一種大黃魚魚肉抗氧化肽及其制備方法和用途
【專利摘要】本發明涉及一種大黃魚魚肉抗氧化肽及用途，其特征在于：該抗氧化肽為五肽化合物，氨基酸序列為Tyr-Leu-Met-Ser-Arg，ESI-MS檢測給出分子量651.77Da（[M+H]+652.45Da）。該抗氧化肽制備方法包括勻漿、酶解、超濾和層析等步驟。制備得到的高活性抗氧化肽Tyr-Leu-Met-Ser-Arg對DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時，Tyr-Leu-Met-Ser-Arg亦顯示出良好的脂質過氧化抑制作用。Tyr-Leu-Met-Ser-Arg具有顯著地抗氧化活性，可用作藥品、保健食品或食品添加劑。
【專利說明】一種大黃魚魚肉抗氧化肽及其制備方法和用途

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種生物活性肽及其制備方法和用途，尤其涉及一種大黃魚魚肉抗氧化肽及其制備方法和用途。

【背景技術】
[0002]HjtXPseudosciBeim crocea),又名黃魚、大黃花魚，為我國傳統“四大海產”(大黃魚、小黃魚、帶魚、烏賊)之一，是我國近海名貴經濟魚類。但因過度捕撈，野生資源破壞嚴重。近年來，隨著人工養殖技術的逐漸成熟，網箱、圍網與土池等多種養殖模式均在大黃魚養殖中得以應用，大黃魚的產量逐年增加，大黃魚的精深加工技術受到日益重視。
[0003]但是， 申請人:發現，以大黃魚魚肉為原料，利用酶解技術制備大黃魚魚肉抗氧化肽的工藝研究處于空白階段，而以酶解產物為材料制備高活性魚肉抗氧化肽及其應用更是未見報道。


【發明內容】

[0004]本發明所要解決的第一個技術問題是針對上述的技術現狀提供一種大黃魚魚肉抗氧化肽，該抗氧化肽活性強，安全無毒副作用，易于消化吸收，可有效清除自由基和抑制脂質過氧化作用。
[0005]本發明所要解決的第二個技術問題是提供一種大黃魚魚肉抗氧化肽的制備方法。
[0006]本發明所要解決的第三個技術問題是提供一種大黃魚魚肉抗氧化肽的應用。
[0007]本發明為解決上述第一個技術問題所采取的技術方案為:一種大黃魚魚肉抗氧化肽，其特征在于該抗氧化肽的氨基酸序列為Tyr-Leu-Met-Ser_Arg(SEQ N0.1D:1),ESI_MS檢測給出分子量為 651.77 Da ([M+H]+ 652.45 Da)。
[0008]本發明為解決上述第二個技術問題所采取的技術方案為:一種大黃魚魚肉抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
1)將大黃魚魚肉絞碎，按照料液比1g:8?12 mL加入蒸餾水，調pH值至6.5?7.5，于45?55°C保溫 10?15 min;
2)按照大黃魚魚肉質量的0.8?1.2%加入木瓜蛋白酶，于45飛5°C溫度下酶解3?5 h ；將上述酶解液調pH值至9.(Γ10.0，按照大黃魚魚肉質量的1.5^2.0%加入堿性蛋白酶，于45?55 °C溫度下酶解3?5 h ；
3)將酶解液加熱到90?95°C滅活10?15min, 5000^6000 r/min離心15?25 min，取上清液；上清液依次經超濾和層析，得到抗氧化肽。
[0009]作為改進，所述步驟3)的超濾和層析的具體過程為:
