專利名稱：一種具有取向生長結構細胞的材料的制備方法
技術領域：
本發明屬于生物材料領域，特別是涉及ー種具有取向生長結構細胞的材料的制備方法。
背景技術：
細胞與材料的相互作用是生物材料及組織工程研究的重要領域之一。大多數哺乳動物的細胞必須與材料粘附后才能進行増殖、遷移和分化。材料表面性質無論是表面拓撲微結構的差異還是化學信號的不同，都對細胞行為有很大的影響(包括從最初的粘附到增埴，甚至分化和最后形成新的組織)，這種現象被稱為接觸誘導(Contact Guidance)ο大多數正常組織內的細胞不是雜亂無序的，而是具有一定的有序取向結構，例如肌腱細胞、骨細胞、心肌細胞及構成血管的內皮細胞、平滑肌細胞等在一定程度上均為有序結構。這也使得有效調控細胞取向生長在生物材料、仿生學及組織工程等領域具有重要的意義。眾所周知，對細胞生長進行結構調控是生物材料由單純的材料學走向組織工程仿生的關鍵一歩。通常獲得取向生長的細胞往往是在ー個圖案化的基底上，利用化學或者物理的模板作用來限制細胞生長(Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 5406; J. AppI. Biomater.Biom. 2008, 6，132)。已報道的傳統方法主要是在基底上通過光刻或者電子束刻蝕等技術，首先得到具有一定微結構的模型，通過復型或者在圖案化的材料上進行化學修飾差異化不同區域，進而對細胞的生長進行接觸誘導。這些方法主要是利用微電子加工等方法得到可精確控制的周期性結構，主要在平面的基底上進行操作，但這些圖案化基底的制備過程較為復雜，成本較高，難以得到大面積的制備，從而限制了其應用范圍。因此，大批量、低成本地制備能誘導細胞取向生長的基底，是獲得長程有序細胞生長的關鍵。同吋，在曲面上獲得長程有序生長的細胞更是ー個難題。摩擦法起始于1911年Mauguin觀察到的現象，即用紙按一定方向擦拭玻璃基板，液晶分子長軸按上述方向排列的現象，該技術廣泛應用于液晶顯示領域(液晶器件手冊[M]·北京海洋出版社，1992，254; Mol. Cryst. Liq. Cryst. 1983，94，33)。之后在1991年，Jean C Wittmann等在報道摩擦PFTE誘導小分子在其上取向結晶，該技術在薄膜和界面材料等方面又有了進一步的發展(Naturel991, 352, 414;MacromoIecules2010, 43，7604; Adv. Funct. Mater. 2011, 21，4047.)但是這一技術在微結構調控顯得日益重要的生物材料方面還未得到拓展。

發明內容
本發明的目的是提供ー種具有取向生長結構細胞的材料的制備方法；通過在摩擦取向的聚合物的基底上涂覆生物相容性高分子薄膜，經熱處理復合形成聚合物/生物相容性高分子ニ元復合膜，之后在該復合膜上進行細胞培養，得到具有取向生長結構細胞的材料；該制備方法能大批量、低成本地制備具有取向生長結構細胞的材料。ー種具有取向生長結構細胞的材料的制備方法，包括以下步驟
