專利名稱：基因重組vpac2受體特異激動劑dbayl及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及一種基因重組VPAC2型受體特異激動劑 DBAYL及其制備方法，與其用于制備治療VPAC2型受體相關疾病的藥物，如促進葡萄糖依賴的胰島素分泌，提高機體對高濃度血糖的應急能力，有效降低血糖濃度，保護胰腺β細胞功能、增加β細胞數量和抑制β細胞凋亡及調節免疫系統功能等作用。
背景技術：
垂體腺苷酸環化酶激活肽(PACAP)是1990年被發現由腦垂體分泌的具有重要生物學功能的神經多肽，是促胰液素/高血糖素/VIP家族中的新成員。PACAP有兩種存在形式PACAP38，由38個氨基酸組成；PACAP27，由PACAP38氮端的27個氨基酸組成。PACAP通過激活其特異的G蛋白偶聯受體，提高靶細胞cAMP等第二信使的濃度，從而發揮廣泛而重要的生物學功能。PACAP有三類G蛋白偶聯受體PAC1、VPAC1和VPAC2 ；三類受體在生物體中分布不同，所起的作用也不相同。其中VPAC2型受體分布于胰島等組織，與能量代謝密切相關，從臨床觀點看，作為VPAC2型受體特異激動劑的特定PACAP衍生物可有效地降低血液葡萄糖水平，保護β-細胞功能及阻止疾病發展的潛力，且無低血糖癥風險，可用于糖尿病的任何病期，作為具有廣泛作用的神經多肽，對于二期和三期糖尿病患者具有優于其他藥物的綜合治療作用，為公認的治療II型糖尿病的新型藥物。PACAP與VPAC2受體作用主要與腺苷酸環化酶(AC)藕聯通過cAMP信號傳導通路，激活AC，催化ATP轉化為cAMP，cAMP隨之激活其依賴性蛋白激酶A (PKA)，PKA可使細胞內多種蛋白質磷酸化，產生生理效應，尤其是在促進相關基因轉錄有重要作用。PACAP通過 VPAC2受體介導的生物學功能主要有神經遞質/調質、促進激素分泌，調節內分泌平衡；調節性腺功能和生殖細胞的產生；調節能量代謝平衡等。研究表明，VPAC2型受體特異激動劑可有效促進葡萄糖依賴的胰島素分泌，提高機體對高濃度血糖的應急能力有效降低血糖濃度，保護胰腺β細胞功能、增加β細胞數量和抑制β細胞凋亡。但PACAP及其許多衍生物，如ΒΑΥ55-9837等，在體內很快被二肽基肽酶IV (DPPIV)降解；而且由于自身結構中含有影響其液體環境中穩定性的氨基酸組成， 許多藥物肽在生物體內穩定性較差。因此，研發生理環境下新型高穩定性VPAC2受體特異激動劑是PACAP及其衍生多肽用于II型糖尿病治療及臨床應用急待解決的問題，研發作為 VPAC2型受體特異激動劑的高穩定性PACAP衍生多肽，具有重要的藥用價值。

發明內容
本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種具有更高穩定性和更高生物活性的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL。本發明的另一目的在于提供所述基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法。該制備方法根據PACAP衍生多肽DBAYL的氨基酸序列及大腸桿菌密碼子的偏好性，設計DBAYL在原核表達系統的基因序列，采用基因工程技術，結合蛋白內含肽(intein)的可誘導剪切功能實現目的多肽DBAYL的高效制備；該制備方法生產效率高，生產成本低。本發明的再一目的在于提供所述基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種基因重組VPAC2型受體特異激動劑 DBAYL，其氨基酸序列如下所示MHSDAVFTDQYTRLRKQLAAKKYLQSLKQKRY ；編碼所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的苷酸序列為 ATGCATAGCGATGCGGTGTTTACCGATCAGTATACCCGTCTGCGTAAACAGCTGGCGGCGAAAAAATAT CTGCAGAGCATTAAACAGAAACGTTAT ；所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法，包括以下步驟(1)設計并合成DBAYL基因采用3條引物兩步法合成DBAYL基因引物Fl:5，-GGTGGT CATATG' CATAGCGATGCGGTGTTTACCGATCAGTATACCCGTCTGCGTAAA-3，；引物F2:5’ -CAGATATTTTTTCGCCGCCAGCTGTTTACGCAGACGGGT-3，；引物F3:5 ’ -CCACCA TGCTCTTCCGCA ATAACGTTTCTGTTTAATGCTCTGCAGATATTTTTT-3 ’ ；其中，GGTGGT或 CCACCA 為保護堿基,CATATG為 NdeI 酶切位點，TGCTCTTCCGCA 為SapI酶切位點；首先將引物Fl和引物F2進行鏈延伸反應，然后以其產物為DNA模板，以Fl和F3 為引物，PCR反應制得DBAYL基因；(2)構建重組載體 pKY-DBAYL 用Ndel酶和Sapl酶分別對質粒pKYB和步驟(1)制得的DBAYL基因進行雙酶切， 再將雙酶切后的DBAYL基因和雙酶切后的質粒pKYB連接，得到重組載體pKY-DBAYL ；(3)制備表達工程菌 pKY-DBAYL/ER2566 用重組載體pKY-DBAYL轉化表達宿主菌大腸桿菌E coli Strain ER2566，得到表達工程菌 pKY-DBAYL/ER2566 ；(4)表達和純化①誘導表達工程菌pKY-DBAYL/ER2566表達由目的多肽、蛋白內含肽和幾丁質結合域(Chitin binding domain，CBD)組成的“三元”融合蛋白；②得到的“三元”融合蛋白用幾丁質柱進行純化，“三元”融合蛋白吸附于幾丁質柱中，然后含有硫醇的溶液過柱并充滿幾丁質柱環境中，反應；硫醇的作用是誘導蛋白內含肽的N端切割，釋放目的多肽C端硫酯；接著洗脫幾丁質柱，得到目的多肽C端硫酯，透析目的多肽C端硫酯，從而產生穩定的水解產物；③利用高效液相色譜技術純化目的多肽，得到基因重組VPAC2型受體特異激動劑 DBAYL0步驟(1)中所述的鏈延伸反應的條件優選為94°C IOmin;降至58°C 5min;72 0C IOmin ；步驟(1)中所述的PCR反應的條件優選為95°C 5min ；95°C lmin、55°C lmin、 72°C lmin, 32 個循環；72°C延伸 IOmin ；步驟(4)②中所述含有硫醇的溶液的組成如下20mM Tris_HCI，0. 5M NaCl,lmM EDTA，50mM3 -巰基乙醇，pH 8.0;步驟⑷②中所述反應的條件優選為25V反應M小時；步驟(4)②中所述洗脫幾丁質柱的溶液的組成優選如下20mM Tris-HCl, 500mM NaCI，ImM EDTA,pH 8. 0 ；步驟(4)③中所述利用高效液相色譜技術純化目的多肽DBAYL的步驟如下A、流動相A為在體積百分比5%乙腈(CNCH3,溶質為純水)中添加三氟乙酸(TFA) 得到，TFA的終濃度為體積百分比0. 1% ；流動相B為100%乙腈(CNCH3)中添加三氟乙酸 (TFA)，TFA的終濃度為體積百分比0. 1% ；流速lmL/min，25min線性梯度洗脫；B、線性梯度洗脫中流動相B由0 60% (ν/ν)，收集目的多肽洗脫峰，光吸收檢測波長為218nm ；并進行質譜鑒定。所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL應用于制備治療如下疾病的藥物糖尿病及其并發癥，高血糖癥，高血壓，血栓癥，肥胖癥、心血管疾病、神經系統疾病、心臟及腎衰竭。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果(1)本發明所制備的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL，是PACAP衍生多肽，與野生型PACAP相比，在其N端多了一個甲硫氨酸，并具有特殊的氨基酸序列，即在C端通過巰酯鍵結合硫醇，成為多肽硫酯，多肽硫酯可以水解產生天然的羧基端，也可特異水解成為硫代羧酸。(2)該VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的氨基酸序列不同于其他與PACAP同源或非同源的VPAC2型受體特異激動劑，與BAY55-9837的區別點在于突變原BAY55-9837的第九位氨基酸天冬酰胺(N)為谷氨酰胺⑴)，突變原BAY55-9837的第十七位氨基酸纈氨酸 (V)為亮氨酸(L)，突變原BATO5-9837的第二十八位氨基酸天冬酰胺(N)為谷氨酰胺⑴)。這些區別使得DBAYL在生理環境中具有更高的穩定性和對VPAC2受體更高的特異激活活性，與VPAC2受體特異結合后，促進胰島素的產生和分泌，保護胰腺β細胞功能、增加β細胞數量和抑制β細胞凋亡，并激活胰島素受體信號通路，從而發揮治療II型糖尿病的功效。(3)本發明所制備的高穩定性VPAC2型受體特異激動劑DBAYL在治療糖尿病及其并發癥，高血糖癥，高血壓，血栓癥，肥胖癥、心血管疾病、神經系統疾病、心臟及腎衰竭疾病中有顯著的療效。(4)利用本發明所述的制備方法得到的重組多肽DBAYL的穩定性比化學合成 DBAYL多肽提高約7倍，比化學合成ΒΑΥ55-9837多肽的穩定性提高約25倍。本發明的表達方法效率高、成本低，應用前景廣闊。