超濾:將上清液調至pH 6.5?7.5，用截留分子量3 kDa的超濾膜進行超濾處理，根據羥基自由基清除活性，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解物；
層析:將上述超濾酶解物用雙蒸水配成2(T30 mg/mL的溶液，經過陰離子交換樹脂分離，用雙蒸水、0.45?0.55 mol/L和0.90?1.10 mol/L NaCl溶液進行洗脫，根據280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為離子交換層析酶解物；將上述離子交換層析酶解物用雙蒸水配成1(T20 mg/mL的溶液，經過凝膠柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解物，將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成45飛5 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行純化，根據羥基自由基清除活性得1個高活性抗氧化肽Tyr-Leu-Met-Ser-Argo
[0010]優選，所述陰離子交換樹脂為DEAE-52纖維素，所述凝膠為葡聚糖凝膠G_15。
[0011]再優選，所述RP-HPLC條件為:進樣量15?20 μ L ;色譜柱為Zorbax SB C-18column (4.6 X 250 mm);柱溫為30 °C Γ流動相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；梯度洗脫:(Tl00 min乙腈濃度從0勻速升至100% ;洗脫速度1.0 mL/min ;紫外檢測波長280 nm。
[0012]本發明為解決上述第三個技術問題所采取的技術方案為:一種大黃魚魚肉抗氧化肽的應用，其特征在于Tyr-Leu-Met-Ser-Arg對DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時，Tyr-Leu-Met-Ser-Arg亦顯示出良好的脂質過氧化抑制作用；Tyr-Leu-Met-Ser-Arg具有顯著的抗氧化活性,可以作為藥品、保健食品和食品添加劑進行應用。
[0013]與現有技術相比，本發明的優點在于:本發明選用木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶作為酶解用酶，通過生物酶解法同時融合超濾分級和色譜精制，制得的多肽具有較強的抗氧化活性；與化學合成的抗氧化劑相比較，本發明制得的抗氧化肽具有抗氧化活性強、易于消化吸收和安全無毒副作用等優點，可用作藥品、保健食品或食品添加劑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是本發明的大黃魚魚肉超濾酶解物的陰離子交換樹脂(DEAE-52纖維素)層析圖；
圖2是本發明的大黃魚魚肉酶解物陰離子交換層析分離組分(Fr.A、Fr.C和Fr.D)的羥基自由基清除率圖；
圖3是本發明的陰離子交換層析分離組分(Fr.C)的葡聚糖凝膠G-15層析圖；
圖4是本發明的凝膠層析所分離各組分的羥基自由基清除率圖；
圖5是本發明的葡聚糖凝膠G-15制備酶解物(Fr.C_l)的RP-HPLC圖；
圖6是本發明的Tyr-Leu-Met-Ser-Arg的質譜(ES1-MS)圖和結構式；
圖7是本發明的Tyr-Leu-Met-Ser-Arg的脂質過氧化抑制作用圖。