I)制備具有摩擦取向的聚合物的基底；2)在具有摩擦取向的聚合物的基底上附著生物相容性高分子薄膜，得到具有聚合物/生物相容性高分子ニ元復合膜的基底；3)在具有聚合物/生物相容性高分子ニ元復合膜的基底上進行細胞培養。進ー步地，所述步驟I)是首先，將聚合物和基底加熱到室溫至聚合物熔融溫度之間；其次，固定基底，對聚合物施加垂直于基底的5(Γ500Ν的向下的壓力，并沿水平方向對聚合物施加5 300Ν的推力，使聚合物在基底上水平延展，得到具有摩擦取向的聚合物的基底；其中，所述基底的動摩擦系數為O. 06、. 7。 進ー步地，所述聚合物為聚こ烯、聚丙烯、聚丁烯、聚苯こ烯、聚甲基丙烯酸甲酷、聚偏氟こ烯、聚四氟こ烯、聚酰亞胺、聚對苯ニ甲酸ニこ酷、聚こ烯萘酸酷、聚醚砜或聚碳酸酷。進ー步地，所述基底為玻璃片、石英片或單晶硅片。使用前應保持潔凈。進ー步地，所述步驟2)是將步驟I)制得的具有摩擦取向的聚合物的基底浸入生物相容性高分子溶液中，緩慢提拉基底，待生物相容性高分子溶液的溶劑完全揮發后，在生物相容高分子玻璃化轉變溫度與熔融溫度之間對基底進行熱處理，得到具有聚合物/生物相容性高分子ニ元復合膜的基底。進ー步地，所述步驟2)是利用旋涂法將生物相容性高分子溶液旋涂到步驟I)制得的具有摩擦取向的聚合物的基底上，旋涂速度為50(Γ5000轉/分，待生物相容性高分子溶液的溶劑完全揮發后，在生物相容高分子玻璃化轉變溫度與熔融溫度之間對基底進行熱處理，得到具有聚合物/生物相容性高分子ニ元復合膜的基底。具體的熱處理溫度和時間視生物相容高分子而定。進ー步地，所述生物相容性高分子溶液是將生物相容性高分子與溶劑混合，配制成每100毫升溶劑中含有O. I飛克生物相容性高分子的溶液。通常在室溫下進行配制。生物相容性高分子溶液的濃度太稀將無法得到連續的薄膜，而溶液濃度過大則會因溶液粘度太大無法成膜。進ー步地，所述生物相容性高分子為聚己內酷、聚乳酸、聚氨酷、聚こ醇酸、聚己丙酰胺、聚乳酸-羥基こ酸共聚物、膠原、絲蛋白、纖維素、殼聚糖等合成高分子材料或天然高分子材料中的ー種或兩種以上混合物。進ー步地，所述溶劑為蒸餾水、こ醇、甲苯、ニ甲苯、ニ氯甲烷、三氯甲烷、四氫呋喃、丙酮、丁酮、環己酮中的ー種或兩種以上混合物。制得的復合膜的厚度通常為5(Tl000nm，優選為200nm，但應了解，它的長、寬、尺
寸可根據需要任意調節。所述步驟3)可采用公知的貼壁細胞的培養方法在具有聚合物/生物相容性高分子ニ元復合膜的基底上進行細胞培養。所述細胞主要包括成纖維細胞、肌細胞、骨細胞、干細胞等貼壁類細胞。在熱處理過程中受摩擦取向聚合物分子誘導，生物相容性高分子膜表面本身具有特殊的預取向結構，可誘導粘附在其上的多種細胞進行取向生長，從而獲得大面積具有取向結構的細胞。本發明具有以下有益效果
本方法操作簡單易行，成本低，可重復、大面積地在平面或曲面基底上制備具有穩定的預取向結構的生物相容高分子薄膜，并通過細胞培養可以獲得取向生長的細胞；可以通過控制基底上摩擦區域的面積和范圍，在同一基底上獲得取向和雜亂的不同細胞分布區域，即同時含有兩種(取向和雜亂)圖案化的細胞分布，取向的細胞在具有預取向結構的區域生長，雜亂的細胞在沒有取向結構的區域分布，圖案分辨效果高、對比明顯，可以精確調控；本方法適用于目前已有報道的眾多細胞的取向誘導生長；本方法為生物材料、仿生學、組織工程等研究領域的進ー步拓展提供了有利的支
持。


圖Ia為實施例I制備樣品I #的操作示意圖；圖Ib為實施例IPTFE摩擦后樣品的掃描電子顯微鏡圖像；圖Ic為實施例IPCL復合后樣品的掃描電子顯微鏡圖像；圖Id為實施例1PCL/PTFE復合膜樣品的原子力顯微鏡2D圖像；圖Ie為實施例I制備樣品的相圖；圖If為實施例I制備樣品的高度圖；圖2為用樣品I #培養小鼠成纖維細胞3天后的熒光顯微鏡圖像(a取向和雜亂，b雜亂，c取向)；圖3a, b, c為用樣品I #培養大鼠骨髓間充質干細胞3天后的掃描電子顯微鏡圖像；圖3d，e, f為用樣品I #培養大鼠骨髓間充質干細胞3天后的熒光顯微鏡圖像。圖4a, b為實施例4用樣品2 #培養中國倉鼠卵巢成纖維細胞7天后的突光顯微鏡圖像。
