本發明涉及一種應用可回收磁性納米固定酶水解秸稈的技術，屬于生物新材料應用領域。

背景技術：

作為農業大國，我國每年會產生7-9億噸各類秸稈，其中玉米、小麥與水稻三種作物的秸稈占80％左右。由于秸稈產量巨大，自2005年起，秸稈綜合處理項目成為國家重點支持項目，尤其是以秸稈為原料水解生產葡萄糖繼而發酵乙醇的產業。然而，秸稈中可以水解為葡萄糖的主要成分是纖維素，需要在纖維素酶的作用下才能水解成單體，而纖維素的使用成本相對較高，使得該技術的實際應用受到很大制約。根據實際測算，酶制劑在纖維素乙醇工業中的總成本占近三分之一，是產業發展的主要瓶頸。

在2015-04-08公開的申請號為201410637435.7的一種磁性固定化纖維二糖酶納米介孔材料及其制備方法。該材料通過對酶進行固定，實現了酶的多次利用，并通過磁性材料提高了回收的操作性。該發明通過實驗證實，固定化纖維二糖酶在實驗室中針對纖維二糖水解成葡萄糖的過程是有效的，可以通過磁鐵有效富集。但將這類材料用于實際秸稈的處理，目前尚無實踐數據，也沒有可以采納的方法。

技術實現要素：

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種應用可回收磁性納米固定酶水解秸稈的方法，確立秸稈的處理方式與水解條件，解決秸稈水解的實際問題，磁性固定化酶可以反復使用，活性得到保持，將這一生產技術的成本控制在合理空間下。

為實現上述目的，本發明技術方案為：

一種應用可回收磁性納米固定酶水解秸稈的方法，該方法實施步驟如下：步驟1：在預處理后的秸稈中加入濃度為0.1mol/L的緩沖溶液進行水解反應，產生固液比為1∶3-1∶20的固液混合物，該固液混合物的pH值為4-6；所述的緩沖溶液包括醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，或檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液；步驟2：在步驟1的固液混合物中加入纖維素酶，所述纖維素酶包括添加量為秸稈干重0.1-0.5％的纖維素酶，和活力在1-100IU/g的纖維素酶；步驟3：在40-60℃溫度中，進行24-72小時的水解反應，獲得最終水解反應溶液；步驟4：檢測最終水解反應溶液中的葡萄糖濃度；步驟5：最終水解反應溶液經過葡萄糖濃度測定后用于發酵乙醇。

上述技術方案的有益之處在于：

在本發明應用可回收磁性納米固定酶水解秸稈的方法是將秸稈在經過預處理之后，加入少量纖維素酶，在恒溫條件下進行水解。水解后，采用磁鐵回收固定酶，回收率在80-100％之間，可以達到10次以上仍保持一定活力，且得到酶的活力保持在75-100％之間。水解反應后的葡萄糖溶液經過測定后用于發酵乙醇。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本發明的一部分，本發明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中：

圖1是本發明磁性固定化酶的生產方法實施例所使用的設備示意圖；

圖2是本發明實施例一中回收酶的活力保持率的示意圖；

圖3是本發明實施例二中回收酶的活力保持率的示意圖；

圖4是本發明實施例三中回收酶的活力保持率的示意圖。

具體實施方式

為了使本發明所要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚、明白，以下結合附圖和實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

本發明公開的一種應用可回收磁性納米固定酶水解秸稈的方法，所述的秸稈包括但不僅限于玉米秸稈、小麥秸稈、水稻秸稈、紅薯秸稈、大豆秸稈等，該方法中涉及的秸稈是經過預處理的秸稈，預處理技術包括但不僅限于切割粉碎、水煮、蒸汽、球磨、爆破、微波等物理手段，并包括但不限于酸洗、堿洗、有機溶劑等各類化學手段，也包括酶解、真菌處理等生物手段，由此脫除其中有抑制作用的副產物，如多酚類物質。

本發明涉及的纖維素測定方法如下：

準確稱取1.0000～1.0500g試樣(G1)于潔凈的250mL磨口錐形瓶中，加入25mL 20％硝酸乙醇溶液，裝上回流冷凝管于沸水浴中加熱1h，在預先恒重的玻璃砂芯濾器中小心傾倒出上清液，真空抽濾，將濾渣小心移回原錐形瓶中，重復上述操作數次，直至纖維變白為止。最后將錐形瓶中全部內容物移入過濾器，抽真空過濾，用10mL 20％硝酸乙醇溶液洗滌殘渣，再用熱水洗滌至洗液用甲基橙試劑檢驗不呈酸性，最后用10mL乙醇分2次洗滌，濾渣于105℃烘干至恒重(G2)。纖維素含量公式：

所述的應用可回收磁性納米固定酶水解秸稈的方法，實施步驟如下：

步驟1：取切割粉碎、水煮、蒸汽、球磨、爆破、微波等物理手段后的玉米秸稈、小麥秸稈、水稻秸稈、紅薯秸稈、大豆秸稈等，。

步驟2：在預處理后的秸稈中加入濃度為0.1mol/L的緩沖溶液進行水解反應，產生固液比為1∶3-1∶20的固液混合物，該固液混合物的pH值為4-6；所述的緩沖溶液包括醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，或檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液；

