本發明屬于納米制劑，具體涉及一種ros和酯酶雙響應型納米制劑及其制備方法和應用。

背景技術：

1、急性肝損傷(acute?liver?injury，ali)是一種在短時間內由多種因素導致的肝臟氧化應激加劇、產生炎癥反應以及肝細胞凋亡或壞死的臨床綜合征，通常是由病毒感染、酒精濫用、缺血、藥物中毒或者其他外界因素引起的。藥物性肝損傷(drug-induced?liverinjury,dili)，特別是對乙酰氨基酚(acetaminophen，apap，一種常見的解熱鎮痛藥)引起的肝損傷發生率不斷上升，已經成為目前急性肝功能衰竭的主要原因。

2、通常，癥狀較輕者僅會出現肝功能異常，停止服用相關藥物之后即可自行恢復，但是由于臨床的不確定性，會導致遺漏其他原因以至于未能給予進一步的干預治療，從而導致病情加重。目前主要有兩種治療方法被批準用于治療藥物誘導的急性肝損傷患者。一種是通過快速清除有毒藥物來限制其吸收，防止造成進一步的肝毒性。例如活性炭被廣泛用于治療藥物過量攝取，如對乙酰氨基酚、巴比妥和卡馬西平。但是由于其治療效果僅限于急性攝入有毒藥物3-4小時之內，因此這種治療方法高度依賴于患者及時入院進行治療、醫生對潛在的dili的識別以及醫療資源的可用性。另一種被廣泛認可的治療方法是使用藥物特異性解毒劑，例如n-乙酰半胱氨酸(n-acetyl-l-cysteine，nac)，其可以促進肝細胞中谷胱甘肽(glutathione，gsh)的合成以消耗具有毒性的n-乙酰苯醌亞胺(n-acetyl-p-benzoquinoneimine，napqi)，是目前唯一獲得批準的dili解毒劑。但是，在臨床治療中，nac只能在apap中毒后8h內有治療效果，一旦錯估最佳治療時機，唯一的補救措施可能是肝移植。即使及時就醫，靜脈注射nac也會伴有嚴重的惡心、嘔吐、過敏以及其他的常見的不良反應。

3、因此，開發新的治療急性肝損傷的納米制劑具有重要意義。

技術實現思路

1、本發明的目的在于克服上述現有技術中存在的問題，提供一種ros和酯酶雙響應型納米制劑及其制備方法和應用。

2、本發明是通過下述技術方案進行實現的：

3、第一方面，本發明提供一種ros和酯酶雙響應型納米制劑，所述納米制劑包括疏水核心和親水外殼；所述疏水核心由支化點和疏水單體縮聚而成，所述支化點包括1,3,5-三羥基苯、1,3,5-苯三甲醇、三聚氯氰、甘油中的至少一種；所述疏水單體的結構通式如式ⅰ所示：

4、

5、其中，r1如式ⅱ-式ⅵ所示：

6、

7、本發明利用藥物性肝損傷病灶部位中高濃度的ros微環境以及衣康酸抗炎功效，構建了一種治療急性肝損傷的刺激響應納米顆粒。通過縮合聚合反應，合成了基于衣康酸骨架的ros和酯酶雙響應的超支化聚合物，納米制劑的疏水核心是以ros響應的縮硫酮醇和具有抗炎作用的衣康酸為主要原料，通過縮聚反應合成，最后通過酯化反應修飾親水外殼。支化點的剛性結構和疏水單體共同充當納米顆粒的疏水內腔，確保了結構的內部穩定性。由于外源性衣康酸在細胞膜上滲透性較差，本發明通過改性修飾衣康酸，將其作為超支化聚合物骨架，確保該藥物能夠有效到達炎癥部位后。該納米制劑在ros的刺激下，聚合物硫縮酮骨架先響應崩解，然后在酯酶的進一步作用下將衣康酸藥物活性成分釋放，顯著提高外源性衣康酸的細胞膜滲透性和生物利用度；其次，與封裝治療劑的納米制劑相比，本發明的納米制劑具有純的藥物核心因此具有較高的載藥量以及較低的毒副作用，除此之外，本發明的納米制劑將治療劑作為納米載體骨架可以有效避免治療劑過早泄露以及母體藥物釋放后外來物質的去除問題。

8、優選地，所述親水外殼包括聚乙二醇和聚乙二醇-甘露糖。

9、為了實現更好的治療效果，將納米制劑有效地靶向遞送到巨噬細胞中，本發明親水外殼包括聚乙二醇和聚乙二醇-甘露糖，其中甘露糖修飾后的聚乙二醇衍生物作為靶頭，親水鏈末端的甘露糖具有提高納米制劑靶向巨噬細胞的能力，可以有效避免被其他部位的攝取，實現體內長循環。

