本發明涉及一種納米熒光微球的制備方法。

背景技術：

熒光微球，一般指直徑在納米級別到微米級別的帶有熒光光學性能的一種聚合物微球。其熒光性能來自于表面吸附或微球內部包埋的熒光物質，受外界能量激發而發出熒光。其熒光性能由熒光染料自身結構所決定，并受到外界因素的影響。在適當條件下可制備得到形態結構穩定，尺寸均勻，發光高效而穩定的熒光微球。相較于傳統熒光染料，熒光微球可具有良好的水溶性及生物相容性，這使其在生物醫學方面受到廣泛關注。

熒光微球的制備主要包括物理吸附，包埋，自組裝等方法。物理吸附法一般是將非水溶性的熒光染料分散在水溶性有機溶劑中，再將其與微球載體的水分散體系混合，由于熒光染料在水溶液中的分散性較差，便會析出吸附到微球表面或接枝到聚合物微球表面。包埋法是將熒光物質分散在含有聚合物單體的介質中，利用聚合反應制備聚合物微球的同時，將熒光物質包埋到聚合物微球內部，一般制備出的熒光微球具有明顯的核-殼結構。

近年來，熒光技術在高通量藥物篩選及醫學標記中受到廣泛研究與應用，極大的促進了對熒光微球研究的深入。在該方面，我國長期依賴進口，而一些自助研發的產品又存在諸多問題，例如成本過高，價格昂貴，無法大規模生產，質量不穩定等問題。因此能使聚合物熒光微球國產化，量產化，對我國生物醫學等各個領域的發展具有十分重大的意義。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是：基于上述問題，本發明提供一種納米熒光微球的制備方法。

本發明解決其技術問題所采用的一個技術方案是：一種納米熒光微球的制備方法，包括以下步驟：

a、熒光染料溶液的配置：將熒光染料溶于有機溶劑，通過稀釋獲得熒光染料溶液；

b、納米熒光微球的制備：將共聚單體、引發劑、交聯劑、分散劑、分散介質和熒光染料溶液加入反應容器中，攪拌分散均勻，反應，制得納米熒光微球溶液；

c、納米熒光微球溶液的透析：對納米熒光微球溶液進行透析處理，除去未反應的單體及雜質。

進一步地，步驟a中熒光染料溶液的配置過程具體為：熒光染料是使用Suzuki偶聯法制備的共軛聚合物染料：聚取代三苯胺-芴-苯并噻二唑，先用三氯甲烷作為溶劑溶解熒光染料配成質量比為3‰的溶液，再通過稀釋獲得質量百分比為0.005～0.006％的熒光染料溶液。

進一步地，步驟b中納米熒光微球的制備過程具體為：稱取共聚單體、交聯劑、分散劑、分散介質、熒光染料溶液，攪拌分散均勻，加熱至40℃，使用恒壓低液漏斗滴加引發劑反應，反應持續4～5小時，反應結束后升溫至70℃，除去三氯甲烷，冷卻至室溫。

進一步地，交聯劑的量為共聚單體質量的7～9％，分散劑的量為共聚單體質量的5～7％，分散介質的量為共聚單體質量的25～50ml/g，熒光染料溶液的量為共聚單體質量的7.5ml/g，引發劑的量為共聚單體質量的5％。

進一步地，共聚單體為N-異丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨，N-異丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨的質量比為1：3～3：1。

進一步地，交聯劑為N,N-亞甲基雙丙烯酰胺，引發劑為過硫酸銨，分散劑為十二烷基磺酸鈉，分散介質為蒸餾水。

進一步地，步驟c中熒光微球溶液的透析過程具體為：剪取經過處理的透析袋8～10cm，加入步驟b中得到的納米熒光微球溶液，兩端封口，放入裝有蒸餾水的燒杯中進行透析，定時更換蒸餾水，3～4天后取出，裝入離心管待用。

