1.一種Cas9表達載體,其特征在于序列如SEQ ID NO.11所示。
2.如權利要求1所述的一種Cas9表達載體,其特征在于由4.3kb的Cas9片段與5.1kb的pUC-EIN載體骨架連接得到,所述pUC-EIN載體的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如權利要求2所述的一種Cas9表達載體,其特征在于所述5.1kb的pUC-EIN載體骨架由BspT Ⅰ、BamH Ⅰ雙酶切pUC-EIN載體得到。
4.如權利要求2所述的一種Cas9表達載體,其特征在于所述4.3kb的Cas9片段由BspT Ⅰ、BamH Ⅰ雙酶切pUC-Cas9載體得到。
5.如權利要求4所述的一種Cas9表達載體,其特征在于所述pUC-Cas9載體由AgeⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ三酶切pX330載體得4.3kb、2.2kb及2.0kb片段,將4.3kb的片段插入到pUC-GZ載體中得到。
6.如權利要求5所述的一種Cas9表達載體,其特征在于所述pUC-GZ載體由pUC-mIKB載體經EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切得2.6kb的載體骨架和1.4kb片段,將2.6kb的載體骨架與47bp的GZ短片段連接所得。
7.如權利要求6所述的一種Cas9表達載體,其特征在于所述pUC-mIKB載體的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
8.如權利要求6所述的一種Cas9表達載體,其特征在于所述GZ短片段的制作過程如下:
a)人工合成2條DNA寡核苷酸GZF、GZR,序列如下:
GZF:5'AATTACTTAAGACCGGTGGTACCACTCGTCTCGAGGAATTCGGATCC 3'
GZR:5'AGCTGGATCCGAATTCCTCGAGACGAGTGGTACCACCGGTCTTAAGT 3'
b)將GZF、GZR分別按照10微摩爾/升的濃度稀釋,二者等量混合,取50微升置于薄壁PCR管中,按照下述程序孵育:
95℃ 5分鐘,72℃ 10分鐘,置冰上,GZ短片段制作完成。