專利名稱：一種酶法制備7-氨基頭孢烷酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化合物的合成方法，具體的說是涉及頭孢烷酸的制備方法。
背景技術(shù)：
7-氨基頭孢烷酸，化學(xué)名為7_氨基-3-[(乙酰氧基)甲基]-8-氧代-5-硫雜 _1_ 氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸,英文名為7-Aminocephalosporanic acid,簡稱7-ACA,是一種白色結(jié)晶性粉末,不溶于水及一般有機溶媒。7-ACA是一種醫(yī)藥中間體，為許多半合成頭孢菌素的起始原料，如頭孢曲松鈉。其合成路線有三種途徑化學(xué)裂解法、發(fā)酵法和酶法，其中酶法有一步酶法和兩步酶法。一步酶法直接作用于頭孢菌素C (CPC)的側(cè)鏈生成7-ACA，該法工藝簡單、成本低，但目前此類酶活性較低且種類較少，不適宜工業(yè)化生產(chǎn)。兩步酶法利用D-氨基酸氧化酶(DAAO)和頭孢菌素C氨基酰化酶(GL-7-ACA酰化 酶)兩步酶酶促反應(yīng)將CPC轉(zhuǎn)化為7-ACA，其優(yōu)點在于成本低、工藝簡化，是目前最有希望的方法，也是最有價值的發(fā)展方向。兩步酶法制備7-ACA的方法有兩種直接結(jié)晶法和助劑結(jié)晶法。直接結(jié)晶法是將7-ACA結(jié)晶液經(jīng)活性炭吸附分離后，直接用鹽酸調(diào)節(jié)pH結(jié)晶，再經(jīng)過濾、洗滌、干燥得7-ACA。此法得到的7-ACA結(jié)晶顆粒細(xì)小，并且過濾、洗滌、干燥困難，設(shè)備龐大，操作煩雜，能耗高，后序生成雜質(zhì)多。助劑結(jié)晶法是將7-ACA結(jié)晶液經(jīng)活性炭吸附分離后加入結(jié)晶助劑后用鹽酸調(diào)節(jié)PH結(jié)晶，再經(jīng)過濾、洗滌、干燥得7-ACA。該工藝解決了過濾問題，但未除去的雜質(zhì)在結(jié)晶過程中包裹在7-ACA中。基于以上方法制得的7-ACA結(jié)晶顆粒純度偏低、雜質(zhì)偏聞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種新的兩步酶法制備7-ACA方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的7-ACA結(jié)晶顆粒細(xì)小、純度偏低、雜質(zhì)偏高的問題。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明所提供的酶法制備7-ACA的方法，包括以下步驟a、將頭孢菌素C溶液加入D-氨基酸氧化酶進(jìn)行氧化反應(yīng)，得氧化液；將氧化液加入酰化酶進(jìn)行酰化反應(yīng)，得7-氨基頭孢烷酸結(jié)晶液；該步驟與現(xiàn)有的二步酶法制備7-ACA方法中的氧化、酰化工藝相同，其中氧化酶、酰化酶的選擇以及用量均可參照現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行。如氧化酶可選用為D-氨基酸氧化酶(DAAO )，酰化酶可選用頭孢菌素C氨基酰化酶(GL-7-ACA酰化酶)。b、7_氨基頭孢烷酸結(jié)晶液純化①所得7-ACA結(jié)晶液降溫至5-10°C，加入吸附劑，攪拌30_40分鐘后，過濾，得濾液I ;其中吸附劑的用量可按照常規(guī)用量選擇，其優(yōu)選用量以質(zhì)量體積計為O. 