量不超過6%混合，制得納米骨水泥固相；以水溶性納米材料的水溶液為骨水泥固化液時，直接以磷酸四鈣和無水磷酸氫鈣混合物為納米骨水泥固相；按照納米骨水泥固相/液相質量比例2:1-4:1，將固化液加入納米骨水泥固相中，調拌均勻；置于37℃100%濕度環境中固化4h-7d。

上述固化液為0.5-50mg/ml水溶性納米材料的水溶液或5-20wt.%殼聚糖水溶液。

上述殼聚糖水溶液為殼聚糖乳酸鹽或者殼聚糖馬來酸鹽的水溶液。

在添加固體水溶性納米材料時，先將固體水溶性納米材料均勻分散在磷酸鈣骨水泥粉體中，再與固化液調拌均勻并固化。

有益效果：本發明選擇生物相容性良好的金屬納米材料與骨水泥基質粉體混合制備納米骨水泥，不僅使材料具有良好的機械性能，而且具有增強的成骨活性。還可以通過調節加入納米材料的種類和數量對納米骨水泥的性能進行調節，如通過添加磁性納米材料來賦予骨水泥以磁性，通過在一定范圍內增加納米材料添加量來增強骨水泥的強度。本發明的納米骨水泥材料制備方法工業簡單，可操作性強，且更能滿足臨床使用需要，具備推廣價值。

附圖說明

圖1為實施例4和對比例（5#）所制備納米骨水泥的彎曲強度圖；

圖2為實施例3（4#）所制備納米骨水泥的掃描電鏡圖；

圖3為實施例4-6（6#、7#、8#）和對比例（5#）所制備的納米骨水泥的磁滯回線圖；

圖4為實施例4-6（6#、7#、8#）和對比例（5#）所制備納米骨水泥的x線衍射圖譜；

圖5為實施例1-2和對比例（1#）所制備納米骨水泥的細胞增殖結果圖；

圖6為實施例1-2和對比例（1#）所制備納米骨水泥的堿性磷酸酶活性檢測結果圖；

圖7為實施例1-2和對比例（1#）所制備納米骨水泥的鈣結節形成定量檢測結果圖。

具體實施方式

下面的實施例可使本專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。

實施例1（2#）

本實施例的納米骨水泥固相為摩爾比為1:3的磷酸四鈣和無水磷酸氫鈣混合物，粉液組分組成為：2份納米骨水泥固相粉體，1份psc包裹的納米γ三氧化二鐵膠體溶液（rosnermh,auerbachm.ferumoxytolforthetreatmentofirondeficiency.expertrevhematol.2011aug;4(4):399-406.）。

其中磷酸四鈣的制備方法如下：用固態反應法合成磷酸四鈣粉末，等摩爾量的無水磷酸氫鈣和碳酸鈣在1500℃爐中煅燒6小時，升溫速度25°c/min，煅燒后冷卻，在球磨機中研磨至平均粒徑為5μm。無水磷酸鈣的平均粒徑為1μm。

其中納米材料為psc包裹的納米γ-三氧化二鐵膠體溶液，平均粒徑9nm，并以其為骨水泥固化液。

本實施例的納米骨水泥采用如下步驟制備：

（1）制備濃度為24mg/ml的psc包裹的納米γ三氧化二鐵膠體溶液作為固化液；

（2）按照粉液質量比2:1取磷酸鈣納米骨水泥固相粉體2份，取納米γ三氧化二鐵膠體溶液1份，將溶液加入固相中調拌均勻，置于37℃100%濕度環境中固化24h-7d。

實施例2（3#）

本實施例的納米骨水泥的制備步驟與實施例1相同，區別在于納米材料為dmsa包裹的納米α三氧化二鐵膠體溶液，濃度為2.55mg/ml，具體的實施例內容為：本實施例的納米骨水泥材料，是由以下粉液組分組成：2份摩爾比為1:3的磷酸四鈣和無水磷酸氫鈣混合物，1份dmsa包裹的納米α三氧化二鐵膠體溶液（sunj,suy,wangc,gun.theinvestigationoffrequencyresponseforthemagneticnanoparticulateassemblyinducedbytime-variedmagneticfield.nanoscalereslett.2011jul14;6:453.）。

其中磷酸四鈣的制備方法如下：用固態反應法合成磷酸四鈣粉末，等摩爾量的無水磷酸氫鈣和碳酸鈣在1500℃爐中煅燒6小時，升溫速度25°c/min，煅燒后冷卻，在球磨機中研磨至平均粒徑為5μm。無水磷酸鈣的平均粒徑為1μm。

其中納米材料為dmsa包裹的納米α三氧化二鐵膠體溶液，平均粒徑50納米，并以其為骨水泥固化液。

本實施例的納米骨水泥采用如下步驟制備：

（1）制備濃度為2.55mg/ml的dmsa包裹的納米α三氧化二鐵膠體溶液作為固化液；

（2）按照粉液質量比比2:1取磷酸鈣納米骨水泥固相粉體2份，取dmsa包裹的納米α三氧化二鐵膠體溶液1份，將溶液加入固相中調拌均勻，置于37℃100%濕度環境中固化24h-7d。

