本發(fā)明提供了一種敲除arcA基因提高克雷伯氏菌1,3-丙二醇產(chǎn)量的方法，屬于代謝工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1,3-丙二醇(簡稱PDO)是一種重要的化工原料，其主要用途是作為聚酯和聚氨酯材料合成的單體。目前，1,3-丙二醇的生產(chǎn)方法主要是化學(xué)合成法。由于化學(xué)合成法具有高污染、高能耗、高成本等缺點，人們將目光轉(zhuǎn)移到具有綠色生產(chǎn)優(yōu)勢的生物法上。其中，克雷伯氏菌(Klebsiella)在微氧條件下發(fā)酵甘油合成PDO具有較高的底物轉(zhuǎn)化率、開發(fā)價值及應(yīng)用前景等優(yōu)勢。但細胞內(nèi)的還原力供給一直是限制1,3-丙二醇生產(chǎn)的主要瓶頸。

在微生物細胞中，TCA循環(huán)是胞內(nèi)還原力的重要來源，但低溶氧條件會限制TCA循環(huán)活性，影響胞內(nèi)還原力的再生。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌中雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)arcA-arcB能夠感知外界氧含量變化并激活或抑制下游諸多酶的合成。當(dāng)細胞從有氧環(huán)境轉(zhuǎn)移到微氧環(huán)境下，arcB被磷酸化激活，其上磷酸基轉(zhuǎn)移傳遞至arcA使其激活，進而抑制TCA循環(huán)活性。Klebsiella中也存在類似的arcA-arcB信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)細胞在不同溶氧條件下的生理代謝。基于此，本研究通過敲除Klebsiella雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)arcA-arcB中arcA基因，提高微氧條件下TCA循環(huán)活性，強化胞內(nèi)還原力再生，從而提高1,3-丙二醇產(chǎn)量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是通過敲除arcA基因強化TCA循環(huán)，進而提高胞內(nèi)氧化還原水平，有利于微氧條件下產(chǎn)物1,3-丙二醇的合成。發(fā)明內(nèi)容簡單易操作，可廣泛應(yīng)用Klebsiella屬各種菌株，以下以肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)為例

具體工藝步驟包括工藝1、2、3：

工藝1：利用Red重組系統(tǒng)敲除控制微氧條件下TCA循環(huán)通量的arcA基因。

A以pKD13質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物構(gòu)建出需敲除基因的打靶片段。

B將A中所克隆出的打靶片段電轉(zhuǎn)入K.pneumoniae(含氯霉素抗性的pKD46質(zhì)粒)感受態(tài)中，并涂布卡那霉素抗性平板，PCR驗證篩選出陽性克隆。

C消除所得陽性克隆中pKD46質(zhì)粒，然后電轉(zhuǎn)入pCP20質(zhì)粒，以消除菌株卡那霉素抗性標(biāo)記，并通過PCR驗證突變株，此菌株即為arcA基因缺失的K.pneumoniae。

D高溫條件下，通過連續(xù)傳代消除arcA缺失株中的pCP20質(zhì)粒。

工藝2：利用qRT-PCR分析arcA基因敲除后TCA循環(huán)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，包括以下步驟：

A提取K.pneumoniae及K.pneumoniaeΔarcA總RNA。

B去除總RNA中的基因組DNA。

C以總RNA作模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

D內(nèi)參基因選用K.pneumoniae的16S rRNA基因，根據(jù)NCBI公布的16S rRNA、icd、gltA、sucC、sdhC的基因序列設(shè)計引物并合成。

E利用qRT-PCR擴增，分析基因轉(zhuǎn)錄水平變化。

工藝3：重組菌在微氧條件下代謝甘油合成1,3-丙二醇。

A種子液培養(yǎng)：挑取單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基，37℃、100r·min^-1培養(yǎng)16h。按0.5％(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接到50mL的液體LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD₆₀₀＝3。

B搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：按4％(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃，100r·min^-1培養(yǎng)72h。