05-2% ②將濾液I用超濾膜或微濾膜進(jìn)行膜分離，得濾液II，所得濾液II即為純化的7-氨基頭孢烷酸結(jié)晶液；其中所述的超濾膜優(yōu)選孔徑為1-5納米的超濾膜。C、所述純化的7-ACA結(jié)晶液加入結(jié)晶助劑，以鹽酸調(diào)節(jié)PH，結(jié)晶，再經(jīng)過濾、洗滌、干燥得7-氨基頭孢烷酸結(jié)晶。本發(fā)明方法更優(yōu)選的方案是所述②步得濾液II后，再加入萃取劑，攪拌10-30分鐘，然后靜止分相10_20min，棄去萃取劑，得純化的7-氨基頭孢烷酸結(jié)晶液。或所述b步所述的7-氨基頭孢烷酸結(jié)晶液純化是
①將所得7-氨基頭孢烷酸結(jié)晶液用超濾膜或微濾膜進(jìn)行膜分離，得濾液；②所得濾液中，加入萃取劑，攪拌10-30分鐘，然后靜止分相10_20min，棄去萃取齊U，得純化的7-氨基頭孢烷酸結(jié)晶液。所述的吸附劑為活性炭、LX-1180大孔吸附樹脂或氧化鋁中的一種，其更為優(yōu)選的
是活性炭。所述的萃取劑為二氯甲烷、三氯甲烷或乙酸乙酯中的一種，其更為優(yōu)選的是乙酸乙酯。所述的結(jié)晶助劑是丁酯、聚四胺或聚丙烯酸中的任意一種。本發(fā)明對7-ACA結(jié)晶液進(jìn)行純化，可有效降低7-ACA結(jié)晶中的雜質(zhì)含量，所得到的7-ACA結(jié)晶所含雜蛋白含量在O. 2%以下，最低達(dá)O. 02%，所含內(nèi)毒素含量在O. 5EU/mg以內(nèi)，最低可達(dá)O. 01EU/mg，所得到的7-ACA結(jié)晶純度可高達(dá)99%，晶型好，粒徑可達(dá)50 μ m。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明。本發(fā)明中使用的氧化酶為D-氨基酸氧化酶(DAAO)，使用的酰化酶為頭孢菌素C氨基酰化酶(GL-7-ACA酰化酶)。實施例1 :將5000L的濃度為3%頭孢菌素C溶液加入到裝有20MU氧化酶的反應(yīng)罐中，以30mVh的流速通入氧氣，并控制罐內(nèi)氣壓在O.1Mpa，控制罐內(nèi)溫度在18 20°C，用3mol/L氨水控制pH=7. 2 ；pH波動變小時，取樣做HPLC分析，當(dāng)溶液中殘留頭孢菌素C的色譜含量小于3%時，結(jié)束氧化，得到含戊二酰基-7-ACA的氧化液。將氧化液過濾，所得濾液加入到裝有25MU酰化酶的反應(yīng)罐中，控制罐內(nèi)溫度在18 20°C，用3mol/L氨水控制pH=8. 3 ；pH波動變小時，取樣做HPLC分析，當(dāng)溶液中殘留戊二酰基-7-ACA的色譜含量小于3%時，結(jié)束酰化，過濾，得到7-ACA結(jié)晶液。將7-ACA結(jié)晶液降溫到5-10°C，加入10公斤活性炭吸附劑攪拌30分鐘，過濾后經(jīng)過超濾膜(孔徑為I納米)超濾后，加入1000L乙酸乙酯萃取劑攪拌30分鐘，靜止分相10-20min,分去乙酸乙酯后,加入1%。聚丙烯酸結(jié)晶助劑，用6mol/L鹽酸調(diào)節(jié)終點pH4.1,養(yǎng)晶I小時，再經(jīng)過濾、洗滌、干燥得7-ACA結(jié)晶，所得7-ACA結(jié)晶純度為99. 0%，蛋白含量為O. 02%，內(nèi)毒素含量為O. 01EU/mg。實施例2 將5000L的濃度為3%頭孢菌素C溶液加入到裝有20MU氧化酶的反應(yīng)罐中，以30m3/h的流速通入氧氣，并控制罐內(nèi)氣壓在O.1Mpa，控制罐內(nèi)溫度在18 20°C，用3mol/L氨水控制pH=7. 