圖1為重組多肽DBAYL的制備示意圖。
圖2為DBAYL基因合成及重組表達質粒pKY_DBAYL構建示意圖；圖中MCS_多克隆位點；CBD-幾丁質結合結構域；intein-內含肽。圖3為SDS-PAGE檢測融合蛋白htein-CBD-DBAYL表達的鑒定圖；其中，泳道1是 IPTG誘導前菌體破碎上清液；泳道2是IPTG誘導后菌體破碎上清液。圖4為制備的重組多肽DBAYL的飛行質譜鑒定圖。圖5為重組多肽DBAYL與BAY55-9837的穩定性比較與檢測結果圖。圖6為重組多肽DBAYL/BAY55-9837和[125I]PACAP38對VPAC2受體的競爭性結合檢測結果圖。圖7為重組多肽DBAl與BAY55-9837促進CH0-VPAC2細胞cAMP生成的活性測定
結果圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例1重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備過程如圖1所示，具體步驟如下(1) DBAYL編碼序列的獲得按照大腸桿菌的密碼偏好性設計編碼DBAYL的cDNA，設計3條引物，采用兩步法獲得該序列(如圖2所示)引物Fl:5， -GGT GGT CAT ATG CAT AGC GAT GCG GTG TTT ACC GAT CAG TAT ACC CGT CTGCGT AAA-3，；引物F2:5' -CAG ATA TTT TTT CGC CGC CAG CTG TTT ACG CAG ACG GGT-3'；引物F3:5’ -CCA CCA TGC TCT TCC GCA ATA ACG TTT CTG TTT AAT GCT CTG CAG ATA TTT TTT-3'；其中，GGT GGT或CCA CCA為保護堿基，CATATG為Nde I酶切位點，TGC TCT TCC GCA為SapI酶切位點；①鏈延伸反應反應體系為引物FK250yM/L)2y L，弓丨物 F2 Q50 μ M/L) 2 μ L， 10 X iTaKaRaBuffer (含有 4mmol/L MgCl2) 2 μ L, dNTP 2 μ L, H2O 11. 5 μ L，TaKaRa Taq 酶 0. 5μ L ；反應條件為94°C，IOmin；降至 58°C 5min ；72°C IOmin ；得到延伸反應液。②PCR 反應反應體系為以延伸反應液為DNA模板，引物Fl (25 μ M/L) 2 μ L，F3 (25 μ M/ L) 2 μ L，延伸反應液 1· 5 μ L，dNTP 2 μ L，10XTaKaRa Ex Buffer 2 μ L, TaKaRa Taq 酶0. 5μ L, H2O 10μ L ；反應條件為94"C 5min ；94 "C 30s, 55 "C 30s, 72 "C 30s, 32 個循環；72 °C 延伸 IOmin ；得到長度為12!3bp的PCR產物(2)構建重組載體pKY-DBAYL，如圖2所示用NdeI和SapI進行酶切步驟(1)得到的PCR產物，利用PCR產物純化試劑盒進行純化(根據說明書進行操作)。純化后的PCR產物先進行LguI (SapI的同功酶，Fermatas 產品)單酶切，酶切條件為在IXTango buffer反應體系中，1 μ g PCR產物加入15unit LguI (3 μ L), 37°C酶切4h ；LguI單酶切完成后，加入適量體積的10 X Tango buffer,使得反應體系成為 2 X Tango buffer 體系，加入 20unit NdeI (2 μ L, !^ermatas 產品)，37°C酶切4h ；質粒pKYB(New England Biolabs(NEB)公司)的雙酶切=LguI (SapI 的同功酶)和 NdeI的雙酶切條件同上。將雙酶切后的DBAYL基因和雙酶切后的質粒pKYB連接，連接體系和連接時間、大腸桿菌DH5ci (購自大連寶生物公司)感受態細胞的制作、轉化以及篩選(卡那霉素)，根據 《分子克隆》進行操作。