步驟3：在步驟1的固液混合物中加入纖維素酶，所述纖維素酶包括添加量為秸稈干重0.1-0.5％的纖維素酶，和活力在1-100IU/g的纖維素酶的；

步驟4：在40-60℃溫度中，對固液混合物混合加熱、攪拌或震蕩進行24-72小時的水解反應，獲得最終水解反應溶液；其中的攪拌的速度為60-180轉/分，震蕩的頻率為25-150轉/分。所述的攪拌或震蕩形式包括且不限于攪拌槳、磁子、震蕩箱。水解反應中的反應器皿包括且不限于玻璃反應容器、塑料反應容器及金屬反應容器。

步驟5：檢測最終水解反應溶液中的葡萄糖濃度。。

步驟5：檢測最終水解反應溶液中采用酶活儀進行測定葡萄糖濃度。

步驟6：最終水解反應溶液經過測定后用于發酵乙醇。。

上述步驟2中所述的添加量為秸稈干重0.1-0.5％的纖維素酶為市售自由酶，所述的活力在1-100IU/g的纖維素酶為磁性固定化酶；請結合圖1所示。

該磁性固定化酶的生產方法，包括如下步驟：

步驟一：按質量份稱取下列組份：反應底物100份、模板溶液100份、四氧化三鐵粉末2份、纖維素酶20份；反應底物為正硅酸四乙酯和二甲基二硅氧烷，其中正硅酸四乙酯質量占比80％、二甲基二硅氧烷質量占比20％；模板溶液為葡萄糖溶液，葡萄糖質量百分比為30％；

步驟二：按步驟一中稱取的反應底物的物質量，并按以下摩爾比稱取鹽酸，反應底物與鹽酸的摩爾比為150∶1，所述的鹽酸濃度為0.17mol/L；

步驟三：將步驟一中稱取的反應底物置于儲罐1中，并通過泵11加入反應釜5中；

步驟四：通過冷水浴將反應底物冷卻至10℃；

步驟五：將步驟二中的鹽酸置于儲罐2中，并通過泵21向反應釜5中的反應底物滴加鹽酸并用攪拌器52攪拌直至得到的溶液變得澄清透明，控制反應溫度不超過30℃，攪拌速度為100轉/分鐘；

步驟六：將步驟一中稱取的模板溶液置于儲罐3中，并通過泵31向步驟五得到的溶液加入模板溶液，并用攪拌器52攪拌至混合均勻，攪拌速度為100轉/分鐘；

步驟七：通過真空泵6和冷卻器7對反應釜5中步驟6所得溶液進行減壓蒸餾直至不再產生揮發，以去除反應溶液中的副產物乙醇，得到溶膠；所述的減壓蒸餾壓力為0.005MPa，溫度為25℃，副產物乙醇冷卻回到到回收罐8中

步驟八：關停真空泵6和冷卻器7，將濃度為0.4mol/L的氫氧化鈉溶液加入儲罐4中，通過泵41向步驟7得到的溶膠滴加上述氫氧化鈉溶液并用攪拌器52攪拌，滴加速率為1L/min，并實時監測PH值，直至pH值達到3.5，通過加料口52向反應釜5加入步驟1中稱取的四氧化三鐵粉末和纖維素酶，繼續滴加氫氧化鈉溶液，直至pH值達到4.2，攪拌速度為100轉/分鐘；

步驟九：將步驟八得到的反應產物從反應釜5轉移至開口容器9中，冷卻至0℃并保持12小時，得到凝膠；

步驟十：將所述的凝膠采用粉碎機粉碎成粒度為0.2mm以下的顆粒，并進行干燥，采用鋁箔袋包裝干燥后的磁性固定化酶。

上述實施例中，在步驟一中，通過在反應底物中添加二甲基二硅氧烷調節最終產品的特點，使磁性固定化酶具有更好的韌性，避免在使用過程中易破碎的問題。在步驟四中通過冷水浴將反應底物溫度控制在10℃，有效避免了常溫下反應導致熱量聚集造成的生產危險，確保工業生產的可操作性。在步驟五中，通過滴加方式添加鹽酸，避免一次性加入導致反應過于劇烈，以便于更好地控制反應速率，提高反應安全性。在步驟七中通過減壓蒸餾去除反應副產物乙醇，避免了乙醇對纖維素酶的活力造成影響，同時也可避免后續的凝膠速率過慢。在步驟八中通過在中和過程中間加入四氧化三鐵和纖維素酶的方式，避免了在反應前期加入，由于粘度小、酸性高，四氧化三鐵和纖維素酶直接加入時容易發生團聚的問題，同時也避免到了在反應后期加入，由于體系粘度高，四氧化三鐵和纖維素酶不易分散的問題，從而根本上解決了包覆不均勻問題。在步驟九中采用酸性條件下進行凝膠，避免了中性條件下凝膠不易轉移的問題，并避免了中性條件下凝膠出現的凝膠不均勻的問題。在步驟十中，采用鋁箔袋包裝生產的磁性固定化酶，可避免酶失活，從而提高磁性固定化酶的存儲穩定性。由于本發明的實施例主要步驟均在反應釜中實現，因此本生產方法具有對設備要求不高、工藝簡便、可操作性高等優勢。上述步驟4水解反應后，可以采用磁鐵回收磁性固定化酶，留作下一次使用。采用的磁鐵為永磁鐵或電磁鐵，且所述的永磁鐵采用釹鐵硼磁鐵；將磁鐵放置于步驟4中的水解反應的設備中，攪拌最終水解反應溶液，即可通過磁鐵吸附回收出磁性固定化酶。所述的磁性固定化酶的的回收方法還可以采用磁場強度在0.2-0.4T之間的電磁鐵將最終水解反應溶液中的磁性固定化酶吸取之后，斷電即可回收。