2 ；pH波動變小時，取樣做HPLC分析，當(dāng)溶液中殘留頭孢菌素C的色譜含量小于3%時，結(jié)束氧化，得到含戊二酰基-7-ACA的氧化液。將氧化液過濾，所得濾液加入到裝有25MU酰化酶的反應(yīng)罐中，控制罐內(nèi)溫度在18 20°C，用3mol/L氨水控制pH=8. 3 ；pH波動變小時，取樣做HPLC分析，當(dāng)溶液中殘留戊二酰基-7-ACA的色譜含量小于3%時，結(jié)束酰化，過濾，得到7-ACA結(jié)晶液。將7-ACA結(jié)晶液降溫到5_10°C，加入10公斤L(fēng)X-1180大孔吸附樹脂吸附劑攪拌40分鐘，過濾后經(jīng)過超濾膜(孔徑為5納米)超濾后，加入1000L 二氯甲烷萃取劑攪拌15分鐘，靜止分相10_20min，分去二氯甲烷后，加入1%。聚四胺結(jié)晶助劑，用6mol/L鹽酸調(diào)節(jié)終點pH4. 1，養(yǎng)晶I小時，再經(jīng)過濾、洗滌、干燥得7-ACA結(jié)晶，所得7-ACA結(jié)晶純度為98. 9%，蛋白含量為O. 03%,內(nèi)毒素含量為O. 04EU/mg。實施例3 將5000L的濃度為3%頭孢菌素C溶液加入到裝有20MU氧化酶的反應(yīng)罐中，以30mVh的流速通入氧氣，并控制罐內(nèi)氣壓在O.1Mpa，控制罐內(nèi)溫度在18 20°C，用3mol/L氨水控制pH=7. 2 ；pH波動變小時，取樣做HPLC分析，當(dāng)溶液中殘留頭孢菌素C的色譜含量小于3%時，結(jié)束氧化，得到含戊二酰基-7-ACA的氧化液。將氧化液過濾，所得濾液加入到裝有25MU酰化酶的反應(yīng)罐中，控制罐內(nèi)溫度在18 20°C，用3mol/L氨水控制pH=8. 3 ；pH波動變小時，取樣做HPLC分析，當(dāng)溶液中殘留戊二酰基-7-ACA的色譜含量小于3%時，結(jié)束酰化，過濾，得到7-ACA結(jié)晶液。將7-ACA結(jié)晶液降溫到5-10°C，加入10公斤氧化鋁吸附劑攪拌25分鐘，過濾后經(jīng)過微濾膜(孔徑為100納米)進(jìn)行膜分離后，加入1000L 二氯甲烷萃取劑攪拌10分鐘，靜止分相10-20min，分去二氯甲烷后，加入1%。丁酯結(jié)晶助劑，用6mol/L鹽酸調(diào)節(jié)終點pH4. 1，養(yǎng)晶I小時，再經(jīng)過濾、洗滌、干燥得7-ACA結(jié)晶，所得7-ACA結(jié)晶純度為98. 5%，蛋白含量為O. 03%，內(nèi)毒素含量為O. 05EU/mg。 實施例4 將5000L的濃度為3%頭孢菌素C溶液加入到裝有20MU氧化酶的反應(yīng)罐中，以30mVh的流速通入氧氣，并控制罐內(nèi)氣壓在O.1Mpa，控制罐內(nèi)溫度在18 20°C，用3mol/L氨水控制pH=7. 2 ；pH波動變小時，取樣做HPLC分析，當(dāng)溶液中殘留頭孢菌素C的色譜含量小于3%時，結(jié)束氧化，得到含戊二酰基-7-ACA的氧化液。將氧化液過濾，所得濾液加入到裝有25MU酰化酶的反應(yīng)罐中，控制罐內(nèi)溫度在18 20°C，用3mol/L氨水控制pH=8. 3 ；pH波動變小時，取樣做HPLC分析，當(dāng)溶液中殘留戊二酰基-7-ACA的色譜含量小于3%時，結(jié)束酰化，得到7-ACA結(jié)晶液。將7-ACA結(jié)晶液降溫到5-10°C，加入7. 