專利名稱：原位聚合法制備安石榴苷分子印跡聚合物整體柱的方法
技術領域：
本發明涉及一種原位聚合制備安石榴苷分子印跡聚合物整體柱的方法，
背景技術：
分子印跡技術是指以特定的分子為模板，制備對該分子有特殊識別功能和高選擇性材料的技術，通常被人們描述為制造識別“分子鑰匙”的“人工鎖”技術。它將模板分子、單體、交聯劑溶解在一定的溶液中形成預聚合溶液，經過聚合反應形成具有與模板分子在空間結構上完全匹配、并與模板分子特異性結合的功能基的三維空穴的聚合物。當前MIP的制備方法很多，主要有⑴本體聚合法；⑵懸浮聚合法；⑶分散聚合法；⑷沉淀聚合法；(5)表面印跡聚合法等等。但這些方法存在一些缺陷，如本體聚合制備的MIP，必須經過研磨、篩分等處理。但在研磨過程中不可避免地破壞部分結合位點，得到粒子形狀不均勻， 最終MIP的產率只有50%左右；懸浮聚合法制備平均粒徑小于10 μ m的MIP時，產物的單分散性和規整性都急劇下降，且亞微米級的微球難以得到；分散聚合法制備過程較為復雜，且所用到的分散劑和惰性分散體系昂貴；沉淀聚合法產率低；表面模板聚合法制備方法雖然較為簡單，但只能進行少部分特定分子的印跡，應用范圍較窄。此外，上述方法在實際應用前都需要經過繁瑣的裝柱技術。原位聚合是近期發展的制備MIP的新技術，可通過一步聚合完成反應，在空的色譜柱內用該法形成的整體柱通過洗脫除去模板分子后可直接應用。該技術的關鍵是針對不同的模板分子尋找具有合適的致孔劑體系和聚合體系，以獲得具有良好的通透性、選擇性及高柱效的MIP整體柱。安石榴苷為石榴皮總多酚中的主要成分，占石榴皮總多酚干重的60%，由于它含有配糖基，水溶性好，易被人體吸收，發揮其抗癌、抗氧化的作用，是療效顯著的天然藥物活性組分。但由于天然產物的有效成分含量低，難于富集；體系復雜，大分子和小分子、生命和非生命物質共存，特別是存在結構相近的異構體，導致分離純化難度大；許多天然產物的有效成分對熱敏感，易水解等，因此通過分離純化得到較高純度的安石榴苷是其研究和開發的一個主要難點。

發明內容
本發明的目的在于提供一種原位聚合制備安石榴苷分子印跡聚合物整體柱的方法，該方法將預聚合混合溶液直接注入到不銹鋼管柱內制備連續棒形聚合物，得到具有固定空穴大小和形狀、有確定排列功能團、識別模板分子的交聯高聚物材料，即分子印跡聚合物(MIP)。經該方法得到的分子印跡聚合物(MIP)整體柱不僅具有印跡效果，而且具有滲透性好的優點，印跡因子可達13. 1，同時該方法制備過程簡單，內部結構均勻，重現性好，避免了繁瑣的裝柱手續，可直接用于分析。本發明所述的一種原位聚合制備安石榴苷分子印跡整體柱的方法，按下列步驟進行a、將質量百分數為模板分子為安石榴苷3. 00-3. 19 %、功能單體為丙烯酰胺2.37-2. 51 %、交聯劑為二甲基丙烯酸乙二醇酯29. 03-33. 03 %、致孔劑為聚苯乙烯溶于四氫呋喃溶液56. 50-59. 87 %、再加入異辛烷4. 68-4. 96 %、引發劑為偶氮二異丁腈O. 42-0. 44%混合，超聲20分鐘，使其均勻，澄清，然后轉移到干凈的不銹鋼管柱中，超聲脫氣15分鐘，將不銹鋼管柱兩端封住，于溫度60°C的恒溫水浴鍋內反應16-32小時；b、將不銹鋼管柱取出并連接到HPLC的高壓泵上，先用四氫呋喃沖洗，以除去整體柱中殘留的致孔劑，然后用體積比甲醇乙酸=9 I混合液沖洗至除去模板分子，流速由O. lml/mim逐漸增大，沖洗液總體積為150ml，即可得到安石榴苷分子印跡整體柱。