10、優選地，所述疏水核心和親水外殼的摩爾比為1：(0.1-0.4)。

11、更優選地，所述疏水核心和親水外殼的摩爾比為1：0.25。

12、更優選地，所述聚乙二醇和所述聚乙二醇甘露糖中的聚乙二醇的相對分子質量各自獨立地為0.2-10kda，各自獨立地包括peg200、peg400、peg1k、peg2k中的至少一種。

13、優選地，所述納米制劑由疏水核心和親水外殼偶聯得到。

14、更具體的，先將所述疏水核心與聚乙二醇進行偶聯，再與聚乙二醇-甘露糖偶聯，得到所述納米制劑。

15、所述疏水核心和親水外殼通過酯化反應連接。

16、優選地，所述聚乙二醇(例如peg1000)與聚乙二醇-甘露糖(例如peg1000-man)的摩爾比為1：0.25。

17、第二方面，本發明提供一種所述ros和酯酶雙響應型納米制劑的制備方法，包括以下步驟：

18、(1)衣康酸酐和ros響應化合物經酯化反應，得疏水單體；

19、(2)將步驟(1)所得疏水單體和支化點在縮合劑作用下，進行縮聚，得到疏水核心；

20、(3)在縮合劑作用下，將步驟(2)所得疏水核心與親水外殼進行偶聯，再進行自組裝，得到所述納米制劑；

21、所述ros響應化合物的結構如式ⅴ所示：

22、其中r1為權利要求1中所述的式ⅱ-式ⅵ。

23、優選地，當所述ros響應化合物中r1為式ⅱ時，所述ros響應化合物的制備方法包括以下步驟：

24、s1.將巰基丙酸和丙酮在催化劑作用下反應，得到中間產物；

25、s2.將步驟s1所得中間產物在還原劑作用下，進行還原反應，即得所述ros響應化合物；

26、所述中間產物的結構如式ⅵ所示：

27、

28、本發明納米制劑將衣康酸偶聯到響應性硫縮酮兩端作為疏水單體，與支化點縮聚合成疏水核心，外圍修飾親水核心形成超支化聚合物，對該聚合物進一步進行自組裝，得到能夠治療急性肝損傷，尤其是藥物性肝損傷的超支化聚合物納米顆粒。疏水核心發生ros和酯酶響應后，釋放的衣康酸可以發揮抗炎、抗氧化以及調節細胞死亡信號通路的作用。本發明實現了基于衣康酸骨架的ros和酯酶雙響應型超支化聚合物的快速制備以高效遞送外源性衣康酸，使超支化聚合物納米制劑具備精準遞送、減輕炎癥反應以及逆轉急性肝損傷的多重功效。這種技術的提出具有潛在的臨床應用價值和未來應用前景，為治療藥物性肝損傷提供了新方向。

29、優選地，所述步驟s1中，所述催化劑包括三氟乙酸(tfa)。

30、優選地，所述步驟s1中，所述催化劑、丙酮和巰基丙酸的摩爾比為0.01：(0.8-2.0)：(2.0-3.0)，更優選為0.01：1.0：2.2。

31、優選地，所述步驟s2中，所述還原劑包括硼烷二甲硫醚(bh3·sme2)。

32、優選地，所述步驟s2中，所述中間產物和還原劑的摩爾比為1：(1.5-4.5)，更優選為1：3。

33、優選地，當所述ros響應化合物中r1為式ⅲ時，所述ros響應化合物的制備方法包括以下步驟：將硒粉和2-溴乙醇在硼氫化鈉的作用下進行反應，得到所述ros響應化合物。

34、優選地，所述硒粉與所述2-溴乙醇的摩爾比為1：(0.5-1.5)；更優選為1：0.95。

35、優選地，所述步驟(1)中，所述ros響應化合物和衣康酸酐的摩爾比為1：1：(1.8-6)。

36、更優選地，所述步驟(1)中，所述ros響應化合物和衣康酸酐的摩爾比為1：2.1。

37、優選地，所述步驟(1)中，所述酯化反應的溫度為25℃-80℃，時間為24h-72h。

38、優選地，所述步驟(1)中，所述酯化反應的溶劑包括甲苯和正己烷。

39、優選地，所述步驟(2)中，所述支化點與疏水單體的摩爾比為1：(1-6)。

40、更優選地，所述步驟(2)中，所述支化點與疏水單體的摩爾比為1：3。

41、本發明中，支化點與疏水單體的摩爾比可為1：1、1：3、1：6中的任意一者。

42、優選地，所述步驟(3)中，先將疏水核心與聚乙二醇進行偶聯，再與聚乙二醇-甘露糖偶聯，得到親水外殼，所述疏水核心與所述聚乙二醇、聚乙二醇-甘露糖的摩爾比為1：(0.1-1)：(0.01-0.1)；更優選地，所述疏水核心與所述聚乙二醇、聚乙二醇-甘露糖的摩爾比為1：0.25：0.0625。