本發(fā)明的有益效果：

現(xiàn)有技術(shù)主要涉及副產(chǎn)物途徑基因的敲除，使碳流轉(zhuǎn)向1,3-丙二醇的合成。而本專利改造的特殊性在于，解除TCA循環(huán)在微氧環(huán)境下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，強化了1,3-丙二醇的積累，此前文獻中未有報道在Klebsiella中敲除arcA基因提高1,3-丙二醇的產(chǎn)量。

實施例發(fā)酵結(jié)果表明，構(gòu)建的K.pneumoniaeΔarcA具有更高的1,3-丙二醇合成能力，產(chǎn)量提高12.57％。

附圖說明

圖1 arcA基因敲除突變株菌落PCR示意圖。

圖2 arcA突變株中TCA循環(huán)關(guān)鍵酶基因icd、gltA、sucC、sdhC轉(zhuǎn)錄水平與野生菌相比的變化。

圖3野生菌及突變株的生物量變化示意圖。

圖4野生菌及突變株的代謝產(chǎn)物變化示意圖。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明進一步說明。

實例1 本實施例說明利用Red重組技術(shù)敲除K.pneumoniae中arcA基因的方法

1 K.pneumoniae接種于液體LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.6，制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)。

2 將含有氯霉素抗性的pKD46質(zhì)粒導(dǎo)入K.pneumoniae感受態(tài)，30℃培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接至液體LB培養(yǎng)基(含氯霉素30μg·L^-1)，30℃培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.25，加入30mM阿拉伯糖，37℃下誘導(dǎo)pKD46質(zhì)粒表達Exo、Bet和Gam三個蛋白，再次制備K.pneumonia(pKD46)感受態(tài)。

3 以卡那霉素抗性的pKD13質(zhì)粒作模板，設(shè)計兩端帶有arcA同源片段的擴增引物，擴增獲得線性DNA片段。引物序列如下：

上游引物序列為：

GGACTTTGGTACTTCCTGTTTCGATTTAGTTGGCAATTTAGGTAGCAAACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC

下游引物序列為：

ACGGCGCCCTGAGGCGCCGTTTTCACATCATGGCTGCGGAATAAAACGCACTGTCAAACATGAGAATTAA

以pKD13作模板進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃變性5min，經(jīng)94℃30s，52℃30s，72℃1.5min，30個循環(huán)，再經(jīng)過72℃延伸10min，降溫至20℃，加入適量核酸內(nèi)切酶Dpn I(購自Takara)去除模板，獲得arcA基因敲除盒。

4 電轉(zhuǎn)化線性DNA片段(含有卡那霉素抗性基因)至K.pneumoniae感受態(tài)(含有pKD46質(zhì)粒)，并涂布于含有卡那霉素的LB平板篩選陽性重組子，并進行PCR鑒定，獲得陽性克隆。

5 以上述陽性克隆制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)，導(dǎo)入能夠誘導(dǎo)表達FLP重組酶(FLP是一個單體蛋白，在質(zhì)粒pCP20中高溫誘導(dǎo)表達，該蛋白表達后，可以消除由質(zhì)粒pKD13引入的外源基因)的質(zhì)粒pCP20，42℃下誘導(dǎo)表達FLP重組酶，消除上述引入的卡那霉素抗性基因。

6 以K.pneumoniae及K.pneumoniaeΔarcA基因組作為模板PCR驗證，結(jié)果見說明書附圖中圖1所示，泳道1所示PCR條帶在1100bp左右，泳道2所示條帶在600bp左右，與理論條帶一致，表明arcA缺失株構(gòu)建成功。

實例2 arcA基因敲除后微氧條件下TCA循環(huán)關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平變化。

1 K.pneumoniae總RNA的提取

(1)將收集的新鮮菌體立即在液氮中研磨。

(2)加入1mL TRIzon，使菌體充分裂解，室溫放置5min，分離蛋白核酸復(fù)合物。

(3)向上步驟溶液中加入0.2mL氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15s，室溫放置3min。