步驟a所述的致孔劑聚苯乙烯溶于四氫呋喃溶液中的濃度為40mg/ml。步驟a所述的不銹鋼管柱內為100X4. 6mm I. D.。本發明首次采用原位聚合合成安石榴苷分子印跡聚合物整體柱，該方法通過將預聚合溶液注入到空的色譜柱中，在柱管內一步完成聚合。該合成方法制備過程簡單，簡化實驗過程，容易操作。由于聚合過程一步完成，避免了復雜的裝柱程序，大大減少操作時間。 本發明采用通過實驗設計，找到合成安石榴苷分子印跡整體柱的最適宜反應物配比；即印跡分子、功能單體和交聯劑的及致孔劑的比例，制備得到對安石榴苷具有較好選擇性的分子印跡整體柱。在同組分配比下，合成不加模板分子的空白柱，相同條件下進行色譜分析，可獲得高的印跡因子，且印跡柱可以用來進行安石榴苷與類似物的分離。


圖I為本發明印跡整體柱上安石榴苷與其類似物鞣花酸、沒食子酸、沒食子酸甲酯、對羥基苯甲酸及3，4_ 二羥基苯甲酸的色譜保留圖，其中I為丙酮，2為鞣花酸，3為沒食子酸甲酯，4為對羥基苯甲酸，5為沒食子酸，6為3，4_ 二羥基苯甲酸，7為安石榴苷，其中丙酮峰表示色譜柱死時間；圖2為本發明無安石榴苷印跡的空白整體柱上安石榴苷與其類似物鞣花酸、沒食子酸、沒食子酸甲酯、對羥基苯甲酸及3，4_二羥基苯甲酸的色譜保留圖，其中I為丙酮，2為對羥基苯甲酸，3為沒食子酸甲酯，4為沒食子酸，5為3，4- 二羥基苯甲酸，6為鞣花酸，7為安石榴苷，其中丙酮峰表示色譜柱死時間；圖3為本發明安石榴苷與其類似物鞣花酸、沒食子酸、沒食子酸甲酯、對羥基苯甲酸及3，4_ 二羥基苯甲酸在改變交聯劑比例合成的印跡柱上的保留色譜圖，I為丙酮，2為鞣花酸，3為3，4_ 二羥基苯甲酸，4為沒食子酸，5為沒食子酸甲酯，6為安石榴苷，其中丙酮峰表示色譜柱死時間；圖4為本發明安石榴苷與其類似物鞣花酸、沒食子酸、沒食子酸甲酯、對羥基苯甲酸及3，4- 二羥基苯甲酸在改變聚合時間印跡柱上的保留色譜圖其中I為丙酮，2為安石榴苷，3為鞣花酸，4為沒食子酸，5為沒食子酸甲酯，其中丙酮峰表示色譜柱死時間。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步詳細闡述本發明。實施例I安石榴苷分子印跡整體柱制備及分離安石榴苷及其結構類似物利用原位聚合法合成安石榴苷為模板的分子印跡整體柱，在合適的色譜條件下，連于高效液相色譜儀評價其保留性能。合成反應條件及處理方法如下原位聚合法制備安石榴苷分子印跡整體柱a、按一根不銹鋼管柱內合成安石榴苷印跡整體柱的質量數，準確稱取模板分子為安石榴苷3. 00%、功能單體為丙烯酰胺2. 37%、交聯劑為二甲基丙烯酸乙二醇酯33. 03%,致孔劑為聚苯乙烯溶于四氫呋喃溶液56. 50% (其中聚苯乙烯溶于四氫呋喃溶液中的濃度為40mg/ml)、再加入異辛烷4. 68 %，引發劑為偶氮二異丁腈O. 42 %混合，超聲20分鐘，使其均勻，澄清，然后轉移到干凈的不銹鋼管柱100X4. 6_ I.D.中，超聲脫氣15分鐘，將不銹鋼管柱兩端封住，于溫度60°C的恒溫水浴鍋內反應20小時；b、模板分子的去除將合成好的不銹鋼管柱取出并連接到HPLC的高壓泵上，先用四氫呋喃沖洗，以除去整體柱中殘留的致孔劑，然后用體積比甲醇乙酸=9 I混合液沖 洗至完全除去模板分子，流速由O. lml/mim逐漸增大，沖洗液總體積為150ml，即可得到安石榴苷分子印跡整體柱。