將DBAYL基因克隆到質粒pKYB的NdeI和SapI位點間，得到重組載體 pKY-DBAYL。(3)表達和純化①將重組質粒pKY-DBAYL 轉化表達宿主菌 E. coli Strain ER2566 (New England Biolabs (NEB)公司)，得到表達工程菌pKY_DBAYL/ER2566 ；挑取單克隆于5mL含50 μ g/mL 卡那霉素的Luria-Bertani (broth)培養基(簡稱LB培養基)，搖菌培養過夜，再擴大，以體積比為1 100的比例接于IL含50mg/L卡那霉素的LB培養基，37°C搖菌至OD600為0. 6，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))至終濃度0. 6mmol/L，37°C誘導表達6h。IOOOOrpm 離心 20min 收集菌體，將菌體重懸于60mL Buffer A溶液(20mM Tris-HCl, 500mM NaCI, ImM EDTA, pH 8.0)中，然后用低溫超高壓連續流細胞破碎儀進行破碎，破碎條件為=BufferA溶液稀釋菌體的濃度為18% (m/v)，破碎壓力為1700bar，制冷溫度為3°C。破碎產物在4°C，IOOOOrpm離心30min，收集上清，該上清稱為破碎上清。SDS-PAGE 檢測融合蛋白Intein-CBD-DBAYL的表達，鑒定結果如圖3所示。取25mL幾丁質珠(NEB公司產品#S6651L)裝填4. 5X 20cm層析柱，以10倍柱體積的BufferA溶液洗柱；破碎上清以0. 5mL/min的流速上注；用10倍柱體積的Buffer A溶液以2mL/min過柱，以洗去雜蛋白或未親和結合的融合蛋白，用80mL Buffer B溶液(20mM Tris-HCI,0. 5M NaCl，ImM EDTA，50mM β -巰基乙醇，pH 8.0)自然過柱，使β-巰基乙醇均勻分布并浸泡柱內填料，然后封閉進、出口端，上述反應體系在25°C反應Mh，以誘導蛋白內含肽的N端切割，釋放目的多肽C端硫酯。用Buffer A溶液洗脫并用潔凈的燒杯收集目的多肽溶液C端硫酯，4°C透析過夜除去β -巰基乙醇并使目的多肽C端硫酯水解，再經高效液相色譜(HPLC)純化、制備得到純度為質量百分比96%以上的重組多肽DBAYL，目的多肽的制備條件為流動相A[在體積百分比5%乙腈(CNCH3，溶質為純水)中添加三氟乙酸 (TFA)得到，TFA的終濃度為體積百分比0. ]，流動相Β[100%乙腈(CNCH3)中添加三氟乙酸(TFA)，TFA的終濃度為體積百分比0. ]，流速lmL/min，25min線性梯度洗脫，線性
8梯度洗脫中流動相B由0 60 % (ν/ν)，收集目的多肽洗脫峰，光吸收檢測波長為218nm。 目的多肽DBAYL的純度通過分析性HPLC測定(條件同目的多肽的制備條件)。制備的高穩定性VPAC2型受體特異激動劑DBAYL利用質譜技術鑒定(如圖4所示)，質譜檢測分子量為 3. 916kDa.，與其理論值相符合。實施例2重組肽DBAYL (即實施例1制備的DBAYL)的體外穩定性測定重組肽DBAYL、化學合成DBAYL(與重組肽DBAYL相比，其N端無甲硫氨酸)和 BAY55-9837 (Tocris Bioscience 公司產品 #2711)以終濃度 lmg/ml 分別溶解在 2OmM 磷酸鈉緩沖液(PH 8.0，含150mM氯化鈉)，37°C水浴鍋中孵育，在不同的時間點取樣，利用液相色譜-質譜聯用技術(LC-MQ檢測多肽在水溶液環境中隨時間的存留量，以確定重組肽DBAYL在體外水溶液環境中的穩定性，結果如圖5所示孵育1周時，BAY55-9837消減35. 2%，孵育2周時，BAY55-9837消減75. 1%，孵育3周和4周時，BAY55-9837分別消減88. 9%和96. 7% ；化學合成DBAYL多肽在孵育2周時，消減25. 8%，孵育4周時，消減 51.6% ；而重組肽DBAYL在孵育2周時，僅消減2.5%，孵育4周時，僅消減7.7%。實驗結果統計學處理表明，重組肽DBAYL的體外半衰期約為BAY55-9837的25倍，約為化學合成 DBAYL多肽的7倍。實施例3重組肽DBAYL對VPAC2受體的競爭性結合活性測定VPAC2-CH0細胞Qnvitrogen公司)接種至12孔板上培養，實驗前2h，用0. 5mL無血清Ham’ s F-12培養基洗滌細胞兩次。