本發明的有益效果是：N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨(DMC)都具有良好的水溶性，使用其制備的聚合物微球也具有良好的水溶性。同時，NIPAM作為一種溫敏性材料，在合成微球的材料中加入NIPAM，也可以為產物帶來一定的溫敏性能。實驗研究了溫度的不斷變化對熒光微球熒光性能的影響。NIPAM和DMC都是生物親和性的試劑，使用這兩種單體共聚包埋熒光染料制備的熒光微球具有良好的生物相容性，可以與細胞共同生長而不影響細胞活性，可以很好的應用于生物體內細胞標記、示蹤，免疫分析，基因研究等。

附圖說明

下面結合附圖對本發明進一步說明。

圖1是熒光納米微球的紅外及紫外吸收圖，其中，A為共聚單體、熒光染料、實施例1制備的熒光微球的紅外譜圖，B為熒光染料、實施例2、3制備的熒光微球的紫外吸收圖；

圖2是溫度的變化對微球熒光性能的影響圖，其中，溫度依次為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、55℃。

具體實施方式

現在結合具體實施例對本發明作進一步說明，以下實施例旨在說明本發明而不是對本發明的進一步限定。

實施例1

稱取0.1g NIPAM、0.3g DMC、0.02g十二烷基磺酸鈉(SDS)(5％)、0.028g N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)(7％)，加入三口燒瓶中，加入15ml蒸餾水，加入3ml濃度為0.005％的熒光染料溶液，攪拌使其分散均勻。升高溫度至40℃，將0.02g過硫酸銨溶于4～5ml蒸餾水中，使用恒壓低液漏斗緩慢滴加進三口燒瓶中并引發反應，反應持續4～5小時，反應結束后升溫至70℃，除去三氯甲烷，冷卻至室溫。

剪取8～10cm經過處理的透析袋，加入通過上述步驟得到熒光微球的溶液，兩端封口。放入裝有蒸餾水的燒杯中進行透析，定時更換蒸餾水，3～4天后取出，裝入離心管待用。

實施例2

稱取0.2g NIPAM、0.2g DMC、0.02g SDS(5％)、0.028g MBA(7％)，加入三口燒瓶中，加入15ml蒸餾水，加入3ml濃度為0.005％的熒光染料溶液，攪拌使其分散均勻。升高溫度至40℃，將0.02g過硫酸銨溶于4～5ml蒸餾水中，使用恒壓低液漏斗緩慢滴加進三口燒瓶中并引發反應，反應持續4～5小時，反應結束后升溫至70℃，除去三氯甲烷，冷卻至室溫。

剪取8～10cm經過處理的透析袋，加入通過上述步驟得到熒光微球的溶液，兩端封口。放入裝有蒸餾水的燒杯中進行透析，定時更換蒸餾水，3～4天后取出，裝入離心管待用。

實施例3

稱取0.3g NIPAM、0.1g DMC、0.02g SDS(5％)、0.028g MBA(7％)，加入三口燒瓶中，加入15ml蒸餾水，加入3ml濃度為0.005％的熒光染料溶液，攪拌使其分散均勻。升高溫度至40℃，將0.02g過硫酸銨溶于4～5ml蒸餾水中，使用恒壓低液漏斗緩慢滴加進三口燒瓶中并引發反應，反應持續4～5小時，反應結束后升溫至70℃，除去三氯甲烷，冷卻至室溫。

剪取8～10cm經過處理的透析袋，加入通過上述步驟得到熒光微球的溶液，兩端封口。放入裝有蒸餾水的燒杯中進行透析，定時更換蒸餾水，3～4天后取出，裝入離心管待用。

實施例4

稱取0.3g NIPAM、0.1g DMC、0.024g SDS(6％)、0.028g MBA(7％)，加入三口燒瓶中，加入15ml蒸餾水，加入3ml濃度為0.005％的熒光染料溶液，攪拌使其分散均勻。升高溫度至40℃，將0.02g過硫酸銨溶于4～5ml蒸餾水中，使用恒壓低液漏斗緩慢滴加進三口燒瓶中并引發反應，反應持續4～5小時，反應結束后升溫至70℃，除去三氯甲烷，冷卻至室溫。

