本發明涉及一種整合素靶向肽-膠原酶藥物組合的應用及其構建的藥物組合物，尤其涉及一種具有協同治療纖維化療效的整合素靶向肽-膠原酶藥物組合的應用及其構建的藥物組合物。

背景技術：

1、肝纖維化、肺纖維化等纖維化病癥以及具有纖維化癥狀的胰腺癌、膀胱癌等腫瘤，其基質過度增生與成纖維細胞的持續活化密切相關。成纖維細胞活化為肌成纖維細胞后會分泌大量以膠原蛋白、纖連蛋白為主的細胞外基質(extracellular?matrix，ecm)成分，導致ecm過度沉積和交聯，推動纖維化進展。

2、造成成纖維細胞持續激活的信號通路主要分為兩類，分別為由細胞表面β1亞基整合素傳遞ecm剛性介導的機械信號通路，以及由tgf-β等因子介導的生化信號通路。目前，針對成纖維細胞活化抑制的抗纖維化策略主要集中于單阻斷生化信號通路或單阻斷機械信號通路，例如tgf-β1受體抑制劑、pi3k/akt信號通路抑制劑、smad信號通路抑制劑、mapk信號通路抑制劑、rho激酶(rock)抑制劑、細胞外基質(ecm)重塑抑制劑、整合素抑制劑等。

3、此外，cn118217246將rgd肽修飾在二級納米顆粒上，與膠原酶共同遞送，rgd肽主要作為靶頭特異性靶向損傷ii型肺泡上皮細胞，促進制劑被有效內化。us20210059936將rgd肽作為靶頭修飾在脂質體表面，用于遞送膠原酶，增加膠原酶的靶向性。以上均利用整合素靶向肽(如rgd環肽)修飾微粒制劑以向纖維化病灶靶向遞送膠原酶，實現更強的病灶蓄積或細胞攝取，其作用機制仍局限于膠原酶的局部降解作用。

技術實現思路

1、發明目的：本發明的第一目的是提供一種具有協同效應的整合素靶向肽-膠原酶藥物組合在制備雙通路高效治療纖維化的藥物中的應用，第二目的是提供一種所述藥物組合構建的藥物組合物。

2、技術方案：本發明所述的整合素靶向肽-膠原酶藥物組合在制備治療纖維化的藥物中的應用，其中所述整合素靶向肽與膠原酶的摩爾比為(500～1000):1。

3、本發明設計的藥物組合提供了一種雙通路協同抑制的抗纖維化策略。一方面利用膠原酶將i型和iii型膠原蛋白切割成短肽，削弱ecm剛性，同時還利用膠原酶切割i、iii型膠原蛋白上整合素(α1β1、α2β1、α10β1和α11β1)的識別序列，進一步減少整合素與膠原蛋白之間的機械傳感，阻斷膠原蛋白(i型、iii型)和整合素之間的機械轉導。

4、另一方面整合素靶向肽以單分子的形式釋放，通過rgd序列結合至整合素受體，通過與纖連蛋白競爭性結合整合素(α5β1、α8β1、αvβ1和αiibβ1)，阻斷纖連蛋白與整合素之間的機械轉導。此外，釋放的整合素靶向肽還能通過rgd序列結合成纖維細胞、腫瘤細胞等表面的αvβ6、αvβ8整合素，減少活性tgf-β的釋放，從而減少生化信號通路介導的成纖維細胞活化。

5、rgd序列是整合素識別和結合的核心基序，能夠與整合素的配體結合位點(如αvβ3、αvβ5、α5β1等)發生特異性相互作用，因此含有rgd序列的肽具有與整合素結合的潛力。整體上藥物組合中的膠原酶和整合素靶向肽通過阻斷介導纖維化的機械信號傳導與生化信號傳導，高效抑制成纖維細胞激活、減少ecm蛋白分泌，阻斷ecm剛性與成纖維細胞激活的之間的正反饋循環，重塑纖維化微環境。

6、優選，所述整合素靶向肽與膠原酶的摩爾比為(500～850):1。

7、優選，所述的整合素靶向肽含有rgd序列。

8、進一步優選，所述的整合素靶向肽選自grgdsp、c18-cgplgvrgd、grgds、rgds、rgdv、c(rgdfk)、c(rgdyk)、c(rgdfv)、c(rgdfe)、c(rgdfc)、c(rgdf[n-methyl]v)、c(rgdyc)、rgd-peg或irgd。

9、優選，所述的膠原酶為i型膠原酶。

10、優選，所述的藥物為治療肝纖維化、肺纖維化、胰腺纖維化或纖維化腫瘤的藥物。

11、進一步優選，所述的纖維化腫瘤選自具有纖維化癥狀的三陰性乳腺癌、胰腺癌或膀胱癌。

12、優選，所述藥物的給藥方式為局部給藥、靜脈注射、皮下注射或肌內注射。

13、優選，所述的藥物聯合放療、化療、免疫治療或生物治療的藥物治療纖維化。

14、本發明所述的治療纖維化的藥物組合物以重量份計，包含0.5～50份的整合素靶向肽、0.5～50份的膠原酶以及1～100份的藥學上可接受的載體。

15、優選，所述的整合素靶向肽為cgplgvrgd、c18-cgplgvrgd、grgds、rgds、rgdv、c(rgdfk)、c(rgdyk)、c(rgdfv)、c(rgdfe)、c(rgdfc)、c(rgdf[n-methyl]v)、c(rgdyc)、rgd-peg或irgd，膠原酶為i型膠原酶。