(4)4℃，12000r·min^-1離心15min，將上層水相轉(zhuǎn)移到新的無RNase的離心管中。

(5)加入等體積異丙醇，吹打均勻，室溫放置10min。

(6)4℃，12000r·min^-1離心10min，棄除上清。

(7)加入1mL無RNase的75％乙醇洗滌沉淀。

(8)4℃，12000r·min^-1離心3min，棄除上清。

(9)室溫放置至乙醇揮發(fā)完全，加入30μL無RNase水溶解，于-70℃保存。

2 引物的設(shè)計與合成

內(nèi)參基因選用K.pneumonia(GenBank Accession No.NC_011283)的16S rRNA基因，根據(jù)NCBI公布的16S rRNA、icd、gltA、sucC、sdhC基因序列設(shè)計引物，引物序列見表1：

表1研究中所用的引物

3 去基因組DNA

(1)反應(yīng)體系

將無RNase的PCR管置于冰上，加入以下反應(yīng)物：

(2)42℃反應(yīng)2min。

4 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

(1)將上步已除基因組DNA反應(yīng)液的PCR管置于冰上，加入如下反應(yīng)試劑：

(2)混勻，短暫離心。

(3)42℃反應(yīng)15min，85℃反應(yīng)5min。

5 熒光定量PCR擴增使用程序

6 定量PCR結(jié)果見說明書附圖2所示，K.pneumoniaeΔarcA在微氧條件下TCA循環(huán)基因icd、gltA、sucC、sdhC轉(zhuǎn)錄水平較K.pneumoniae分別提高5.97、14.72、183.55、11.63倍。表明敲除arcA基因能夠顯著提高微氧下K.pneumoniae的TCA循環(huán)活性。

實例3、利用構(gòu)建的K.pneumoniaeΔarcA發(fā)酵產(chǎn)1,3-丙二醇。

1 配制種子培養(yǎng)基：酵母粉10g·L^-1，蛋白胨5g·L^-1，氯化鈉10g·L^-1，余量為水；發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油40g·L^-1，酵母粉6g·L^-1，葡萄糖2g·L^-1，KH₂PO₄7.5g·L^-1，MgSO₄ 2g·L^-1，(NH₄)₂SO₄ 2g·L^-1，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.005g·L^-1，VB₁₂ 0.015g·L^-1，微量元素溶液(MnCl₂·4H₂O 0.1g·L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O 0.035g·L^-1，CoCl₂·6H₂O 0.2g·L^-1，ZnCl₂ 0.07g·L^-1，CuCl₂ 0.02g·L^-1，NiCl₂·6H₂O 0.025g·L^-1，H₃BO₃ 0.06g·L^-1)100μL·L^-1，余量為水，KOH調(diào)節(jié)pH至8.5左右。

2 將K.pneumonia與上述所得突變株接種于液體LB培養(yǎng)基，37℃，100r·min^-1振蕩培養(yǎng)16h，按0.5％(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接種子培養(yǎng)基，37℃，100r·min^-1培養(yǎng)到OD₆₀₀＝3，將種子液按4％接種量轉(zhuǎn)接50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃、100r·min^-1培養(yǎng)72h，發(fā)酵結(jié)束。

3 發(fā)酵液中1,3-丙二醇及副產(chǎn)物的含量采用高效液相色譜(HPLC)進行檢測。儀器：Agilent高效液相色譜儀(配紫外可見檢測器、示差檢測器和工作站)；色譜柱：Bio-RAD Aminex HPX-87H column 300mm×7.8mm；流動相：5mmol·L^-1硫酸；流速：0.6mL·min^-1，柱溫：60℃，紫外檢測器(210nm)，進樣10μL。結(jié)果見表2：

表2 K.pneumoniae及K.pneumoniaeΔarcA發(fā)酵72h產(chǎn)物

由表可知，K.pneumoniaeΔarcA發(fā)酵甘油合成1,3-丙二醇的產(chǎn)量提高12.57％，達到17.64g·L^-1。表明敲除參與K.pneumoniae細胞TCA循環(huán)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的arcA基因能夠有效促進微氧條件下1,3-丙二醇積累。

本發(fā)明內(nèi)容簡單易操作，可廣泛應(yīng)用Klebsiella屬各種菌株的改造以提高1,3-丙二醇產(chǎn)量。

以上所述內(nèi)容僅為本發(fā)明構(gòu)思下的基本說明，而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所作的任何等效變換均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護范圍。