磁鐵回收磁性固定化酶前，酶的活力需要先進行測定，一個IU是指一分鐘催化1微摩爾底物所需的酶量。具體測定方式為，采用1克濾紙作為底物，投入m克酶(自由酶或固定酶均可)，反應t分鐘后，有c克濾紙轉變為了葡萄糖，葡萄糖的摩爾質量為M克/摩爾(酶的活力公式)：

在得到一個IU代表的酶量后，根據底物的質量，計算所需的酶量。

作為進一步改進，本發明中的磁性固定化酶回收方法為磁性回收方法，采用的磁鐵為永磁鐵或電磁鐵。永磁鐵通常采用釹鐵硼磁鐵，放置于反應設備中攪拌，即可回收出磁性固定化酶。采用電磁鐵回收較永磁鐵更為便捷，磁場強度在0.2-0.4T之間，將固定化酶吸取之后，斷電即可回收。

回收后的磁性固定化酶，回收率在80-100％之間。磁性固定化酶回收率的計算方式：

將回收的酶按照同樣的反應條件，測定反應速率，得到酶的活力保持在75-100％之間。測定方法為，首次反應，反應周期內的纖維素轉化率為x1，回收之后，同樣反應周期內的纖維素轉化率為x2，則酶的活力保持率公式：

本實施例將固定化酶用磁鐵進行回收，并用于下一次反應，其他反應條件均不變。

本發明證實，磁性固定化酶用于秸稈水解，可以達到10次以上仍保持一定活力。

實施例一

取蒸汽爆破后的玉米秸稈100克，爆破溫度150℃，壓力15atm。經過測試，爆破后的秸稈烘干后，纖維素含量為41％。經過熱水洗滌后，纖維素含量上升至50％。

取干燥秸稈10克放入圓底燒瓶中，按照固液比1∶10加入100克醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，使pH保持在4.8。混合溶液加熱到50℃，采用磁子攪拌的形式進行反應，并按照100IU/g的比例，加入4g磁性固定化酶，另加入10μg市售自由酶，即添加比例為秸稈干重的0.1％。反應24小時后，測定出葡萄糖濃度為2，430mg/dL，折合葡萄糖的轉化率為44％。

將磁性固定化酶用磁鐵進行回收，并用于下一次反應，其他反應條件均不變。回收酶的活力保持率如下圖2所示。

實施例二

取少量水稻秸稈，采用球磨機進行研磨，研磨時間24小時。經過測試，秸稈的纖維素含量為32％，經過熱水洗滌后，纖維素含量上升至38％。

取干燥秸稈粉末3克，加入塑料離心管中，按固液比1∶3投入醋酸醋酸鈉緩沖溶液，將pH值調節到6，放入恒溫震蕩箱中，震蕩頻率為40轉/分，溫度控制在60℃，按照底物活力1IU/g的標準加入0.15克固定化酶，另加入15μg市售自由酶，即相當于秸稈干重的0.5％，反應72小時，測定出反應后葡萄糖濃度為3,310mg/dL，折合葡萄糖轉化率為26％。

將固定化酶用磁鐵進行回收，并用于下一次反應，其他反應條件均不變。回收酶的活力保持率如圖3所示。

實施例3

取小麥秸稈100克，加入0.4mol/L的氫氧化鈉溶液，煮沸1小時，將堿液濾去，處理后的秸稈經測定，纖維素含量為36％。

稱取秸稈10克加入不銹鋼罐中，按照固液比1∶20投入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，采用攪拌槳攪拌的形式進行反應，攪拌速率為100轉/分，pH值控制在4.0，開動攪拌，溫度控制在40℃，按照底物活力20IU/g的標準加入1g固定化酶，另加入20μg市售自由酶，即秸稈干重的0.2％，反應48小時，測定出反應后的葡萄糖濃度為550mg/dL，折合葡萄糖轉化率為30.6％。

將固定化酶用磁鐵進行回收，并用于下一次反應，其他反應條件均不變。回收酶的活力保持率如圖4所示。

上述說明示出并描述了本發明的優選實施例，如前所述，應當理解本發明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環境，并能夠在本文所述發明構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離本發明的精神和范圍，則都應在本發明所附權利要求的保護范圍內。