本發明屬于心肌細胞分離
技術領域：
，具體涉及一種心肌細胞分離方法。
背景技術：
：心肌細胞動物生長發育、生理、代謝的重要細胞之一。為了方便研究心肌細胞的生理功能、觀察細胞形態，排除體內各種限制因素對心肌細胞的影響，通常采用體外分離培養方法。由于心肌細胞位于心臟的心肌組織內，實驗人員分離心肌細胞時，通常需要向離體的心臟中注射消化液，待消化完成后才收集心肌細胞。然而，由于分離心肌細胞時，心臟已經離體，缺乏保護，長時間的消化作用容易引起心肌細胞變形，降低心肌細胞的存活率。技術實現要素：本發明提供的一種心肌細胞分離方法，解決了現有技術中長時間的消化作用容易引起的心肌細胞變形，降低心肌細胞的存活率的問題。本發明提供的一種心肌細胞分離方法，包括以下步驟：步驟1，將新鮮離體的心臟放入4℃預冷的保護液中，剪取心室肌組織，并用沖洗液洗凈，再將心室肌組織剪成1mm×1mm×1mm的小塊，然后于沖洗液中浸泡3-5min，過濾，得到心肌組織樣品，備用；每升所述保護液含有以下組分：8g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的Na2HPO4·H2O、0.06g的KH2PO4、0.35g的NaHCO3，溶劑為雙蒸水；每升沖洗液中含有以下組分：9g的NaCl、0.3g的KCl，溶劑為雙蒸水；步驟2，將心肌組織樣品置于1g/L的胰蛋白酶溶液中，37℃消化5-8min，棄去上清液，得到第一次沉淀物；步驟3，將第一次沉淀物置于高濃度緩沖液中浸泡3-5min，過濾，收集第二次上清液和第二次沉淀物；每升高濃度緩沖液中含有以下組分：8.5g的NaCl、0.25g的KCl，溶劑為雙蒸水；步驟4，將第二次沉淀物置于消化液中，然后用NaOH調節pH至7-7.5，37℃消化5-8min，過濾，收集第三次上清液和第三次沉淀物；步驟5，將第三次沉淀物置于低濃度緩沖液中浸泡3-5min，得到細胞混合物；每升低濃度緩沖液中含有以下組分：6g的NaCl、0.2g的KCl，2-4mg的L-谷氨酸、2-4mg的甘氨酸、1-2g的葡萄糖，溶劑為雙蒸水；步驟6，將第二次上清液、第三次上清液和細胞混合物混合均勻，并用吸管吹打，然后過濾掉心肌組織沉淀物，收集濾液并離心，得到分離后的心肌細胞沉淀。優選的，上述心肌細胞分離方法中，步驟6還包括：用吸管吹打后，加入胎牛血清。優選的，上述心肌細胞分離方法中，步驟6中，胎牛血清的添加量為：胎牛血清與所述細胞混合物的質量比例為5～10:100。優選的，上述心肌細胞分離方法中，步驟5中，每升低濃度緩沖液中含有以下組分：6g的NaCl、0.2g的KCl，2mg的L-谷氨酸、2mg的甘氨酸、2g的葡萄糖，溶劑為雙蒸水。優選的，上述心肌細胞分離方法中，步驟5還包括調節pH步驟，具體為：先用0.01mol/L的HCl調節低濃度緩沖液的pH至6.0-6.5，然后加入第三次沉淀物浸泡。優選的，上述心肌細胞分離方法中，步驟6中，濾液離心的條件為：10000r/min，4℃，離心10min。與現有技術相比，本發明提供的一種心肌細胞分離方法具有以下有益效果：(1)步驟3中采用高濃度的緩沖液浸泡、步驟5中采用低濃度的緩沖液浸泡，使細胞外鉀離子濃度下降，對心肌細胞產生刺激，提高心肌細胞的活性，避免長時間的消化引起的心肌細胞形態發生變化、細胞存活率降低的問題。再者，步驟5中采用的低濃度緩沖液一方面可以促使心肌細胞快速溶出，另一方面為心肌細胞提供了維持細胞滲透壓的NaCl和KCl，以及維持細胞營養的L-谷氨酸、甘氨酸和葡萄糖，使細胞能夠維持一定的生理活性。(2)步驟5中，用吸管吹打后，加入胎牛血清，一方面抑制了胰蛋白酶的活性，防止胰蛋白酶對后續操作的影響，另一方面，心肌細胞在一定濃度的血清中可以維持生理活性。(3)，用HCl調節低濃度緩沖液的pH至6.0-6.5后，可抑制胰蛋白酶的生理活性，快速終止反應，避免具有活性的胰蛋白酶長期與心肌細胞接觸，影響心肌細胞活性。(4)該提取方法避免使用復雜的設備，操作簡單，且經過長時間的消化后，心肌細胞仍保持良好的細胞形態和活性，且能夠存活較長時間。附圖說明圖1為本發明實施例1的方法分離得到的心肌細胞的顯微觀察視圖。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明，但不應理解為本發明的限制。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規條件操作，由于不涉及發明點，故不對其步驟進行詳細描述。當實施例給出數值范圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和科學術語與本