具體實施例方式以下結合附圖和具體實施方式
對本發明作進ー步說明，但本發明的保護范圍不僅限于下述實施例。實施例Iー種具有取向生長結構細胞的材料的制備方法，包括以下步驟I)將清潔的玻璃基底(平面或曲面)和聚四氟こ烯棒放在加熱到280°C的熱臺上，保持10分鐘，玻璃基底的動摩擦系數為O. 06、. 7 ；2)固定玻璃基底，對聚四氟こ烯棒施加垂直于基底向下的5(Γ500Ν的壓力，并沿水平方向施加5 300Ν的推力，使得聚四氟こ烯棒摩擦玻璃，然后常溫下冷卻后，沿摩擦方向將玻璃基底在PCL溶液(lw/v%)中緩慢提拉，溶劑自然揮發干后，于55°C的熱臺上繼續加熱2小吋，既可以得到復合于PTFE基質上取向的PCL薄膜(平面樣品編號1#，曲面樣品編號2#)。圖Ia為實施例I制備樣品I #的操作示意圖；圖Ib為實施例IPTFE摩擦后樣品的掃描電子顯微鏡圖像；圖Ic為實施例IPCL復合后樣品的掃描電子顯微鏡圖像；圖Id為實施例1PCL/PTFE復合膜樣品的原子力顯微鏡2D圖像；圖Ie為實施例I制備樣品的相圖；圖If為實施例I制備樣品的高度圖；由圖可見，采用本發明的制備方法得到的ニ元復合薄膜具有良好的取向性。圖中，A為聚合物棒，B為基底，C為熱臺，D為生物相容性高分子溶液。3)將制備的聚合物/生物相容性高分子ニ元復合膜基底，即樣品1#，用紫外燈照射Ih (距紫外燈50cm)滅菌；4)將滅菌后的基底浸泡在37 °C的PBS中24h，然后用新鮮培養液(10%FBS+H-DMEM+1%雙抗)置換PBS，并培養小鼠成纖維細胞(L929) 3天，每天更換培養液。在附生結晶的PCL薄膜上可以得到沿摩擦方向取向生長的L929細胞。圖2為用樣品I #培養小鼠成纖維細胞3天后的熒光顯微鏡圖像(a取向和雜亂，b雜亂，c取向);由圖可見，采用本發明的制備方法得到的培養L929細胞在該基底上高度取向井具有良好的粘附和増殖性能，細胞活力保持較好。 實施例2ー種具有取向生長結構細胞的材料的制備方法，步驟同實施例1，變化在于，在樣品1#上培養生長大鼠骨髓間充質細胞(BMMSCs)。圖3a, b, c為用樣品I #培養大鼠骨髓間充質干細胞3天后的掃描電子顯微鏡圖像；圖3d，e, f為用樣品I #培養大鼠骨髄間充質干細胞3天后的熒光顯微鏡圖像；由圖可見，采用本發明的制備方法得到的材料上培養的BMMSCs細胞取向良好，細胞的粘附和增殖性能保持較好。實施例3ー種具有取向生長結構細胞的材料的制備方法，步驟同實施例1，變化在于，在樣品2#上培養生長中國倉鼠卵巢成纖維細胞(CHO) 7天。圖4a，b為用樣品2 #培養中國倉鼠卵巢成纖維細胞7天后的熒光顯微鏡圖像。實施例4ー種具有取向生長結構細胞的材料的制備方法，包括以下步驟I)制備具有摩擦取向的聚合物的基底；2)在具有摩擦取向的聚合物的基底上附著生物相容性高分子薄膜，得到具有聚合物/生物相容性高分子ニ元復合膜的基底；3)在具有聚合物/生物相容性高分子ニ元復合膜的基底上進行細胞培養。實施例5ー種具有取向生長結構細胞的材料的制備方法，包括以下步驟I)制備具有摩擦取向的聚合物的基底首先，將聚合物和基底加熱到室溫至聚合物熔融溫度之間；其次，固定基底，對聚合物施加垂直于基底的50N的向下的壓力，并沿水平方向對聚合物施加5N的推力，使聚合物在基底上水平延展，得到具有摩擦取向的聚合物的基底；其中，所述基底的動摩擦系數為
