本發明屬于細胞生物學以及以空間生物學研究領域為代表的特殊環境生物學研究領域，具體涉及一種無CO₂環境下的貼壁細胞和懸浮細胞專用培養基及細胞培養方法。

背景技術：

首先，隨著載人航天和空間探索的深入，以及載人航天等一系列任務的成功，我國已經進入了太空研究探索階段。未來的20年，將會是中國空間生物學研究的黃金時期，并且空間生物學研究對空間航天醫學的發展和空間生物技術的轉化至關重要。

其次，細胞模型法是將所研究的復雜生物問題轉化為對某種細胞的研究或某幾種細胞相互作用的研究，以達到以點帶線的效果，從細胞層面的變化推測生物體的變化。細胞模型法能將復雜的生物問題簡化，故該法被廣泛地用于各種傳統生物學研究中，如各種疾病的病理研究以及免疫學研究等。而細胞培養技術是生物技術中最核心、最基礎的技術，也是細胞模型法的基礎。同時細胞模型也被廣泛地應用于以航天醫學和空間生物學研究為代表的特殊環境生物學的研究中。早期，前蘇聯就已經在發射Zond5和Zond7時，將HeIa細胞帶上了太空，而隨著地面模擬機制的完善和空間搭載機會的增加，現代細胞分子生物學技術也在不斷飛速發展，這為空間細胞生物學的研究帶來了極大的便利條件，與之相應的空間細胞研究裝置也層出不窮。到目前為止，包括美國國家航空局(NASA)，歐空局(ESA)等多家國際航空組織在內，均實現了諸多空間搭載細胞培養實驗任務。例如，NASA的MSC-22633-1，-2任務搭建了一套可用于2D或3D培養生物細胞和組織的裝置，利用電磁場刺激來觀測其對細胞生長的作用。然而，一方面空間環境對細胞培養裝置有特殊需求：1)因空間艙內體積狹小，需以最優配比實現空間體積利用率，因此要盡量減小搭載裝置的體積；2)由于空間環境搭載能源有限，應盡量降低額外的能源消耗，在保證相關設施的正常運行外，應盡量降低功耗；3)航天搭載實驗應盡量保證簡單可控，在無人操作時保證儀器自行正常運轉。而另一方面由于長期的空間環境飛行會降低宇航員的工作能力，所以應盡量減少人工操作，以保證低實驗誤差。

再次，微流控系統，作為21世紀新興的科學技術方法，能夠滿足上述多項要求，體現出其獨一無二的優勢，因此已經成功的引進并應用到了航天等特殊環境領域。將微流控細胞培養技術應用于空間站等特殊環境的生物學研究中，可以為特殊環境細胞生物學研究提供有利平臺。大量的微流控芯片細胞培養實驗表明，多種細胞可在其內部維持長時間生長并維持生物活性，保證了特殊環境下細胞的實時動態檢測，同時其提供可控的閥路控制及靈活多變的微設計結構有利于構建多種特殊環境生物學效應模型，為特殊環境細胞生物學研究帶來了更為便捷的創新方法。

最后，地面實驗中，細胞培養均需要在5％CO₂條件下進行，然而，在以空間站為代表的特殊環境中，卻難以實現對細胞培養中CO₂的供應，故在地面上使用的細胞培養方法，無論是微流控細胞培養技術或是傳統細胞培養技術，均難以低成本地直接在空間站等特殊環境中實現。

技術實現要素：

為了克服現有技術上的問題，本發明提供了一種無CO₂下的細胞培養方法，既可以應用于針對空間站等特殊環境生物學研究或者便攜式檢測設備中的小型化、低功耗、微流控芯片細胞培養設備上，也可以應用于傳統細胞培養方法。

