本發明屬于神經修復材料，具體涉及一種用于脊髓損傷修復的工程支架及其構建方法。

背景技術：

1、脊髓損傷(spinal?cord?injury，sci)是一種嚴重的中樞神經系統損傷性疾病，神經元死亡和軸突的斷裂會導致運動、感覺以及自主運動功能障礙。在過去30年中，其全球流行率已從每百萬人236例增加到1298例，根據《柳葉刀》的數據顯示，脊髓損傷的兩個主要原因是跌倒和交通事故，發病率隨年齡增加而增加，并且在大約20歲到約84歲之間保持高于50,000例的水平，頸髓損傷占總發病率的54.2％，而頸髓以下損傷占總發病率的45.8％。據加拿大相關機構統計，每名sci患者一生的總成本超過300萬美元，而該項病因導致的總經濟負擔更是高達近26.7億美元。目前臨床上遇到sci病人時，僅僅局限于借用一些藥物并結合少量的物理治療手段來減緩癱瘓程度。因此，sci的治療一直是困擾醫學界的世界性難題之一。

2、同時，目前脊髓損傷修復領域研究較多的是通過構建人工支架材料并植入脊髓損傷區域的修復方案。例如授權公告號為cn101278865b的中國發明專利公開了一種分區式組織工程脊髓，該工程脊髓包括脊髓外導管、中央導管，在脊髓外導管中設置與脊髓灰質形狀相同的灰質導管，在白質區域中按上行纖維束、下行纖維束的幾何形態分別設置相應的導管，：構成分區式組織工程脊髓的種子細胞是骨髓基質干細胞、神經干細胞、雪旺氏細胞、嗅鞘細胞、胚胎干細胞中的一種或幾種。這種分區式組織工程脊髓雖然可以通過分隔小區中的纖維成份引導神經元及神經膠質細胞遷移，起到有利于神經纖維延伸的作用，在一定程度上實現了了脊髓損傷修復。但由于sci會導致脊髓損傷及其周圍神經元和膠質細胞的死亡，并導致附近軸突的中斷，引發整個神經系統改變，包括脊髓損傷上方和下方原理損傷環路的變化。雖然sci破壞了調節運動和自主功能的電路之間的通信流，并形成了炎癥微環境，但未損傷部位依然有殘留下行纖維的局部再生。在不完全損傷的情況下，可以于大腦或損傷部位施加刺激源，可以重新激活脊髓中的環路或加強大腦和脊髓之間的連接強度，而當sci嚴重時，環路的重建需要在損傷部位重新生長切斷的軸突以恢復連接。cst由大腦皮層的第五層大錐體神經元發出下行纖維組成，直接或間接地陸續終止于脊髓前角運動神經元，控制四肢和軀體的自主運動，cst被認為是恢復自主運動功能的關鍵要素。而前述工程脊髓并不能有效促進神經元與損傷部位恢復連接，因此很大程度上影響脊髓損傷的治療效果。

技術實現思路

1、為了解決上述技術問題，本發明首先提供了一種用于脊髓損傷修復的工程支架，該工程支架能有效促進神經元與損傷部位恢復連接，進一步強化脊髓損傷的治療效果。

2、為了實現上述目的，本發明提供一種用于脊髓損傷修復的工程支架，所述工程支架包括柱狀支架主體，及包裹于柱狀支架主體外側壁的管狀外套膜，所述柱狀支架主體為多孔隙明膠海綿制成的多孔隙結構，所述管狀外套膜的材料為生物降解材料；所述柱狀支架主體的多孔隙結構內分布有神經干細胞及雪旺細胞，所述神經干細胞經adv-trkc轉染，所述雪旺細胞經adv-nt-3轉染；所述柱狀支架主體的多孔隙結構內還彌散分布有aav-cmv-musk-gfp(dj型)腺相關載體病毒，及raav-hsyn-agrin-mcherry腺相關載體病毒。

3、發明人通過大量實驗研究發現，聚集蛋白(agrin)和酪氨酸受體激酶(musk)之間的粘附特性，通過聚集蛋白和酪氨酸受體激酶可以為未重建再生cst與移植靶神經元間的突觸進行連接。突觸前膜的聚集蛋白易與突觸后膜上酪氨酸受體激酶特異性粘附，并激活突觸后膜上乙酰膽堿受體(acetylcholine?receptor，achr)/musk/低密度脂蛋白受體相關蛋白4(low-density?lipoprotein?receptor-related?protein?4，lrp4)復合物形成，引起酪氨酸磷酸化，激活靶神經元絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated?protein?kinase,mapk)/環磷腺苷效應元件結合蛋白(camp-response?element?binding?protein，creb)信號通路，促進神經元間突觸信號的傳遞。而本發明的工程支架通過aav-cmv-musk-gfp(dj型)腺相關病毒使神經干細胞過表達酪氨酸受體激酶(musk)，通過內層柱狀多孔隙結構內具有緩釋效果的raav-hsyn-agrin-mcherry腺相關病毒轉染損傷部位神經元細胞，促使其過表達聚集蛋白(agrin)，進而觸前膜的聚集蛋白激活突觸后膜上乙酰膽堿受體低密度脂蛋白受體相關蛋白復合物形成，引起酪氨酸磷酸化，激活靶神經元絲裂原活化蛋白激酶環磷腺苷效應元件結合蛋白信號通路，促進神經元間突觸信號的傳遞，從而促進脊髓損傷的修復，為臨床治療脊髓損傷提供新策略。