O.06 ；2)將步驟I)制得的具有摩擦取向的聚合物的基底浸入生物相容性高分子溶液中，緩慢提拉基底，待生物相容性高分子溶液的溶劑完全揮發后，在生物相容高分子玻璃化轉變溫度與熔融溫度之間對基底進行熱處理，得到具有聚合物/生物相容性高分子ニ元復合膜的基底；3)在具有聚合物/生物相容性高分子ニ元復合膜的基底上進行細胞培養。所述聚合物為聚こ烯。所述基底為石英片。所述生物相容性高分子溶液是將生物相容性高分子與溶劑混合，配制成每100毫升溶劑中含有O. I克生物相容性高分子的溶液。所述生物相容性高分子為聚己內酷。所述溶劑為蒸餾水、こ醇、甲苯的混合物。實施例6同實施例5。區別在于，所述聚合物為聚甲基丙烯酸甲酷。所述基底為單晶硅片。所述生物相容性高分子為聚乳酸、聚氨酯混合物。所述溶劑為ニ氯甲烷、三氯甲烷、四氫呋喃的混合物。實施例7同實施例5。區別在于，所述聚合物為聚偏氟こ烯。所述基底為單晶硅片。所述生 物相容性高分子為聚こ醇酸、聚己丙酰胺、聚乳酸-羥基こ酸共聚物混合物。所述溶劑為丙酮、丁酮的混合物。實施例8ー種具有取向生長結構細胞的材料的制備方法，包括以下步驟I)制備具有摩擦取向的聚合物的基底首先，將聚合物和基底加熱到室溫至聚合物熔融溫度之間；其次，固定基底，對聚合物施加垂直于基底的500N的向下的壓カ，并沿水平方向對聚合物施加300N的推力，使聚合物在基底上水平延展，得到具有摩擦取向的聚合物的基底；其中，所述基底的動摩擦系數為 0.7 ;2)利用旋涂法將生物相容性高分子溶液旋涂到步驟I)制得的具有摩擦取向的聚合物的基底上，旋涂速度為5000轉/分，待生物相容性高分子溶液的溶劑完全揮發后，在生物相容高分子玻璃化轉變溫度與熔融溫度之間對基底進行熱處理，得到具有聚合物/生物相容性高分子ニ元復合膜的基底；3)在具有聚合物/生物相容性高分子ニ元復合膜的基底上進行細胞培養。所述聚合物為聚酰亞胺。所述基底為玻璃片。所述生物相容性高分子溶液是將生物相容性高分子與溶劑混合，配制成每100毫升溶劑中含有5克生物相容性高分子的溶液。所述生物相容性高分子為膠原、絲蛋白混合物。實施例9同實施例8。區別在于，所述聚合物為聚對苯ニ甲酸ニこ酷。所述生物相容性高分子為纖維素。所述溶劑為環己酮。實施例10同實施例8。區別在于，所述聚合物為聚こ烯萘酸酷。所述生物相容性高分子為殼聚糖。所述溶劑為環己酮。實施例11同實施例8。區別在于，所述聚合物為聚醚砜。實施例12同實施例8。區別在于，所述聚合物為聚碳酸酷。顯然，本發明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而并非是對本發明的實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變 動。這里無法對所有的實施方式予以窮舉。凡是屬于本發明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明的保護范圍之列。
權利要求
1.一種具有取向生長結構細胞的材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)制備具有摩擦取向的聚合物的基底； 2)在具有摩擦取向的聚合物的基底上附著生物相容性高分子薄膜，得到具有聚合物/生物相容性高分子二元復合膜的基底； 3)在具有聚合物/生物相容性高分子二元復合膜的基底上進行細胞培養。