本發明提供的無CO₂環境下的貼壁細胞和懸浮細胞專用培養基，成分包括基礎培養基(如DMEM等)、胎牛血清、HEPES，并根據所培養細胞的具體要求，選擇添加MEM NEAA(100×)、青霉素G、鏈霉素等。以上成分均已經商業化，可以直接購買市售商品，例如其中DMEM、胎牛血清、青霉素G、鏈霉素可購自Gibco品牌，MEM NEAA(100×)可購自Sigma品牌，HEPES可購自Solarbio品牌。

DMEM：一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養基，是在MEM培養基的基礎上研制的。

應說明的是，發明選用特定的培養基培養特定細胞，本發明不限于基礎培養基的種類，一切可以實現本發明的基礎培養基都包括在本發明中。

青霉素G、鏈霉素均為抗生素，可抑制細胞培養中的雜菌生長。

MEM NEAA(100×)：非必需氨基酸，作為細胞培養中的一種添加物，可提高細胞生長速度以及細胞存活率。

HEPES：N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸，是一種良好的緩沖物質，可代替Na₂CO₃和CO₂(HCO^3-)組成的共軛酸堿對，使細胞培養過程中，培養體系的pH值穩定在一定范圍內。

本發明提供以下技術方案：

一種在無CO2環境下細胞培養用培養基，所述培養基包括：90％基礎培養基、10％胎牛血清以及10mmol/L～100mmol/L N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸HEPES緩沖液。

進一步地，所述培養基包括：90％基礎培養基、10％胎牛血清以及10mmol/L～100mmol/L HEPES，還包括90～130U/mL青霉素G溶液、90～130μg/mL鏈霉素溶液和體積濃度0.5～2％非必要氨基酸MEM NEAA(100×)溶液。

進一步地，所述培養基包括：90％基礎培養基、10％胎牛血清以及10mmol/L～100mmol/L HEPES，還包括100U/mL青霉素G溶液、100μ g/mL鏈霉素溶液和體積濃度1％非必要氨基酸MEM NEAA(100×)溶液。

進一步地，所述基礎培養基為DMEM培養基、RPMI-1640培養基、L15培養基、DMEM/F12培養基中的一種。

進一步地，所述無CO2環境下細胞培養用培養基適用于常規細胞培養中，也適用于微流控芯片細胞的培養中。

進一步地，所述無CO2環境下細胞培養用培養基用在單種細胞培養或者多種細胞的共培養體系中，

所述無CO2環境下細胞培養用培養基用于懸浮細胞培養或貼壁細胞培養。

一種利用無CO2環境下細胞培養用培養基培養常規細胞的方法，包括以下步驟：

(1)將細胞用胰蛋白酶消化成細胞懸液后，離心，并用所述的無CO2環境下細胞培養基重懸；

(2)將重懸的細胞計數后，按照1×105～1×106個/mL接種至培養容器中，置于37℃大氣環境下培養。

進一步地，包括以下步驟：

(1)微流控芯片細胞培養腔室預先用包被液包被；

(2)將細胞用胰蛋白酶消化成細胞懸液后，離心，并用所述的無CO2環境下細胞培養基重懸，并將細胞懸液稀釋至合適范圍內，作為種子液，接種至微流控芯片中；

(3)將芯片置于37℃大氣環境下靜置至少3小時后，觀察細胞形態，若貼壁細胞已經形態正常，則以0.3mL/h開始灌流培養，若形態未正常，則將芯片內部培養液更換成新鮮的所述的無CO2環境下細胞培養用培養基繼續培養，繼續靜置至細胞貼壁后開始灌流培養。

進一步地，在步驟(1)中，使用的貼壁細胞包被液的成分為50～1200μg/mL人血漿來源的纖連蛋白，0.24g/L KH2PO4溶液、3.58g/L Na2HPO4·12H2O溶液、8g/L NaCl溶液以及0.2g/L KCl溶液，溶液pH值為7.2～7.4。