43、優選地，所述步驟(2)和步驟(3)中，所述縮合劑包括二環己基碳二亞胺(dcc)/n,n-二異丙基乙胺(dipea)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edci)/4-二甲氨基吡啶(dmap)、二環己基碳二亞胺(dcc)/4-二甲氨基吡啶(dmap)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edci)/三乙胺(tea)中的任意一種。

44、優選地，所述步驟(2)中，所述縮聚的時間為12h-72h。

45、優選地，所述步驟(3)中，所述偶聯的時間為12h-72h。

46、優選地，所述疏水核心的結構式如式ⅷ所示：

47、

48、其中，r為中的一種；

49、r1為中的一種。

50、式ⅷ所示結構為本發明超支化聚合物結構的代表性單元。

51、優選地，所述步驟(3)中，所述自組裝采用快速納米沉淀(fnc)法；更優選地，所述快速納米沉淀法中，油相溶劑包括二甲基亞砜(dmso)、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、乙腈、甲醇、四氫呋喃中的一種；油相與水相按照1：(6-9)的比例(比如1：6、1：8、1：9)進行納米絡合；流速比例的油相：水相：水相按照(1-3)：(4.5-13.5)：(4.5-13.5)(比如1：4.5：4.5、2：9：9、3：13.5：13.5)進行；去除油相溶劑的方法包括透析、旋蒸、真空干燥的至少一種。

52、本發明采用快速納米沉淀(flash?nanocomplexation，fnc)平臺對納米顆粒的參數進行調控可以得到尺寸均一、病理生理條件下穩定性好、藥代動力學強的納米顆粒。

53、在本發明一個具體實施方式中，所述自組裝過程如下：通過fnc納米自組裝平臺，在三通道受限沖擊射流反應器(three-channels?confined?impinging?jet,cij)的通道1中注入溶解在有機相dmso中的縮聚后的聚合物(1-16mg/ml)溶液，并在其他兩個通道中注入超純水，然后通過數控高壓注射泵以恒定的預設流速將三通道內的溶液充分混合，制備出均勻的納米顆粒，再通過使用透析袋(截留分子量:14kda)在超純水中透析，除去有機相，即得所述納米制劑。

54、優選地，本發明制得的納米制劑的形狀為球形顆粒，納米制劑的粒徑為50nm-150nm，納米制劑的多分散指數pdi為0.05-0.35，納米制劑的zeta電位為-10mv～-40mv。

55、優選地，本發明的納米制劑采用凍干制劑形式進行保存；將自組裝后的納米顆粒水溶液與凍干保護劑混合，并在-80℃的條件下冷凍，將凍結物避光放入凍干機中制作凍干；凍干制劑將鹽類用作制劑重懸緩沖劑，平衡冷凍干燥保存過程中的ph值；

56、凍干保護劑選用醇類凍干保護劑和糖類凍干保護劑，所述醇類凍干保護劑為木糖醇、甘露醇、山梨醇或甘氨酸中的任意一種或多種的組合；所述糖類凍干保護劑為葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、麥芽糖、麥芽多糖、果聚糖或菊糖中的任意一種或多種的組合；

57、所述凍干保護劑的濃度選擇0％、5％、10％、15％、20％、25％中的一種；鹽類緩沖劑為鹽類選擇磷酸鈉或磷酸鉀中的任意一種或兩種的組合。

58、第三方面，本發明提供所述ros和酯酶雙響應型納米制劑在制備治療急性肝損傷藥物中的應用。

59、優選地，本發明提供所述ros和酯酶雙響應型納米制劑在制備治療藥物性肝損傷藥物中的應用。

60、本發明納米制劑可通過注射的形式，對急性肝損傷，尤其是藥物性肝損傷，比如apap引起的藥物性肝損傷進行治療。

61、優選地，所述納米制劑在肝臟中治療的衣康酸濃度范圍為0.5mg/kg-50mg/kg。

62、本發明具有如下有益效果：

63、(1)本發明的納米制劑到達炎癥部位后，在接觸高濃度的ros微環境后酮縮硫醇響應斷鍵，消耗ros減輕氧化應激。同時，細胞內在酯酶的進一步作用下將納米制劑中的衣康酸藥物成分釋放出來，產生抗炎抗氧化作用，并阻斷多條細胞死亡信號通路。

64、(2)本發明采用還原、酯化等化學手段合成疏水單體，進一步可采用重結晶、柱層析和萃取等手段對產物進行分離提純。其中，本發明的疏水單體適應范圍廣泛；縮聚方法簡便、成本較低、反應效率高；分子設計能力強，可以制備樹枝狀、星狀聚合物。

65、(3)本發明的技術具有較好的普適性，可以靈活的調控疏水單體和支化點的比例構建一系列載藥量不同的藥物遞送平臺，并且具有連續、大規模、分布窄以及批次間重現性高的優點，為治療急性重癥疾病的治療提供了一個新思路。