4、另外，由于管狀外套膜包覆多孔隙明膠海綿，其能促使多孔隙明膠海綿吸收組織間水份發生膨脹時反向減少多孔隙明膠海綿之間的間隙，減少向外膨脹，即管狀外套膜能夠改善柱狀支架主體的溶脹效應，使得工程支架在移植后不會周圍組織造成壓迫，避免造成脊髓的二次損傷。

5、具體的，所述aav-cmv-musk-gfp(dj型)腺相關載體病毒的載體還可以是腺病毒及慢病毒。腺病毒及慢病毒作為過表達酪氨酸受體激酶(musk)的載體病毒，在載體構建、表達等方面均有較強優勢。

6、具體的，所述raav-hsyn-agrin-mcherry腺相關載體病毒攜帶如seq?id?no:1所示的agrin基因的dna序列。該載體病毒轉染神經元后促使其過表達聚集蛋白(agrin)。

7、優選的，所述raav-hsyn-agrin-mcherry腺相關載體病毒的載體還可以是腺病毒及慢病毒。

8、優選的，所述內層柱狀多孔隙結構內負載nt-3。nt-3能夠結合受體酪氨酸激酶(rtk)，從而支持神經元的存活及發育。

9、優選的，所述管狀外套膜的材料為甲基丙烯酰化明膠，優選的，管狀外套膜由脫細胞視神經外膜制成。脫細胞視神經外膜即去除了免疫原性，又具有與受體神經外膜組織相似的理化特性，也更益于管狀外套膜在受體體內的降解、吸收。

10、本發明還提供一種用于脊髓損傷修復的工程支架的構建方法，該構建方便包括如下步驟：

11、(1)柱狀支架主體構建

12、采用多孔隙明膠海綿制備成多孔隙結構的柱狀支架主體，另用生物降解材料制備成管狀外套膜，分別將管狀外套膜及柱狀支架主體滅菌后備用；

13、(2)種子細胞培養

14、構建轉酪氨酸激酶c基因重組腺病毒adv-trkc，體外培養神經干細胞，用adv-trkc轉染神經干細胞，制成trkc基因修飾神經干細胞懸液；構建神經營養素-3基因重組腺病毒adv-nt-3，體外培養雪旺細胞，用adv-nt-3轉染雪旺細胞，制成過表達nt-3雪旺細胞懸液；

15、(3)種子細胞的支架種植、培養

16、將trkc基因修飾神經干細胞懸液注入支架內；將過表達nt-3雪旺細胞懸液注入到trkc基因修飾神經干細胞周圍，對完成種子細胞種植的支架進行培養，使trkc基因修飾神經干細胞分化為有功能的神經元，使過表達nt-3雪旺細胞分化形成少突膠質細胞，進一步體外培養支架，使得包繞于神經元周圍的少突膠質細胞繼續分化形成脊髓神經纖維結構；

17、(4)支架主體過表達musk

18、構建酪氨酸受體激酶基因重組腺病毒aav-cmv-musk-gfp(dj型)，在分化形成脊髓神經纖維結構的支架的培養液中加入aav-cmv-musk-gfp(dj型)，培養24h形成過表達musk脊髓神經支架后更換為無血清培養液；

19、(5)構建聚集蛋白基因重組腺病毒raav-hsyn-agrin-mcherry，在過表達musk脊髓神經支架的培養液中加入raav-hsyn-agrin-mcherry腺相關病毒培養液，再將管狀外套膜包覆柱狀支架主體形成支架培養備用。

20、具體的，所述trkc基因修飾神經干細胞懸液與過表達nt-3雪旺細胞懸液滴加體積比為3:1。

21、具體的，所述aav-cmv-musk-gfp(dj型)腺相關病毒的濃度為moi＝100。

22、具體的，所述raav-hsyn-agrin-mcherry腺相關病毒培養液的病毒濃度為moi＝100。

23、本發明的有益效果為：

24、本發明的工程支架通過aav-cmv-musk-gfp(dj型)腺相關病毒使神經干細胞過表達酪氨酸受體激酶(musk)，通過內層柱狀多孔隙結構內具有緩釋效果的raav-hsyn-agrin-mcherry腺相關病毒轉染損傷部位神經元細胞，促使其過表達聚集蛋白(agrin)，進而觸前膜的聚集蛋白激活突觸后膜上乙酰膽堿受體低密度脂蛋白受體相關蛋白復合物形成，引起酪氨酸磷酸化，激活靶神經元絲裂原活化蛋白激酶環磷腺苷效應元件結合蛋白信號通路，促進神經元間突觸信號的傳遞，從而促進脊髓損傷的修復，為臨床治療脊髓損傷提供新策略。