16、優選，所述整合素靶向肽與膠原酶的質量比為(5～10):1。

17、進一步優選，所述整合素靶向肽與膠原酶的質量比為(5～8.5):1。

18、更進一步優選，所述整合素靶向肽與膠原酶的質量比選自5:1、6:1、6.5:1、7.5:1或8.5:1。

19、優選，所述的藥物組合物以重量份計，包含5～8.5份的整合素靶向肽、1份的膠原酶以及1～50份的藥學上可接受的載體。

20、優選，所述的藥物組合物的劑型選自溶液劑、混懸劑、脂質體、微球、微囊、納米粒、凝膠。

21、優選，所述的藥學上可接受的載體選自溶劑、穩定劑、緩沖劑、助溶劑、抗氧化劑、防腐劑、滲透壓調節劑、脂質材料、高分子材料或填充劑。

22、具體地，所述的藥學上可接受的載體選自如下輔料中的一種或多種：蛋黃卵磷脂，大豆磷脂，氫化大豆卵磷脂或合成磷脂(dppd、dops、depe、dmpe、dspe、dppe、dope、dopg、epg、popg、dppg、dspg、dmpg、dppa、depc、dopc、dmpc、popc、dspc、dppc)，x-peg-y(其中x選自dspe、dppe、dmpe或dope；y選自0～10個氨基酸序列；peg的分子量為1000～5000)，膽固醇，天然高分子聚合物及其衍生物(直鏈淀粉、支鏈淀粉、氧化淀粉、羥乙基淀粉、交聯淀粉、微晶纖維素、醋酸纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙甲基纖維素碳酸酯、醋酸羥丙甲基纖維素琥珀酸酯、阿拉伯膠、甲殼素、葡聚糖、殼聚糖、透明質酸、海藻酸、肝素、白蛋白)，合成高分子聚合物及其衍生物(聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸羥乙酯、卡波姆、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯酞酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚己內酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯脂肪酸酯、泊洛沙姆、聚乙醇酸、聚乳酸、聚己內酯、乙醇酸-己內酯共聚物、聚山梨醇酯、聚乙烯吡啶酮、聚(乙烯亞胺)、d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯、氨基酸聚合物、聚(環氧乙烷)-聚(環氧丙烷)嵌段共聚物)，多酚類材料(槲皮素、山柰酚、楊梅素、花色苷、木犀草、兒茶酚、沒食子兒茶酚、沒食子兒茶酚沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、二沒食子酰基-d-葡萄糖、三沒食子酰基葡萄糖、四沒食子酰基葡萄糖、五沒食子酰基葡萄糖、沒食子酸、雙沒食子酸、單寧酸、鞣花單寧、鞣花酸、水解單寧、聚多巴胺)，乳化劑(聚乙烯醇、聚山梨酯20、聚山梨酯80、十二烷基硫酸鈉、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、聚乙二醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯)，交聯劑(戊二醛、京尼平、甲醛、環氧氯丙烷、碳二亞胺、n-羥基琥珀酰亞胺、二乙烯基砜、雙丙烯酰胺、二異氰酸酯、三聚氰胺甲醛樹脂、氯化鈣、三聚磷酸鈉、硫酸鈉、氯化鋇、檸檬酸鈉)，微晶纖維素鈉，羧甲基纖維素鈉，羥丙甲纖維素，硬脂酸鎂。

23、本發明所述的藥物組合物的制備方法，包括以下步驟：

24、(1)制備整合素靶向肽和膠原酶的溶液；

25、(2)制備預制體系

26、方法一：將步驟(1)制備的整合素靶向肽和膠原酶的溶液與緩沖液混合，調節ph至6.5～7.5；混合工序具體為微流控技術快速混合或簡單混合并經超聲、均質、勻漿、渦旋或攪拌操作。

27、方法二：將步驟(1)制備的整合素靶向肽和膠原酶的溶液與緩沖液混合，然后與穩定劑混合，調節ph至6.5～7.5；混合工序同方法一。

28、(3)制備藥物制劑

29、方法一：將步驟(2)制備的預制體系與溶劑混合，即得含整合素靶向肽和膠原酶的溶液劑；混合工序具體為微流控技術快速混合或簡單混合并經超聲、均質、勻漿、渦旋或攪拌操作。

30、方法二：將步驟(2)制備的預制體系與高分子材料混合，凍干并將顆粒微粉化，分散在油相溶液中，即得含整合素靶向肽和膠原酶的混懸劑；微粉化處理工序具體為超聲處理、高壓均質處理、球磨處理、氣流粉碎處理；混合工序同方法一。