5公斤活性炭吸附劑攪拌30分鐘，過濾后加入1000L三氯甲烷萃取劑攪拌30分鐘，靜止分相10-20min，分去三氯甲烷后，加入1%0聚丙烯酸結(jié)晶助劑，用6mol/L鹽酸調(diào)節(jié)終點pH4.1養(yǎng)晶I小時，再經(jīng)過濾、洗滌、干燥得7-ACA結(jié)晶，所得7-ACA結(jié)晶純度為98. 2%，蛋白含量為O. 2%，內(nèi)毒素含量為O. 5EU/mg。實施例5 將5000L的濃度為3%頭孢菌素C溶液加入到裝有20MU氧化酶的反應(yīng)罐中，以30mVh的流速通入氧氣，并控制罐內(nèi)氣壓在O.1Mpa，控制罐內(nèi)溫度在18 20°C，用3mol/L氨水控制pH=7. 2 ；pH波動變小時，取樣做HPLC分析，當(dāng)溶液中殘留頭孢菌素C的色譜含量小于3%時，結(jié)束氧化，得到含戊二酰基-7-ACA的氧化液。將氧化液過濾，所得濾液加入到裝有25MU酰化酶的反應(yīng)罐中，控制罐內(nèi)溫度在18 20°C，用3mol/L氨水控制pH=8. 3 ；pH波動變小時，取樣做HPLC分析，當(dāng)溶液中殘留戊二酰基-7-ACA的色譜含量小于3%時，結(jié)束酰化，得到7-ACA結(jié)晶液。將7-ACA結(jié)晶液降溫到5-10°C，加入10公斤L(fēng)X-1180大孔吸附樹脂攪拌30分鐘，過濾，所得濾液經(jīng)超濾膜(孔徑為I納米)超濾，加入1%。聚丙烯酸結(jié)晶助劑，用6mol/L鹽酸調(diào)節(jié)終點PH4.1養(yǎng)晶I小時，再經(jīng)過濾、洗滌、干燥得7-ACA結(jié)晶，所得7-ACA結(jié)晶純度為98. 5%，蛋白含量為O. 1%，內(nèi)毒素含量為O. 25EU/mg。
實施例6:將5000L的濃度為3%頭孢菌素C溶液加入到裝有20MU氧化酶的反應(yīng)罐中，以30mVh的流速通入氧氣，并控制罐內(nèi)氣壓在O.1Mpa，控制罐內(nèi)溫度在18 20°C，用3mol/L氨水控制pH=7. 2 ；pH波動變小時，取樣做HPLC分析，當(dāng)溶液中殘留頭孢菌素C的色譜含量小于3%時，結(jié)束氧化，得到含戊二酰基-7-ACA的氧化液。將氧化液過濾，所得濾液加入到裝有25MU酰化酶的反應(yīng)罐中，控制罐內(nèi)溫度在18 20°C，用3mol/L氨水控制pH=8. 3 ；pH波動變小時，取樣做HPLC分析，當(dāng)溶液中殘留戊二酰基-7-ACA的色譜含量小于3%時，結(jié)束酰化，得到7-ACA結(jié)晶液。將7-ACA結(jié)晶液降溫到5-10°C，經(jīng)過超濾膜(孔徑為I納米)超濾后加入1000L乙酸乙酯萃取劑攪拌30分鐘，靜止分相10-20min，分去乙酸乙酯后，加入1%。聚丙烯酸結(jié)晶助劑，劑用6mol/L鹽酸調(diào)節(jié)終點pH4.1養(yǎng)晶I小時，再經(jīng)過濾、洗滌、干燥得7-ACA結(jié)晶，所得7-ACA結(jié)晶純度為98. 8%，蛋白含量為O. 05%,內(nèi)毒素含量為O. lEU/mg。
權(quán)利要求