然后，細胞用含2% (mg/ml)牛血清白蛋白(BSA) 和IOmM葡萄糖的Ham，s F-12培養液4°C培養過夜，培養液中加入0. InM[125I]PACAP38和待測多肽(即為BAY55-9837或重組肽DBAYL)，并逐步提高待測多肽濃度(10_"Μ 。 培養完畢后，棄掉上清液，用冰冷PBS (0. 01Μ, ρΗ值為7. 4)洗細胞3次，細胞在室溫下用 0. 5mL 0. 5M NaOH和0. 1 % (mg/ml) SDS混合lOmin，然后用、計數法測定細胞裂解物放射量，計算重組肽 DBAYL 或 BAY55-9837 的半抑制量(IC50，half-maximal inhibitory concentration)，每組實驗重復3次。實驗結果如圖6，BATO5-9837對VPAC2受體的半抑制量IC50為68. 3士8. InM ；重組肽DBAYL對VPAC2受體的半抑制量IC50為48. 4士6. 9nM ；結果表明，重組肽DBAYL對VPAC2 受體的競爭性結合活性高于VPAC2受體特異激動劑BAY55-9837。實施例4 重組肽DBAYL促進VPAC2-CH0細胞cAMP生成的活性測定取對數生長期的VPAC2-CH0細胞，PBS (0. 01M, ρΗ值為7. 4)洗2次，調整細胞懸液濃度為ι χ lOVmL,分別加入相同濃度的多肽DBAYL或BAY55-9837 (Tocris Bioscience 公司產品#2711)，調節多肽的濃度至KT11M 10_%，371溫育201^11。再將分別被多肽 DBAYL和BAY55-9837作用過的各100 μ L細胞懸浮液與200 μ L 0. 2Μ HCl溶液混合，室溫放置20min，tip頭吹打溶解細胞并混勻，1500g離心lOmin，吸取上清按Cyclic AMP Enzyme Immunoassay Kit 說明測定 cAMP 的量。實驗結果如圖7，BAY55-9837對VPAC2受體的半激活濃度EC50 (half-maximal stimulatory concentration)為 1. 10士0. 23nM ；多肽 DBAYL 對 VPAC2 受體的半激活濃度EC50為0. 68士0. 2InM ；結果表明，多肽DBAYL對VPAC2受體的選擇性激活活性明顯高于 BAY55-9837o實施例5重組多肽DBAYL對ICR小鼠血糖及胰島素水平的影響正常雄性ICR小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號 SCXK[京]2002-000 按體重均分為3組，正常對照組、BAY55-9837組(50 μ g/kg)、重組肽 DBAYL組(50 μ g/kg)。動物禁食過夜(1池)，取空腹血(Omin)后，腹腔注射給藥，正常對照組注射生理鹽水，分別于給藥后15min灌胃給予葡萄糖溶液(2g/kg)，并在給糖后20min時取血，用OneTouch Ultra Meter血糖儀(Johnson公司)測定血糖值，利用RIA kit (Linco Research公司)測定胰島素水平。實驗結果如表1所示重組肽DBAYL可有效促進胰島素的分泌和明顯降低葡萄糖依賴的血糖水平，效果明顯優于BAY55-9837。表IICR小鼠血糖及胰島素水平檢測
權利要求
1.一種基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.根據權利要求1所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL，其特征在于編碼所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.權利要求1或2所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)設計并合成DBAYL基因采用3條引物兩步法合成DBAYL基因引物Fl 5’ -GGTGGT CATATG CATAGCGATGCGGTGTTTACCGATCAGTATACCCGTCTGCGTAAA-3 ’ ；引物F2 5' -CAGATATTTTTTCGCCGCCAGCTGTTTACGCAGACGGGT-3’ ；引物F3 5，-CCACCA TGCTCTTCCGCA ATAACGTTTCTGTTTAATGCTCTGCAGATATTTTTT-3'；其中，GGTGGT或CCACCA為保護堿基，CATATG為NdeI酶切位點，TGCTCTTCCGCA為 