2.根據權利要求I所述的具有取向生長結構細胞的材料的制備方法，其特征在于，所述步驟I)是首先，將聚合物和基底加熱到室溫至聚合物熔融溫度之間；其次，固定基底，對聚合物施加垂直于基底的5(T500N的向下的壓力，并沿水平方向對聚合物施加5 300N的推力，使聚合物在基底上水平延展，得到具有摩擦取向的聚合物的基底；其中，所述基底的動摩擦系數為0. 06 0.7。
3.根據權利要求I或2所述的具有取向生長結構細胞的材料的制備方法，其特征在于， 所述聚合物為聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚酰亞胺、聚對苯二甲酸二乙酯、聚乙烯萘酸酯、聚醚砜或聚碳酸酯。
4.根據權利要求I或2所述的具有取向生長結構細胞的材料的制備方法，其特征在于，所述基底為玻璃片、石英片或單晶硅片。
5.根據權利要求I所述的具有取向生長結構細胞的材料的制備方法，其特征在于，所述步驟2)是將步驟I)制得的具有摩擦取向的聚合物的基底浸入生物相容性高分子溶液中，緩慢提拉基底，待生物相容性高分子溶液的溶劑完全揮發后，在生物相容高分子玻璃化轉變溫度與熔融溫度之間對基底進行熱處理，得到具有聚合物/生物相容性高分子二元復合膜的基底。
6.根據權利要求I所述的具有取向生長結構細胞的材料的制備方法，其特征在于，所述步驟2)是利用旋涂法將生物相容性高分子溶液旋涂到步驟I)制得的具有摩擦取向的聚合物的基底上，旋涂速度為50(T5000轉/分，待生物相容性高分子溶液的溶劑完全揮發后，在生物相容高分子玻璃化轉變溫度與熔融溫度之間對基底進行熱處理，得到具有聚合物/生物相容性高分子二元復合膜的基底。
7.根據權利要求I所述的具有取向生長結構細胞的材料的制備方法，其特征在于，所述生物相容性高分子溶液是將生物相容性高分子與溶劑混合，配制成每100毫升溶劑中含有0. rs克生物相容性高分子的溶液。
8.根據權利要求I或7所述的具有取向生長結構細胞的材料的制備方法，其特征在于，所述生物相容性高分子為聚己內酯、聚乳酸、聚氨酯、聚乙醇酸、聚己丙酰胺、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、膠原、絲蛋白、纖維素、殼聚糖中的一種或兩種以上混合物。
9.根據權利要求7所述的具有取向生長結構細胞的材料的制備方法，其特征在于，所述溶劑為蒸餾水、乙醇、甲苯、二甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氫呋喃、丙酮、丁酮、環己酮中的一種或兩種以上混合物。
10.根據權利要求I所述的具有取向生長結構細胞的材料的制備方法，其特征在于，所述細胞為成纖維細胞、肌細胞、骨細胞或干細胞。
全文摘要
本發明公開了一種具有取向生長結構細胞的材料的制備方法；通過在摩擦取向的聚合物的基底上涂覆生物相容性高分子薄膜，經熱處理復合形成聚合物/生物相容性高分子二元復合膜，之后在該復合膜上進行細胞培養，得到具有取向生長結構細胞的材料；該制備方法能大批量、低成本地制備具有取向生長結構細胞的材料。
文檔編號C08J7/04GK102850567SQ201210357110
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月21日 優先權日2012年9月21日
發明者牛忠偉, 王艷明, 蔣士冬 申請人:中國科學院理化技術研究所