本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥材料，具體涉及一種葡萄糖響應(yīng)型的遺傳物質(zhì)遞送水凝膠的制備方法。

背景技術(shù)：

1、糖尿病慢性創(chuàng)面的治療是臨床治療中的重大挑戰(zhàn)之一，其愈合困難主要源于慢性高糖環(huán)境引起的持續(xù)性炎癥反應(yīng)、活性氧(ros)水平升高、局部缺氧以及巨噬細(xì)胞極化失衡等一系列復(fù)雜因素。這些病理特征導(dǎo)致了局部血管生成受阻、成纖維細(xì)胞功能受損以及細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)沉積不足，從而嚴(yán)重延緩甚至阻礙了傷口的正常愈合。據(jù)統(tǒng)計(jì)，糖尿病創(chuàng)面患者的截肢率遠(yuǎn)高于非糖尿病患者，而這些患者的預(yù)期壽命也因此顯著縮短。

2、根據(jù)已有文獻(xiàn)，mir-146a作為一種重要的調(diào)控因子，在糖尿病創(chuàng)面中普遍表現(xiàn)為下調(diào)，而在正常創(chuàng)面中則保持穩(wěn)定表達(dá)。研究表明，過度遞送mirna可能引起非特異性基因干擾，甚至導(dǎo)致免疫和代謝異常。

3、為解決糖尿病創(chuàng)面愈合問題，目前已有諸多治療策略被提出，例如局部使用抗炎藥物、抗氧化劑、外用敷料或功能性水凝膠等。然而，這些傳統(tǒng)治療方式存在顯著不足。例如，局部抗炎效果有限：高糖環(huán)境下，巨噬細(xì)胞難以有效從m1型極化向m2型轉(zhuǎn)變，炎癥長期持續(xù)。另外，抗氧化效率不足：現(xiàn)有抗氧化劑無法快速清除創(chuàng)面高濃度的ros，ros持續(xù)累積會(huì)進(jìn)一步破壞組織。最關(guān)鍵的是，缺乏智能響應(yīng)性：大多數(shù)材料難以對(duì)創(chuàng)面微環(huán)境(如高濃度葡萄糖)產(chǎn)生特異響應(yīng)，導(dǎo)致藥物釋放效率低下。硼酸酯鍵是一種動(dòng)態(tài)共價(jià)鍵，具有動(dòng)態(tài)可逆性，利用其對(duì)葡萄糖的敏感性，形成一種葡萄糖響應(yīng)型的遺傳物質(zhì)遞送水凝膠，用于糖尿病創(chuàng)面的治療，具有積極的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提供一種葡萄糖響應(yīng)型的遺傳物質(zhì)遞送水凝膠的制備方法，利用硼酸酯鍵對(duì)葡萄糖的敏感性，將gox、mno2、mir-146a負(fù)載在水凝膠中，結(jié)合gox催化降解葡萄糖、mno2納米顆粒的抗氧化和氧氣生成能力，以及mir-146a的精準(zhǔn)遞送機(jī)制，形成葡萄糖響應(yīng)型的遺傳物質(zhì)遞送水凝膠。本發(fā)明通過在水凝膠中引入硼酸酯鍵，實(shí)現(xiàn)了高糖環(huán)境下水凝膠的形態(tài)調(diào)控，并達(dá)到高糖快速釋放gox的目的。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

3、本發(fā)明的目的在于提供一種葡萄糖響應(yīng)型的遺傳物質(zhì)遞送水凝膠的制備方法，包括以下步驟：

4、1)中空納米顆粒制備：采用化學(xué)刻蝕法通過sio2模板合成中空mno2納米顆粒；

5、2)負(fù)載microrna的復(fù)合物的制備：利用陽離子聚合物修飾步驟1)得到的中空mno2納米顆粒，然后加入microrna，得到負(fù)載microrna的復(fù)合物；

6、3)水凝膠與納米顆粒復(fù)合：將步驟2)得到的負(fù)載microrna的復(fù)合物、水凝膠、以及gox混合后，得到葡萄糖響應(yīng)型的遺傳物質(zhì)遞送水凝膠。

7、進(jìn)一步的，所述中空mno2納米顆粒的制備方法為：向sio2水分散液中加入kmno4，超聲、離心、水洗后，將得到的沉淀用na2co3溶液進(jìn)行分散，得到中空mno2納米顆粒。

8、進(jìn)一步的，所述sio2水分散液的濃度為35～70mg/ml。

9、進(jìn)一步的，所述sio2選用納米sio2，粒徑為100～200nm。

10、進(jìn)一步的，所述sio2與kmno4的摩爾比為1：3～5。

11、進(jìn)一步的，所述陽離子聚合物選用pei。

12、進(jìn)一步的，所述負(fù)載microrna的復(fù)合物的制備方法為：將中空mno2納米顆粒加入到pei溶液中磁力攪拌1.5～3h使其分散均勻，離心水洗2次后得到hmno2@pei；用pbs溶解microrna，然后將溶液加入hmno2@pei中進(jìn)行攪拌，離心水洗后得到所述負(fù)載microrna的復(fù)合物。

13、進(jìn)一步的，所述中空mno2納米顆粒與microrna的質(zhì)量比為5～20mg：0.5～2od。

14、進(jìn)一步的，所述水凝膠為gc-pba+paa-da水凝膠，所述gc-pba+paa-da水凝膠的制備方法為：將羥乙基脫乙酰殼多糖與3-羧基苯硼酸形成gc-pba，將聚丙烯酸鈉與鹽酸多巴胺形成paa-da，將得到的gc-pba與paa-da用pbs混合得到。

15、進(jìn)一步的，所述gc-pba為將羥乙基脫乙酰殼多糖(gc)和3-羧基苯硼酸(pba)溶解于pbs溶液，再加入edc和nhs，攪拌24h，透析、冷凍干燥得到。