用高效液相色譜法對其進行色譜分析，檢測波長設置為258nm，先用緩沖溶液沖安石榴苷分子印跡高效液相整體柱，使系統穩定至基線水平，進樣，測定安石榴苷的保留時間tK和丙酮的保留時間h，安石榴苷的保留因子用公式k’ = U1TtciVtci計算。結果表明，在流動相條件為乙腈/乙酸鹽緩沖液(90/10，v/v)(其中鹽濃度為200mmol/L, pH 3. 6)，流速I. Oml/min時，柱溫為30°C，模板安石榴苷可與類似物得到分離(圖 I)。實施例2 (對照)空白整體柱分離安石榴苷及其結構類似物為考察安石榴苷及其結構類似物在非印跡柱上的保留情況，合成不加模板安石榴苷的空白柱作為對照。具體操作步驟如下除不加模板分子安石榴苷外，用實施例I相同的方法和實驗條件合成非印跡空白柱。聚合完成后，用四氫呋喃沖洗，以除去整體柱中殘留的致孔劑和未反應的試劑。色譜評價同實施例I中對印跡柱的考察，即在相同流動相條件下，通過測定安石榴苷及其類似物的保留時間tK和丙酮的保留時間h，計算保留因子k’。結果表明，在空白柱上模板與類似物出峰時間相近，沒有達到基線分離(圖2)。通過比較模板分子在印跡整體柱和空白整體柱上的保留因子，計算印跡因子IF，IF = k，MIPs/k，NIPs。來評價印跡柱的保留性能。結果顯示，k’MIPs = 9. 240,k，NIPs = O. 707,IF= 13. I。表明印跡柱對安石榴苷分子具有很強的特異識別能力，保留因子遠遠大于其他類似物，對分離安石榴苷和其類似物可達到基線分離，因此可以用來作為從混合物中提取分離安石榴苷的方法。實施例3原位聚合法制備安石榴苷分子印跡整體柱a、按一根不銹鋼管柱內合成安石榴苷印跡整體柱的質量數，準確稱取模板分子為安石榴苷3. 19%、功能單體為丙烯酰胺2. 51%、交聯劑為二甲基丙烯酸乙二醇酯29. 03%,致孔劑為聚苯乙烯溶于四氫呋喃溶液59. 87% (其中聚苯乙烯溶于四氫呋喃溶液中的濃度為40mg/ml)、再加入異辛烷4. 96 %、引發劑為偶氮二異丁腈O. 44%混合，放入超聲器中，超聲20分鐘，使其均勻，澄清，然后轉移到干凈的不銹鋼管柱內(100X4. 6_ I.D.)，超聲脫氣15分鐘，將不銹鋼管柱兩端封住，于溫度60°C的恒溫水浴鍋內反應32小時；b、模板分子的去除將合成好的不銹鋼管柱取出并連接到HPLC的高壓泵上，先用四氫呋喃沖洗，以除去整體柱中殘留的致孔劑，然后用體積比甲醇乙酸=9 I混合液沖洗至完全除去模板分子，流速由O. lml/mim逐漸增大，沖洗液總體積為150ml，即可得到安石榴苷分子印跡整體柱。色譜評價同實施例1，在流動相為乙腈/乙酸鹽緩沖液(90/10，v/v)(其中鹽濃度200mmol/L, pH 3. 6)，流速為I. Oml/min，柱溫為25°C時，得到色譜分離圖(圖3)。實驗結果表明，在交聯劑為29. 03%合成的印跡柱上，模板分子的柱效降低，拖尾現象嚴重。實施例4原位聚合法制備安石榴苷分子印跡整體柱