剪取8～10cm經過處理的透析袋，加入通過上述步驟得到熒光微球的溶液，兩端封口。放入裝有蒸餾水的燒杯中進行透析，定時更換蒸餾水，3～4天后取出，裝入離心管待用。

實施例5

稱取0.3g NIPAM、0.1g DMC、0.02g SDS(5％)、0.032g MBA(8％)，加入三口燒瓶中，加入15ml蒸餾水，加入3ml濃度為0.005％的熒光染料溶液，攪拌使其分散均勻。升高溫度至40℃，將0.02g過硫酸銨溶于4～5ml蒸餾水中，使用恒壓低液漏斗緩慢滴加進三口燒瓶中并引發反應，反應持續4～5小時，反應結束后升溫至70℃，除去三氯甲烷，冷卻至室溫。

剪取8～10cm經過處理的透析袋，加入通過上述步驟得到熒光微球的溶液，兩端封口。放入裝有蒸餾水的燒杯中進行透析，定時更換蒸餾水，3～4天后取出，裝入離心管待用。

對制備得到的熒光微球，我們進行了FT-IR、UV-vis、粒徑、以及熒光性能等方面的分析。

1.由圖1A可得，圖中3436cm^-1有特征峰，是N-H伸縮振動吸收峰，在1666cm^-1為羰基伸縮振動吸收峰，由此說明有酰胺基團存在，證明所合成的熒光納米微球中包含NIPAM。2968cm^-1處的特征峰是C-H伸縮振動吸收峰，碳氮(C-N)伸縮振動吸收峰出現在1259cm^-1，證明微球中包含DMC。相同的，熒光染料的一些特征吸收峰，在熒光納米微球的紅外圖上也有所表現。從圖1B中可以看出，單純的熒光染料的最大吸收出現在430nm左右，而使用兩種單體的共聚物包埋形成微球后，最大吸收發生了一定程度的紅移，出現在475nm，可見，聚合物的包埋對染料的熒光性能產生了影響。

2.通過改變交聯劑、分散劑以及固含量的大小，我們得到了不同粒徑分布的熒光微球，具體數據如表1。

表1納米熒光微球的粒徑分布

從表中可以看出，隨著分散劑用量的增加，得到的微球的粒徑明顯變小。當減少交聯劑的用量時，微球的粒徑也明顯的減小。最后結果顯示，使用5％SDS，8％MBA以及20ml的去離子水，可以獲得100nm左右尺寸較為理想的的熒光微球。

3.我們研究了溫度的變化對微球熒光性能的影響。分別測試了微球在25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，55℃下的熒光強度。具體實驗數據如圖2。圖2A、2B分別是E1G3、E3G1(E：NIPAM，G：DMC；1、3：質量比)；兩種單體配比的納米熒光微球的熒光強度隨溫度的變化。圖2C是單純的熒光染料的熒光強度隨溫度變化圖。由圖2A、2B可見，溫度對微球的熒光性能有影響。溫度升高，熒光強度減弱。對比圖2C圖，溫度升高，單純染料的熒光強度也減弱，但其減弱程度明顯低于熒光微球。可見，單純染料的熒光強度隨溫度變化不大，而使用聚合物包埋染料后，微球熒光性能具有明顯的溫敏性。從圖2同樣可以看出，包埋后，發射波長均為575nm，包埋前后，發射波長基本無偏移。

4.熒光微球的組成成分對微球的熒光性能也有影響，隨著NIPAM的用量增加，微球的熒光強度也隨著增強。E1G3在25℃時熒光強度只有6.5，而E3G1卻達到了79，甚至于高過了單純的熒光染料在相同溫度下的熒光強度。可見，在一定含量范圍內，NIPAM的含量對微球的熒光強度有一定的增強作用。同樣，熒光染料濃度對熒光微球的熒光強度也有影響，當熒光染料的濃度在一定范圍內時，熒光微球的熒光強度隨熒光染料濃度的增加而增強。

以上述依據本發明的理想實施例為啟示，通過上述的說明內容，相關工作人員完全可以在不偏離本項發明技術思想的范圍內，進行多樣的變更以及修改。本項發明的技術性范圍并不局限于說明書上的內容，必須要根據權利要求范圍來確定其技術性范圍。