進一步地，步驟1中細胞為懸浮細胞則不需要包被，步驟2中細胞為懸浮細胞則不需要消化。

進一步地，步驟1中細胞為懸浮細胞則不需要包被，步驟2中細胞為懸浮細胞則不需要消化。

采用上述技術方案，本發明具有如下有益效果：

現代實驗室中一般使用傳統細胞培養技術，傳統細胞培養技術中，一般需要CO₂氣瓶作為CO₂源，而氣瓶體積大，且不方便攜帶，這大大限制了細胞培養的應用。使用本發明提供的無CO₂細胞培養專用培養基在傳統培養器皿或微流控芯片中培養細胞，可不需要CO₂氣瓶，故培養裝置的體積和重量均能大大降低，這大大拓寬了細胞培養技術的應用范圍。使用本專利提供的無CO₂細胞培養專用培養基的培養裝置可應用于便攜式快速細胞培養分析裝置、空間站等特殊環境中的生物學培養裝置中等。

附圖說明

圖1是實施例1和實施例2中使用的微流控芯片結構圖；

圖2是實施例1和實施例2中培養的細胞形態檢測結果圖；

圖3是實施例3中使用無CO₂細胞培養專用培養基培養的細胞形態檢測結果圖；

圖4是實施例3中使用普通培養基培養的細胞形態檢測結果圖；

圖5是實施例3中MTS試驗的結果圖；

圖6是實施例4中使用無CO₂細胞培養專用培養基培養的細胞形態檢測結果圖；

圖7是實施例4中使用普通培養基培養的細胞形態檢測結果圖；

圖8是實施例4中MTS試驗的結果圖。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的結構圖及具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

實施例1

無CO₂環境下微流控芯片內兩種貼壁細胞的共培養

1、微流控芯片的加工與包被

如圖1所示，結構由下至上分別為底層蓋板、下層腔室、篩絹、上層腔室和上層蓋板，芯片使用時通過雙面膠及水晶滴膠以逐層累加的方式將每一層粘合到一起，形成需要的芯片，出入口通過硅膠管連接，芯片上下腔室使用篩絹隔開，再將芯片置于烘箱，在60℃下固化24h，保證水晶滴膠完全固化后待用。

成品芯片使用前，需要預處理。對于微流控芯片表面，需提前紫外消毒1h，微流控芯片培養腔室內部需要依次使用75％乙醇和0.1M PBS清洗，再使用質量濃度為500μg/mL的纖連蛋白包被1h后，方可接種細胞。

2、常規細胞培養

人神經母細胞瘤SH-SY5Y、人神經膠質瘤U87MG凍存于-150℃中，實驗前，復蘇細胞，置于37℃，5％CO₂培養箱中，培養于DMEM培養基，培養基中添加10％胎牛血清，100U/mL青霉素G和100μg/mL鏈霉素和2％MEM NEAA 100X。應說明的是，本實施例選用DMEM培養基培養人神經母細胞瘤SH-SY5Y、人神經膠質瘤U87MG，培養其他細胞也可以選用其他培養基，本發明不限于基礎培養基的種類，一切可以實現本發明的基礎培養基都可以用在本發明中。

3、微流控芯片細胞培養

取胰蛋白酶消化細胞，消化結束后用胎牛血清終止消化。經過消化的細胞經1000rpm離心5min，使用無CO₂細胞培養專用培養基重懸沉淀后，使用手持式自動細胞計數儀對細胞進行計數，所使用的計數芯片的尺寸為60μm，并將SH-SY5Y與U87MG細胞按照1∶1.65配制成1×105細胞懸液，最后接種至微流控芯片腔室中，置于37℃無CO₂條件下，待SH-SY5Y細胞以及U87MG細胞貼壁后開始灌流培養。

4、細胞形態檢測

使用相差顯微鏡，分別觀察貼壁細胞形態，細胞形態結果如圖2中A所示。

實施例2

無CO₂環境下微流控芯片內的免疫細胞培養

1、微流控芯片的加工

使用實施例一中相同的微流控芯片。但芯片表面腔室可不包被。

2、常規細胞培養

人單核細胞系THP-1細胞凍存于-150℃中，實驗前，復蘇細胞，置于37℃，5％CO₂培養箱中，培養于RPMI-1640培養基，培養基中添加10％胎牛血清，90U/mL青霉素G和130μg/mL鏈霉素。