a、按一根不銹鋼管柱內合成安石榴苷印跡整體柱的質量數，準確稱取模板分子為安石榴苷3. 19%、功能單體為丙烯酰胺2. 51%、交聯劑為二甲基丙烯酸乙二醇酯29. 03%,致孔劑為將聚苯乙烯溶于四氫呋喃溶液59. 87% (其中聚苯乙烯溶于四氫呋喃溶液中的濃度為40mg/ml)、再加入異辛烷4. 96%、引發劑為偶氮二異丁腈O. 44%混合，放入超聲器中，超聲20分鐘，使其均勻，澄清，然后轉移到干凈的不銹鋼管柱內(100X4. 6_ I.D.)，超聲脫氣15分鐘，將不銹鋼管柱兩端封住，于溫度60°C的恒溫水浴鍋內反應16小時；b、模板分子的去除將合成好的不銹鋼管柱取出并連接到HPLC的高壓泵上，先用四氫呋喃沖洗，以除去整體柱中殘留的致孔劑，然后用體積比甲醇乙酸=9 I混合液沖洗至完全除去模板分子，流速由O. lml/mim逐漸增大，沖洗液總體積為150ml，即可得到安石榴苷分子印跡整體柱。色譜評價同實施例1，在流動相為乙腈/乙酸鹽緩沖液(70/30，v/v)(其中鹽濃度50mmol/L, pH 3. 6)，流速0. 5ml/min時，柱溫為25°C時，得到色譜分離圖(圖4)。實驗結果表明，聚合時間為16小時合成的印跡柱模板分子拖尾現象嚴重，模板與類似物沒有達到基線分離。
權利要求
1.ー種原位聚合制備安石榴苷分子印跡整體柱的方法，其特征在于按下列步驟進行a、將質量百分數為模板分子為安石榴苷3.00-3. 19 %、功能單體為丙烯酰胺2.37-2. 51 %、交聯劑為ニ甲基丙烯酸こニ醇酯29. 03-33. 03 %、致孔劑為聚苯こ烯溶于四氫呋喃溶液56. 50-59. 87%、再加入異辛烷4. 68-4. 96 %、引發劑為偶氮ニ異丁腈O.42-0. 44%混合，超聲20分鐘，使其均勻，澄清，然后轉移到干凈的不銹鋼管柱中，超聲脫氣15分鐘，將不銹鋼管柱兩端封住，于溫度60°C的恒溫水浴鍋內反應16-32小時；b、將不銹鋼管柱取出并連接到HPLC的高壓泵上，先用四氫呋喃沖洗，以除去整體柱中殘留的致孔劑，然后用體積比甲醇こ酸=9 I混合液沖洗至除去模板分子，流速由.0.lml/mim逐漸増大，沖洗液總體積為150ml，即可得到安石榴苷分子印跡整體柱。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟a所述的致孔劑聚苯こ烯溶于四氫呋喃溶液中的濃度為40mg/ml。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟a所述的不銹鋼管柱為100X4.6mm.1.D.。
全文摘要
本發明涉及一種原位聚合法制備安石榴苷分子印跡聚合物整體柱的方法，該方法將預聚合混合溶液直接注入到不銹鋼管柱內制備連續棒形聚合物，得到具有固定空穴大小和形狀、有確定排列功能團、識別模板分子的交聯高聚物材料，即分子印跡聚合物。經該方法得到的分子印跡聚合物整體柱不僅具有印跡效果，而且具有滲透性好的優點，印跡因子可達13.1，同時該方法制備過程簡單，內部結構均勻，重現性好，避免了繁瑣的裝柱手續，可直接用于分析。
文檔編號C08F220/56GK102847526SQ20121036778
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月28日 優先權日2012年9月28日
發明者劉照勝, 班璐, 黃艷萍, 阿吉艾克拜爾·艾薩 申請人:中國科學院新疆理化技術研究所