SapI酶切位點；首先將引物Fl和引物F2進行鏈延伸反應，然后以其產物為DNA模板，以Fl和F3為引物，PCR反應制得DBAYL基因；(2)構建重組載體pKY-DBAYL用Ndel酶和Sapl酶分別對質粒pKYB和步驟(1)制得的DBAYL基因進行雙酶切，再將雙酶切后的DBAYL基因和雙酶切后的質粒pKYB連接，得到重組載體pKY-DBAYL ；(3)制備表達工程菌pKY-DBAYL/ER2566用重組載體pKY-DBAYL轉化表達宿主菌大腸桿菌E coli Strain ER2566，得到表達工程菌 pKY-DBAYL/ER2566 ；(4)表達和純化①誘導表達工程菌PKY-DBAYL/ER2566表達由目的多肽、蛋白內含肽和幾丁質結合域組成的“三元”融合蛋白；②得到的“三元”融合蛋白用幾丁質柱進行純化，“三元”融合蛋白吸附于幾丁質柱中， 然后含有硫醇的溶液過柱并充滿幾丁質柱環境中，反應；硫醇的作用是誘導蛋白內含肽的 N端切割，釋放目的多肽C端硫酯；接著洗脫幾丁質柱，得到目的多肽C端硫酯，透析目的多肽C端硫酯，從而產生穩定的水解產物；③利用高效液相色譜技術純化目的多肽，得到基因重組VPAC2型受體特異激動劑 DBAYL。
4.根據權利要求3所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的鏈延伸反應的條件為94°C IOmin ；降至58°C 5min ；72°C IOmin0
5.根據權利要求3所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的PCR反應的條件為95°C 5min ；95°C lmin、55°C lmin、72°C lmin， 32個循環；72°C延伸IOmin。
6.根據權利要求3所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法，其特征在于步驟(4)②中所述含有硫醇的溶液的組成如下20mMTris-HCI，0. 5M NaCl, ImM EDTA，50mM3 -巰基乙醇，pH 8.0;步驟(4)②中所述反應的條件為25V反應M小時；步驟⑷②中所述洗脫幾丁質柱的溶液的組成如下20mM Tris-HCl,500mMNaCI,lmM EDTA, pH 8· 0。
7.根據權利要求3所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法，其特征在于步驟(4)③中所述利用高效液相色譜技術純化目的多肽DBAYL的步驟如下Α、流動相A為在體積百分比5%乙腈中添加三氟乙酸得到，三氟乙酸的終濃度為體積百分比0. 1% ；流動相B為100%乙腈中添加三氟乙酸得到，三氟乙酸的終濃度為體積百分比0. ；流速lmL/min,25min線性梯度洗脫；B、線性梯度洗脫中流動相B由體積百分比0 60%，收集目的多肽洗脫峰，光吸收檢測波長為218nm ；并進行質譜鑒定。
8.權利要求1或2所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的應用，其特征在于所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL用于制備治療如下疾病的藥物糖尿病及其并發癥，高血糖癥，高血壓，血栓癥，肥胖癥、心血管疾病、神經系統疾病、心臟及腎衰竭。
全文摘要
本發明公開了一種如SEQ ID NO.1所示基因重組VPAC2受體特異激動劑DBAYL及其制備方法與應用。通過關鍵氨基酸突變得到的DBAYL，與現有VPAC2型受體特異激動劑相比，在血液中具有更高的穩定性和生理活性，顯著提高了其對VPAC2型受體的特異激活活性。該激動劑DBAYL對VPAC2受體的特異性半激活濃度EC50為0.68±0.21nM(BAY55-9837的EC50為1.10±0.23nM)，表明其對VPAC2型受體的選擇性激活活性明顯高于BAY55-9837，且實驗證明該重組激動劑DBAYL的體外半衰期約為BAY55-9837的25倍，約為化學合成DBAYL多肽的7倍，表明其穩定性顯著高于BAY55-9837。該重組激動劑DBAYL可應用于制備具有如下功能的藥物治療糖尿病及其并發癥，治療高血糖癥，治療高血壓，治療血栓癥，治療肥胖癥、心血管疾病等。
文檔編號C07K14/47GK102558335SQ201210005129
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者洪岸, 馬義 申請人:暨南大學