1.一種酶法制備7-氨基頭孢烷酸的方法，其特征在于它包含以下步驟 a、將頭孢菌素C溶液加入D-氨基酸氧化酶進(jìn)行氧化反應(yīng),得氧化液；將氧化液加入酰化酶進(jìn)行酰化反應(yīng)，得7-氨基頭孢烷酸結(jié)晶液； b、7-氨基頭孢烷酸結(jié)晶液純化 ①所得7-氨基頭孢烷酸結(jié)晶液降溫至5-10°C，加入吸附劑，攪拌30-40分鐘后，過濾，得濾液I ; ②將濾液I用超濾膜或微濾膜進(jìn)行膜分離，得濾液II，所得濾液II即為純化的7-氨基頭抱燒酸結(jié)晶液； C、所述純化的7-氨基頭孢烷酸結(jié)晶液加入結(jié)晶助劑，以鹽酸調(diào)節(jié)PH，結(jié)晶，再經(jīng)過濾、洗滌、干燥得7-氨基頭孢烷酸結(jié)晶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法制備7-氨基頭孢烷酸的方法，其特征在于，所述②步得濾 液II后，再加入萃取劑，攪拌10-30分鐘，然后靜止分相10-20min，棄去萃取劑，得純化的7-氨基頭孢烷酸結(jié)晶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法制備7-氨基頭孢烷酸的方法，其特征在于，所述b步所述的7-氨基頭孢烷酸結(jié)晶液純化是 ①將所得7-氨基頭孢烷酸結(jié)晶液用超濾膜或微濾膜進(jìn)行膜分離，得濾液； ②所得濾液中，加入萃取劑，攪拌10-30分鐘，然后靜止分相10-20min，棄去萃取劑，得純化的7-氨基頭孢烷酸結(jié)晶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶法制備7-氨基頭孢烷酸的方法，其特征在于，所述的吸附劑為活性炭、LX-1180大孔吸附樹脂或氧化鋁中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的酶法制備7-氨基頭孢烷酸的方法，其特征在于，所述的超濾膜的孔徑為1-5納米。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的酶法制備7-氨基頭孢烷酸的方法，其特征在于，所述的萃取劑為二氯甲烷、三氯甲烷或乙酸乙酯中的任意一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的酶法制備7-氨基頭孢烷酸的方法，其特征在于，所述的結(jié)晶助劑是丁酯、聚四胺或聚丙烯酸中的任意一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酶法制備7-ACA的高純度結(jié)晶方法，其制備過程如下頭孢菌素C溶液經(jīng)氧化酶氧化和酰化酶酰化得到7-ACA結(jié)晶液，所得7-ACA結(jié)晶液依次經(jīng)吸附劑進(jìn)行吸附分離、經(jīng)超濾膜或微濾膜進(jìn)行膜分離、經(jīng)萃取劑進(jìn)行萃取分離后，得到純化的7-ACA結(jié)晶液，所得純化的結(jié)晶液中加入結(jié)晶助劑，以鹽酸調(diào)節(jié)PH結(jié)晶，再經(jīng)過濾、洗滌、干燥后得高純7-ACA結(jié)晶顆粒。本發(fā)明可有效降低7-ACA結(jié)晶中的雜質(zhì)含量，所得到的7-ACA結(jié)晶所含雜蛋白含量在0.2%以下，最低達(dá)0.02%，所含內(nèi)毒素含量在0.5EU/mg以內(nèi)，最低可達(dá)0.01EU/mg。
文檔編號C07D501/12GK103014114SQ20121058019
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者段志鋼, 程俊山, 閆峰, 郭文仿, 張偉, 谷中芝, 張苗靜, 楊洪先, 尹科科, 劉海蓮, 楊立婷, 趙華 申請人:華北制藥河北華民藥業(yè)有限責(zé)任公司