實施例3（4#）

本實施例的納米骨水泥的制備步驟與實施例1相同，區別在于納米材料為檸檬酸包裹的納米金膠體溶液，濃度為0.5mg/ml，具體的實施例內容為：本實施例的納米骨水泥材料，是由以下粉液組分組成：2份摩爾比為1:3的磷酸四鈣和無水磷酸氫鈣混合物，1份檸檬酸包裹的納米金膠體溶液（wangp,sunj,louz,fanf,huk,suny,gun.assembly-inducedthermogenesisofgoldnanoparticlesinthepresenceofalternatingmagneticfieldforcontrollabledrugreleaseofhydrogel.advmater.2016dec;28(48):10801-10808.）。

其中磷酸四鈣的制備方法如下：用固態反應法合成磷酸四鈣粉末，等摩爾量的無水磷酸氫鈣和碳酸鈣在1500℃爐中煅燒6小時，升溫速度25°c/min，煅燒后冷卻，在球磨機中研磨至平均粒徑為5μm。無水磷酸鈣的平均粒徑為1μm。

其中納米材料為檸檬酸包裹的納米金膠體溶液，平均粒徑18nm，并以其為骨水泥固化液。

本實施例的納米骨水泥采用如下步驟制備：

（1）制備濃度為0.5mg/ml的檸檬酸鈉包裹的納米金膠體溶液作為固化液；

（2）按照粉液質量比2:1取磷酸鈣納米骨水泥固相粉體2份，取檸檬酸鈉包裹的納米金膠體溶液1份，將溶液加入固相中調拌均勻，置于37℃100%濕度環境中固化24h-7d。

實施例4

本實施例的納米骨水泥材料，是由以下重量份的組分組成：100份摩爾比為1:3的磷酸四鈣和無水磷酸氫鈣混合物，psc包裹的納米γ三氧化二鐵為1份（6#）。

其中磷酸四鈣的制備方法如下：用固態反應法合成磷酸四鈣粉末，等摩爾量的無水磷酸氫鈣和碳酸鈣在1500℃爐中煅燒6小時，升溫速度25℃/min，煅燒后冷卻，在球磨機中研磨至平均粒徑為5μm。無水磷酸鈣的平均粒徑為1μm。

其中納米材料為psc包裹的納米γ三氧化二鐵顆粒，由其穩定膠體溶液經噴霧干燥法獲得。

骨水泥固化液的制備，稱取0.5克乳酸化殼聚糖，溶解于10ml水中，制備得到濃度為5wt.%乳酸殼聚糖水溶液。

本實施例的納米骨水泥采用如下步驟制備：

（1）制備濃度為5wt.%乳酸殼聚糖溶液的骨水泥固化液；

（2）按照取磷酸鈣納米骨水泥固相粉體100份，取psc包裹的納米γ三氧化二鐵顆粒0-6份，將納米顆粒添加入骨水泥粉體并調拌均勻，得到納米骨水泥固相粉體；

（3）以粉液質量比2:1，將5wt.%乳酸殼聚糖溶液加入固相中調拌均勻，并置于37℃100%濕度環境中固化24h-7d。

實施例5

本實施例的納米骨水泥材料，是由以下重量份的組分組成：100份摩爾比為1:3的磷酸四鈣和無水磷酸氫鈣混合物，psc包裹的納米γ三氧化二鐵為3份（7#）。

其中磷酸四鈣的制備方法如下：用固態反應法合成磷酸四鈣粉末，等摩爾量的無水磷酸氫鈣和碳酸鈣在1500℃爐中煅燒6小時，升溫速度25℃/min，煅燒后冷卻，在球磨機中研磨至平均粒徑為5μm。無水磷酸鈣的平均粒徑為1μm。

其中納米材料為psc包裹的納米γ三氧化二鐵顆粒，由其穩定膠體溶液經噴霧干燥法獲得。

骨水泥固化液的制備，稱取0.5克乳酸化殼聚糖，溶解于10ml水中，制備得到濃度為5wt.%乳酸殼聚糖水溶液。

本實施例的納米骨水泥采用如下步驟制備：

（1）制備濃度為5wt.%乳酸殼聚糖溶液的骨水泥固化液；

（2）按照取磷酸鈣納米骨水泥固相粉體100份，取psc包裹的納米γ三氧化二鐵顆粒0-6份，將納米顆粒添加入骨水泥粉體并調拌均勻，得到納米骨水泥固相粉體；

（3）以粉液質量比2:1，將5wt.%乳酸殼聚糖溶液加入固相中調拌均勻，并置于37℃100%濕度環境中固化24h-7d。

實施例6

本實施例的納米骨水泥材料，是由以下重量份的組分組成：100份摩爾比為1:3的磷酸四鈣和無水磷酸氫鈣混合物，psc包裹的納米γ三氧化二鐵為6份（8#）。

其中磷酸四鈣的制備方法如下：用固態反應法合成磷酸四鈣粉末，等摩爾量的無水磷酸氫鈣和碳酸鈣在1500℃爐中煅燒6小時，升溫速度25℃/min，煅燒后冷卻，在球磨機中研磨至平均粒徑為5μm。無水磷酸鈣的平均粒徑為1μm。