3、微流控芯片細胞培養

吸取THP-1細胞置于離心管中，經1000rpm離心5min后，棄上清，并使用無CO₂細胞培養專用培養基將沉淀重懸，再使用手持式自動細胞計數儀對細胞進行計數，所使用的計數芯片的尺寸為60μm，并將THP-1細胞稀釋成1×10⁵細胞懸液，最后接種至微流控芯片腔室中，置于37℃無二氧化碳條件下，靜置3h后開始灌流培養。

4、細胞形態檢測

使用相差顯微鏡，分別觀察貼壁細胞和懸浮細胞形態，細胞形態結果如圖2中B所示。

實施例3

無CO₂環境下的貼壁細胞共培養

1、96孔板上的細胞培養

SH-SY5Y、U87MG凍存于-150℃中，實驗前，復蘇細胞，置于37℃，5％CO₂培養箱中，培養于DMEM培養基，培養基中添加10％胎牛血清，130U/mL青霉素G和90μg/mL鏈霉素和0.5％MEM NEAA(100X)。實驗時，取胰蛋白酶消化細胞，消化結束后用胎牛血清終止消化。經過消化的細胞經1000rpm離心5min，使用無CO₂細胞培養專用培養基重懸沉淀后，使用手持式自動細胞計數儀對細胞進行計數，所使用的計數芯片的尺寸為60μm，并將SH-SY5Y與U87MG細胞按照1∶1.65配制成細胞懸液，最后按照5000個細胞每孔將稀釋好的細胞懸液接種至孔中，置于37℃無CO₂的培養箱中，培養24h。

2、細胞形態檢測

使用相差顯微鏡，分別觀察貼壁細胞形態，使用專用培養基培養的細胞形態結果如圖3，使用普通培養基培養的細胞形態如圖4。

3、MTS法檢測細胞存活率

細胞培養24h后，按照培養物：MTS＝100：20(V/V)向96孔板中添加MTS，置37℃避光孵育2h，充分震蕩5min，最后使用酶標儀在490nm處下測定吸光值。樣品的吸光值減去已加MTS空培養基的吸光值即為每孔樣品的MTS的吸光度。MTS的吸光值越大細胞存活率越高，細胞存活情況如圖5。

實施例4

無CO₂環境下的懸浮細胞培養

1、96孔板上的細胞培養

人單核細胞系THP-1凍存于-150℃中，實驗前，復蘇細胞，置于37℃，5％CO₂培養箱中，培養于RPMI-1640培養基，培養基中添加10％胎牛血清，100U/mL青霉素G和100μg/mL鏈霉素。實驗時，吸取細胞培養液，置于離心管中，經1000rpm離心5min，使用無CO₂細胞培養專用培養基重懸沉淀后，使用手持式自動細胞計數儀對細胞進行計數，所使用的計數芯片的尺寸為60μm，最后按照5000個細胞每孔將稀釋好的細胞懸液接種至孔中，置于37℃無CO₂的培養箱中，培養24h。

2、細胞形態檢測

使用相差顯微鏡，分別觀察懸浮細胞形態，使用專用培養基培養的細胞形態結果如圖6，使用普通培養基培養的細胞形態如圖7。

3、MTS法檢測細胞存活率

細胞培養24h后，按照培養物：MTS＝100：20(V/V)向96孔板中添加MTS，置37℃避光孵育2h，充分震蕩5min，最后使用酶標儀在490nm處下測定吸光值。樣品的吸光值減去已加MTS空培養基的吸光值即為每孔樣品的MTS的吸光度。MTS的吸光值越大細胞存活率越高，細胞存活情況如圖8所示。

以上所述實施例僅表達了本發明的實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。