技術領域：
技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據本
技術領域：
的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可以使用與本發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實現本發明。本發明提供的一種心肌細胞分離方法，包括以下步驟：步驟1，將新鮮離體的心臟放入4℃預冷的保護液中，剪取心室肌組織，并用沖洗液洗凈，再用眼科剪將心室肌組織剪成1mm×1mm×1mm的小塊，然后于沖洗液中浸泡3-5min，過濾，得到心肌組織樣品，備用；每升所述保護液含有以下組分：8g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的Na2HPO4·H2O、0.06g的KH2PO4、0.35g的NaHCO3，溶劑為雙蒸水；使用該保護液可保持心肌組織的生理活性。每升沖洗液中含有以下組分：9g的NaCl、0.3g的KCl，溶劑為雙蒸水。步驟2，將心肌組織樣品置于1g/L的胰蛋白酶溶液中，37℃消化5-8min，棄去上清液，得到第一次沉淀物。步驟3，將第一次沉淀物置于高濃度緩沖液中浸泡3-5min，過濾，收集第二次上清液和第二次沉淀物；每升高濃度緩沖液中含有以下組分：8.5g的NaCl、0.25g的KCl，溶劑為雙蒸水。步驟4，將第二次沉淀物置于消化液中，然后用NaOH調節pH至7-7.5，37℃消化5-8min，過濾，收集第三次上清液和第三次沉淀物；步驟5，用0.01mol/L的HCl調節低濃度緩沖液的pH至6.0-6.5，將第三次沉淀物置于低濃度緩沖液中浸泡3-5min，使心肌細胞分散于低濃度緩沖液中，得到細胞混合物；每升低濃度緩沖液中含有以下組分：6g的NaCl、0.2g的KCl，2-4mg的L-谷氨酸、2-4mg的甘氨酸、1-2g的葡萄糖，溶劑為雙蒸水。步驟6，將第二次上清液、第三次上清液和細胞混合物混合均勻，并用吸管吹打，然后過濾掉心肌組織沉淀物，收集慮液，并將收集的濾液經10000r/min，4℃，離心10min，得到分離后的心肌細胞沉淀。步驟3中采用高濃度的緩沖液、步驟5中采用低濃度的緩沖液，使細胞外鉀離子濃度下降，對心肌細胞產生刺激，提高心肌細胞的活性，避免長時間的消化引起的心肌細胞形態發生變化、細胞存活率降低的問題。需要說明的是，步驟6還包括：用吸管吹打后，加入胎牛血清，胎牛血清與所述細胞混合物的質量比例為5～10:100。胎牛血清的添加一方面抑制了胰蛋白酶的活性，防止胰蛋白酶對后續操作的影響，另一方面，心肌細胞在一定濃度的血清中可以維持生理活性。優選的，本發明提供的心肌細胞分離方法，包括以下實施例：實施例1一種成年大鼠的心肌細胞分離方法，包括以下步驟：步驟1，將新鮮離體的心臟放入4℃預冷的保護液中，剪取心室肌組織，并用沖洗液洗凈，再用眼科剪將心室肌組織剪成1mm×1mm×1mm的小塊，然后于沖洗液中浸泡3min，用紗布過濾，得到心肌組織樣品，備用；每升所述保護液含有以下組分：8g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的Na2HPO4·H2O、0.06g的KH2PO4、0.35g的NaHCO3，溶劑為雙蒸水；每升沖洗液中含有以下組分：9g的NaCl、0.3g的KCl，溶劑為雙蒸水。步驟2，將心肌組織樣品置于1g/L的胰蛋白酶溶液中，37℃消化8min，棄去上清液，得到第一次沉淀物。步驟3，將第一次沉淀物置于高濃度緩沖液中浸泡5min，用紗布過濾，收集第二次上清液和第二次沉淀物；每升高濃度緩沖液中含有以下組分：8.5g的NaCl、0.25g的KCl，溶劑為雙蒸水。步驟4，將第二次沉淀物置于消化液中，然后用NaOH調節pH至7.5，37℃消化8min，用紗布過濾，收集第三次上清液和第三次沉淀物；步驟5，用0.01mol/L的HCl調節低濃度緩沖液的pH至6.0-6.5，將第三次沉淀物置于低濃度緩沖液中浸泡5min，使心肌細胞分散于低濃度緩沖液中，得到細胞混合物；每升低濃度緩沖液中含有以下組分：6g的NaCl、0.2g的KCl，2mg的L-谷氨酸、2mg的甘氨酸、2g的葡萄糖，溶劑為雙蒸水。步驟6，將第二次上清液、第三次上清液和細胞混合物混合均勻，并用吸管吹打，然后用紗布過濾掉心肌組織沉淀物，收集慮液，并將收集的濾液經10000r/min，4℃，離心10min，得到分離后的心肌細胞沉淀。