其中納米材料為psc包裹的納米γ三氧化二鐵顆粒，由其穩定膠體溶液經噴霧干燥法獲得。

骨水泥固化液的制備，稱取0.5克乳酸化殼聚糖，溶解于10ml水中，制備得到濃度為5wt.%乳酸殼聚糖水溶液。

本實施例的納米骨水泥采用如下步驟制備：

（1）制備濃度為5wt.%乳酸殼聚糖溶液的骨水泥固化液；

（2）按照取磷酸鈣納米骨水泥固相粉體100份，取psc包裹的納米γ三氧化二鐵顆粒0-6份，將納米顆粒添加入骨水泥粉體并調拌均勻，得到納米骨水泥固相粉體；

（3）以粉液質量比2:1，將5wt.%乳酸殼聚糖溶液加入固相中調拌均勻，并置于37℃100%濕度環境中固化24h-7d。

對比例

本實施例的骨水泥材料與實施例1基本相同，區別在于以水（1#）或5wt.%乳酸殼聚糖溶液（5#）為骨水泥固化液。所以本對比例中骨水泥未添加納米材料。

檢測例

將實施例1-4和對比例進行如下性能試驗：

1.抗壓強度和彈性模量的測定

取固相粉末與液相攪拌均勻后，將樣品制成3×4×20mm的長條狀試樣，將其在相對濕度100％的37℃恒溫箱內養護72h，使用萬能材料測試儀instron5500nr測試其抗壓強度，加載速度1mm/min，跨距為20mm。每組選取5個無損試樣，測試其平均值。具體的測定結果如圖1所示：納米骨水泥的彎曲強度。可以看出，不添加納米材料的骨水泥的彎曲強度為4mpa左右，但是本發明的納米骨水泥材料中摻入了納米鐵，材料的力學性能得到了提高。當摻入比例為3wt.%左右，材料的抗壓強度達到8mpa左右。

2.磁性測試

將材料制成直徑6毫米，厚1毫米的圓片，使用振動樣品磁強計（lakeshore7410）檢測其磁性。磁滯回線可以看出，材料出現了超順磁性，且磁性強度隨納米材料的添加量而增加（圖3）。超順磁性能提高材料的磁生熱能力。

3.材料的晶相組成。當磷酸四鈣與無水磷酸鈣的摩爾比為1:1時，固相粉體和液相調和后會發生反應生成羥基磷灰石[ca5（po4）3oh]。而當磷酸四鈣與無水磷酸鈣的摩爾比小于1時，會生成缺鈣磷灰石。從材料的x射線衍射圖譜可見，納米材料的加入對骨水泥晶相形成沒有影響（圖4）。

4.細胞增殖性能檢測

將材料烘干消毒，加入培養基中，37℃預孵育后，進行細胞實驗。取復蘇后生長旺盛的人牙髓干細胞接種（密度為6×10³個/ml）48孔培養板內。細胞培養1d、4d、7d和14d后，加入含10%cck-8的培養基，37℃下繼續培養2h，終止培養，吸取液體至96孔板內，用酶標儀在450nm波長下讀取吸光度值，記錄結果。做3個平行樣，具體測定結果如圖5。從圖5可以看出，納米骨水泥的細胞相容性良好。

5.細胞分化性能檢測（堿性磷酸酶活性檢測）

用吸管吸掉96孔板內的培養液，用pbs沖洗3遍，加入含25mmol/l二乙醇胺，1mmol/l氯化鎂和6.7mmol/lpnpp的反應液。每孔150μl在37℃避光放置30min，然后加0.1mol/l氫氧化鈉100μl終止反應，用酶標儀于405nm波長下測定od值。樣品od值在alp標準曲線上讀取酶活性值。將測得的od值除以同批細胞的蛋白含量均值進行統計分析，以消除細胞總蛋白量不同對alp值的影響。具體測定結果如圖6。從圖6可以看出，納米骨水泥的堿性磷酸酶活性增高。

6.鈣化結節染色和定量檢測

用茜素紅法對鈣化結節進行染色，吸棄原培養基，用1×pbs沖洗，用10%福爾馬林在室溫固定30min，再用1×pbs沖洗一次，用2%茜素紅染料室溫避光染色45min。用1×pbs沖洗2次。然后用10%的氯化十六烷基吡啶溶解后進行定量檢測，溶解15min，用酶標儀在波長550nm讀取吸光度值。具體測定結果如圖7。從檢測結果可以看出，納米骨水泥的鈣化結節形成量顯著增加。