【具體實施方式】
[0015]以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0016]實施例1:一種大黃魚魚肉抗氧化肽的制備方法，制備工藝流程如下:大黃魚魚肉〃酶解〃酶解物〃超濾〃離子交換層析〃凝膠過濾層析〃高效液相色譜制備〃抗氧化肽。
[0017]1)將大黃魚魚肉絞碎，按照料液比1 g:12 mL加入蒸餾水，調pH值至7.0，于50°C保溫10 min。
[0018]2)按照大黃魚魚肉質量的1.0%加入木瓜蛋白酶，于50°C酶解4 h ;將上述酶解液調pH值至9.5，按照大黃魚魚肉質量的2.0%加入堿性蛋白酶，于50°C酶解4 h。經過試驗重復驗證，其酶解產物成分穩定，具有很高的重復性。
[0019]3)將酶解液加熱到90°C滅活10 min,6000 r/min離心15 min,取上清液；上清液依次經超濾和層析，得到抗氧化肽。
[0020]①超濾:將上清液調至pH 7.0，采用截留分子量3 kDa的超濾膜進行超濾處理，根據羥基自由基清除活性，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解物；
②DEAE-52纖維素陰離子交換層析:將上述超濾酶解物用雙蒸水配成25mg/mL的溶液，經過陰離子交換樹脂分離，用雙蒸水、0.50 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液進行洗脫，根據280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為離子交換層析酶解物(Fr.C)(圖1和圖2)；
③凝膠層析:將上述離子交換層析酶解物(Fr.C)用雙蒸水配成15 mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠G15柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解物(Fr.C-1)(圖3和圖4);
④高效液相色譜精制:將上述凝膠制備酶解物(Fr.C-1)用雙蒸水配成50 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行純化(條件:進樣量20 μ L ;色譜柱為Zorbax SBC-18 (250 mm X 4.6 mm，5 μ m);柱溫為30°C ;流動相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；梯度洗脫:0-100 min乙腈濃度從0勻速升至100% ;洗脫速度1.0 mL/min ;紫外檢測波長280 nm，根據羥基自由基清除活性得1個高活性抗氧化肽(圖5)；
⑤結構檢測:收集羥基自由基清除活性最高的1個抗氧化肽，利用蛋白/多肽序列分析儀測定氨基酸序列為Tyr-Leu-Met-Ser-Arg，ES1-MS檢測給出分子量為651.77 Da ([M+H] +652.45 Da)(見圖 6)。
[0021]將上述制得的大黃魚魚肉抗氧化肽Tyr-Leu-Met-Ser-Arg進行DPPH自由基清除實驗、輕基自由基清除實驗、ABTS自由基清除實驗、超氧陰尚子自由基清除實驗和脂質過氧化抑制實驗。實驗結果表明:Tyr-Leu-Met-Ser_Arg對DPPH自由基(EC5Q 1.35 mg/mL)、輕基自由基(EC5Q 1.92 mg/mL) > ABTS自由基(EC5。0.31 mg/mL)和超氧陰離子自由基(EC5Q0.45 mg/mL)具有良好的清除作用；同時，Tyr-Leu-Met-Ser-Arg亦顯示出良好的脂質過氧化抑制作用(圖7)。
[0022]最后，尚需注意的是，以上列舉的僅是本發明的一個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種大黃魚肉肉抗氧化肽，其特征在于該抗氧化肽的氨基酸序列為Tyr-Leu-Met-Ser-Arg, ES1-MS 檢測分子量為 651.77 Da。
2.一種大黃魚魚肉抗氧化肽制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將大黃魚魚肉絞碎，按照料液比Ig:8?12 mL加入蒸餾水，調pH值至6.5?7.5，于45?55°C保溫 10?15 min ； 2)按照大黃魚魚肉質量的0.8?1.2%加入木瓜蛋白酶，于45飛5°C酶解3?5 h ;將上述酶解液調pH值至9.(Γ10.0，按照大黃魚魚肉質量的1.5?2.0%加入堿性蛋白酶，于45飛5°C酶解3?5 h ； 3)將酶解液加熱到90?95°C滅活10?15min, 5000^6000 r/min離心15?25 min，取上清液；上清液依次經超濾和層析，得到抗氧化肽。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)的超濾和層析的具體過程為: 超濾:將上清液調至PH 6.5?7.5，采用分子量3 kDa的超濾膜進行超濾處理，根據羥基自由基清除活性，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解物； 層析:將上述超濾酶解物用雙蒸水配成2(T30 mg/mL的溶液，經過陰離子交換樹脂分離，用雙蒸水、0.45?0.55 mol/L和0.90?1.10 mol/L NaCl溶液進行洗脫，根據280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為離子交換層析酶解物；將上述離子交換層析酶解物用雙蒸水配成1(T20 mg/mL的溶液，經過凝膠柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解物，將上述凝膠層析酶解物用羥基配成45飛5 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行純化，根據抗氧化活性得I個高活性抗氧化肽Tyr-Leu-Met-Ser-Arg0
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述陰離子交換樹脂為DEAE-52纖維素，所述凝膠為葡聚糖凝膠G-15 ;所述RP-HPLC條件為:進樣量15?20 μ L ;色譜柱為Zorbax SB C-18 column ;柱溫為30°C ;流動相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；梯度洗脫:(Tl00 min乙腈濃度從O勻速升至100% ;洗脫速度1.0 mL/min ;紫外檢測波長280 nm。
5.一種大黃魚魚肉抗氧化肽的用途,其特征在于:Tyr-Leu-Met-Ser-Arg用于藥品、保健食品或食品添加劑對DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基的清除；或者，Tyr-Leu-Met-Ser-Arg用于藥品、保健食品或食品添加劑起到脂質過氧化抑制作用的用途。
【文檔編號】C07K1/34GK104250285SQ201410368760
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年7月30日 優先權日:2014年7月30日
【發明者】王斌, 馬路凱, 遲長鳳, 李濤 申請人:浙江海洋學院