實施例2一種新生大鼠的心肌細胞分離方法，包括以下步驟：步驟1，將新鮮離體的心臟放入4℃預冷的保護液中，剪取心室肌組織，并用沖洗液洗凈，再用眼科剪將心室肌組織剪成1mm×1mm×1mm的小塊，然后于沖洗液中浸泡5min，用紗布過濾，得到心肌組織樣品，備用；每升所述保護液含有以下組分：8g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的Na2HPO4·H2O、0.06g的KH2PO4、0.35g的NaHCO3，溶劑為雙蒸水；每升沖洗液中含有以下組分：9g的NaCl、0.3g的KCl，溶劑為雙蒸水。步驟2，將心肌組織樣品置于1g/L的胰蛋白酶溶液中，37℃消化5min，棄去上清液，得到第一次沉淀物。步驟3，將第一次沉淀物置于高濃度緩沖液中浸泡3min，過濾，收集第二次上清液和第二次沉淀物；每升高濃度緩沖液中含有以下組分：8.5g的NaCl、0.25g的KCl，溶劑為雙蒸水。步驟4，將第二次沉淀物置于消化液中，然后用NaOH調節pH至7.5，37℃消化5min，過濾，收集第三次上清液和第三次沉淀物；步驟5，將第三次沉淀物置于低濃度緩沖液中浸泡3min，使心肌細胞分散于低濃度緩沖液中，得到細胞混合物；每升低濃度緩沖液中含有以下組分：6g的NaCl、0.2g的KCl，4mg的L-谷氨酸、4mg的甘氨酸、1g的葡萄糖，溶劑為雙蒸水。步驟6，將第二次上清液、第三次上清液和細胞混合物混合均勻，并用吸管吹打，加入胎牛血清，胎牛血清與所述細胞混合物的質量比例為5～10:100，靜置2min，然后過濾掉心肌組織沉淀物，收集慮液，并將收集的濾液經10000r/min，4℃，離心10min，得到分離后的心肌細胞沉淀。為了驗證本發明的方法可以減緩長時間的消化作用引起的心肌細胞變形缺陷，我們對實施例1的方法獲得的心肌細胞形態進行顯微觀察，結果如圖1所示，分離得到的心肌細胞呈邊緣規則的圓形或者桿狀，細胞形態良好。進一步的，我們分別對實施例1的方法、對照組1的方法、對照組2的方法分離得到的成年大鼠心肌細胞進行存活率進行測定。其中，對照組1的方法為：除將步驟5的低濃度緩沖液分別替換為步驟3中使用的高濃度緩沖液之外，其他操作步驟均同實施例1。對照組2的方法為：步驟(1)，將新鮮離體的心臟放入4℃預冷的保護液中，剪取心室肌組織，并用沖洗液洗凈，再用眼科剪將心室肌組織剪成1mm×1mm×1mm的小塊，用紗布過濾，得到心肌組織樣品，備用；每升所述保護液含有以下組分：8g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的Na2HPO4·H2O、0.06g的KH2PO4、0.35g的NaHCO3,溶劑為雙蒸水。步驟(2)，將心肌組織樣品置于1g/L的胰蛋白酶溶液中，37℃消化8min，棄去上清液，得到初始沉淀物。步驟(3)，將初始沉淀物置于1g/L的胰蛋白酶溶液中，37℃消化8min，并用吸管吹打，然后過濾掉心肌組織沉淀物，收集慮液，并將收集的濾液經10000r/min，4℃，離心10min，得到分離后的心肌細胞沉淀。實施例1的方法、對照組1的方法、對照組2的方法分離得到的成年大鼠心肌細胞存活率(采用常規方法測定心肌細胞存活率)如表1所示，結果表明實施例1的方法中，心肌細胞存活率最高，為89.3％，且細胞分離程度良好，說明長時間的消化作用對心肌細胞的存活率影響較低。對照組1的方法中，由于步驟3和步驟5均采用的是高濃度緩沖液，不存在鉀離子濃度的降低，缺少了對心肌細胞產生的刺激，故心肌細胞活性稍低。對照組2的方法中，既沒有鉀離子濃度的變化，也沒有調節溶液的pH，在心肌組織消化過程中，基本上沒有采用保護措施，細胞分離程度一般，細胞存活率最低，不利于后續傳代培養。表1不同處理方法的新生大鼠心肌細胞存活率實施例1對照組1對照組2百分比(％)89.375.658.0細胞分離程度良好良好一般能否傳代能能傳代細胞存活率不高細胞存活時間4天4天3天盡管已描述了本發明的優選實施例，但本領域內的技術人員一旦得知了基本創造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權利要求意欲解釋為包括優選實施例以及落入本發明范圍的所有變更和修改。顯然，本領域的技術人員可以對本發明進行各種改動和變型而不脫離本發明的精神和范圍。這樣，倘若本發明的這些修改和變型屬于本發明權利要求及其等同技術的范圍之內，則本發明也意圖包含這些改動和變型在內。當前第1頁1 2 3