31、方法三：將步驟(2)制備的預制體系與脂質或聚合物材料混合，采用乳化-溶劑揮發法、噴霧干燥法或相分離法制備，即得含整合素靶向肽和膠原酶的微球；乳化-溶劑揮發法具體為將步驟(2)制備的預制體系與高分子材料溶解于有機溶劑中，形成油相；將油相緩慢加入含有乳化劑的水相中，高速乳化形成乳狀液，攪拌揮發有機溶劑，離心收集微球；噴霧干燥法具體為將步驟(2)制備的預制體系與高分子材料混合，通過噴霧干燥設備在高溫氣流中霧化并干燥，形成微球；相分離法具體為將步驟(2)制備的預制體系與高分子材料溶解于有機溶劑中，加入非溶劑誘導相分離，形成微球；混合工序同方法一。

32、方法四：將步驟(2)制備的預制體系與脂質或聚合物材料混合，采用復乳法、界面聚合法或凝聚法制備，即得含整合素靶向肽和膠原酶的微囊；復乳法具體為將步驟(2)制備的預制體系作為內水相，與高分子材料形成的油相混合，形成初乳(w/o)；將初乳加入外水相(含乳化劑的水溶液)中，高速乳化形成復乳(w/o/w)，攪拌揮發有機溶劑，離心收集微囊；界面聚合法具體為將步驟(2)制備的預制體系與一種單體混合，作為水相；將另一種單體溶解于有機溶劑中，作為油相；將兩相混合，在界面發生聚合反應，形成微囊；凝聚法具體為將步驟(2)制備的預制體系與高分子材料混合，通過調節ph或加入凝聚劑誘導凝聚，形成微囊；混合工序同方法一。

33、方法五：將步驟(2)制備的預制體系與天然或合成高分子材料混合，采用超聲或高壓均質法制備，即得含整合素靶向肽和膠原酶的納米粒；混合工序同方法一。

34、方法六：將步驟(2)制備的預制體系與天然或合成高分子材料混合，通過離子交聯或加入交聯劑交聯，即得含整合素靶向肽和膠原酶的凝膠；混合工序同方法一。

35、方法七：將步驟(2)制備的預制體系與脂質或聚合物材料混合，采用薄膜分散法、逆向蒸發法或注入法制備，即得含整合素靶向肽和膠原酶的脂質體；薄膜分散法具體為將磷脂和膽固醇等脂質材料溶解于有機溶劑中，減壓蒸發形成薄膜，加入步驟(2)制備的預制體系水化，經超聲或高壓均質處理，得到脂質體；逆向蒸發法具體為將磷脂和膽固醇磷脂和膽固醇等脂質材料溶解于有機溶劑中，與步驟(2)制備的預制體系混合，形成乳狀液，除去有機溶劑，得到脂質體；注入法具體為將磷脂和膽固醇等脂質材料的有機溶液緩慢注入步驟(2)制備的預制體系中，攪拌并除去有機溶劑，得到脂質體；混合工序同方法一；采用透析、超濾或蒸發除去有機溶劑。

36、更具體地，所述超聲頻率為100～1000w，超聲時間是1～30min；所述離心轉速為1000～10000rpm，離心時間是1～30min；所述均質是通過高壓均質機或微射流均質機實施的，均質壓力為300～1500pa，均質次數為1～30次；所述勻漿是通過勻漿機實現的，轉速為1000～10000rpm，勻漿時間為5～120s；所述渦旋或攪拌是通過渦旋儀、攪拌器實現的，渦旋或攪拌轉速一般為500～3000rpm，時間是1～30min；所述球磨處理是通過球磨機實現的，轉速為50～400rpm，研磨時間為1～2h；所述氣流粉碎處理是通過氣流粉碎機實現的，氣流壓力為0.5～1.2mpa；所述噴霧干燥機的霧化壓力為0.1～0.5mpa。

37、所述的藥學上可接受的溶劑為水、緩沖液、甘油、丙二醇、乙醚、二甲亞砜、n,n-二甲基甲酰胺、甲酰胺、乙醇、丙酮、甲醇、四氫呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、異丙醇中的一種或多種。

38、有益效果：與現有技術相比，本發明具有如下顯著優點：

39、本發明設計的藥物組合具有機械信號傳導與生化信號傳導雙通路協同抑制作用，能夠阻斷纖維化細胞的激活和增殖，抑制纖維化的啟動和維持，促進基質降解；同時通過降解纖維化組織中的膠原基質，減少纖維化組織的體積和硬度，恢復組織彈性。高效減輕纖維化還可以促進后續治療藥物的滲透，具有級聯促滲作用。所構建的藥物組合物能夠協同遞送整合素靶向肽與膠原酶，釋放后以游離分子的形式在纖維化病灶中發揮協同作用，為纖維化治療藥物的高效遞送提供了一種新的策略。