16、進(jìn)一步的，所述paa-da為將聚丙烯酸鈉(paa)加入pbs溶液中，再加入edc和nhs，攪拌均勻，再加入鹽酸多巴胺(da)，繼續(xù)反應(yīng)24h，透析、冷凍干燥得到。

17、進(jìn)一步的，所述gc與pba的摩爾比為1:1，所述paa與da的摩爾比為1:1。

18、進(jìn)一步的，步驟4)中所述gc-pba+paa-da水凝膠中g(shù)c-pba與paa-da的質(zhì)量比為1:1，在混合前先將2％gc-pba與2％paa-da溶于pbs再進(jìn)行混合。

19、進(jìn)一步的，所述gox與負(fù)載microrna的復(fù)合物的質(zhì)量比為2:5。

20、進(jìn)一步的，一種葡萄糖響應(yīng)型的遺傳物質(zhì)遞送水凝膠的制備方法，包括以下步驟：

21、1)中空納米顆粒制備：向sio2水分散液中加入kmno4，超聲、離心、水洗后，將得到的沉淀用na2co3溶液進(jìn)行分散，得到中空mno2納米顆粒；

22、2)負(fù)載microrna的復(fù)合物的制備：將步驟1)得到的中空mno2納米顆粒加入到pei溶液中磁力攪拌1.5～3h使其分散均勻，離心水洗2次后得到hmno2@pei；用pbs溶解microrna，然后將溶液加入hmno2@pei中進(jìn)行攪拌，離心水洗后得到所述負(fù)載microrna的復(fù)合物(hmno2@pei@microrna)；

23、3)水凝膠的制備：將羥乙基脫乙酰殼多糖(gc)和3-羧基苯硼酸(pba)溶解于pbs溶液，再加入edc和nhs，攪拌24h，透析、冷凍干燥得到gc-pba；將聚丙烯酸鈉(paa)加入pbs溶液中，再加入edc和nhs，攪拌均勻，再加入鹽酸多巴胺(da)，繼續(xù)反應(yīng)24h，透析、冷凍干燥得到paa-da；將得到的質(zhì)量比1:1的gc-pba與paa-da用pbs混合制成gc-pba+paa-da水凝膠；

24、4)水凝膠與納米顆粒復(fù)合：將步驟2)得到的負(fù)載microrna的復(fù)合物、步驟3)得到的gc-pba+paa-da水凝膠、以及gox混合后，得到葡萄糖響應(yīng)型的遺傳物質(zhì)遞送水凝膠。

25、進(jìn)一步的，所述microrna為mir-146a。

26、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益技術(shù)效果在于：

27、本發(fā)明利用硼酸酯鍵對(duì)葡萄糖的敏感性，將gox、mno2、mir-146a負(fù)載在水凝膠中，結(jié)合了gox催化降解葡萄糖、mno2納米顆粒的抗氧化和氧氣生成能力，以及mir-146a的精準(zhǔn)遞送機(jī)制，用于糖尿病創(chuàng)面的局部治療。本發(fā)明通過在水凝膠中引入硼酸酯鍵，實(shí)現(xiàn)了高糖環(huán)境下水凝膠的形態(tài)調(diào)控，并達(dá)到高糖快速釋放gox的目的。

28、通過在水凝膠中負(fù)載gox，實(shí)現(xiàn)了在高糖環(huán)境下的局部血糖調(diào)控。gox催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖醛酸和過氧化氫，有效降低了創(chuàng)面局部的血糖水平，從而緩解了高糖對(duì)細(xì)胞功能的持續(xù)損害。與傳統(tǒng)的系統(tǒng)性胰島素治療相比，這一策略展現(xiàn)出更高的創(chuàng)面靶向性，避免了低血糖及胰島素抵抗等常見副作用。

29、本發(fā)明引入mno2納米顆粒，利用其出色的抗氧化特性，有效清除局部的ros，減輕氧化應(yīng)激，還能分解gox產(chǎn)生的過氧化氫，防止其在創(chuàng)面微環(huán)境中的積累，避免了gox催化過程伴隨產(chǎn)生的過氧化氫可能引發(fā)氧化應(yīng)激，對(duì)創(chuàng)面愈合產(chǎn)生負(fù)面影響。更重要的是，mno2還能夠產(chǎn)生氧氣，緩解糖尿病創(chuàng)面常見的局部缺氧問題，為創(chuàng)面組織的修復(fù)提供了充足的氧氣支持。這一策略不僅穩(wěn)定了創(chuàng)面微環(huán)境，還為細(xì)胞代謝和組織修復(fù)創(chuàng)造了有利條件。

30、本發(fā)明通過構(gòu)建中空mno2納米顆粒與pei的復(fù)合物，確保mir-146a僅在血糖水平較高的創(chuàng)面環(huán)境中釋放。mno2接枝的pei作為正電荷載體能夠有效吸附負(fù)電荷的mir-146a。當(dāng)創(chuàng)面局部環(huán)境中糖濃度升高時(shí)，由gox催化反應(yīng)生成的過氧化氫會(huì)促使mno2發(fā)生構(gòu)象變化，從而促進(jìn)mir-146a的釋放。這種響應(yīng)機(jī)制確保了在血糖較高的糖尿病創(chuàng)面中釋放更多的mir-146a，避免了在相對(duì)較低血糖水平的糖尿病創(chuàng)面釋放過多mir-146a，過度抑制必要的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致創(chuàng)面清創(chuàng)和修復(fù)延遲或mir-146a的過表達(dá)引發(fā)潛在的自體免疫或代謝異常。

31、上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，而可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，并且為了讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更明顯易懂，以下特舉本發(fā)明的具體實(shí)施方式。