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一種嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法與流程

文檔序號:11144873閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法,其特征在于,該方法包括如下步驟:

1)菌種采集

a.從油田含油土壤中采集土壤樣品于無菌袋中,4℃冰箱密封保存;

b.將上述土壤樣品于選擇性的含蒽、芘的無機鹽培養基的錐形瓶中進行搖床培養,經五代(蒽、芘的初始質量濃度從5g·L-1逐步提升至10g·L-1)培養后,取適量培養液稀釋并涂布于選擇性固體平板;待有明顯菌落出現時,從中選擇形態特征相異的各種菌落作進一步的劃線純化工作,5個周期后得到純菌株;將所得各菌制備成菌懸液并重新接至選擇性的含蒽、芘無機鹽培養基進行復篩,選取降解率較高的菌株作為優勢菌株,進一步接種營養肉湯培養基進行富集培養24h后,保存于營養瓊脂斜面上,4℃冰箱保存備用;

c.將0.5mL菌懸液與0.5mL保護劑等體積加入5mL的安培瓶中振蕩均勻后,置于-80℃下迅速冷凍6h后,用凍干機進行真空冷凍干燥,凍干后直接在凍干艙中壓蓋密封;

2)菌種復活

取上述凍干菌種,用75%的酒精棉消毒菌種接種管外壁后,用砂輪在安瓿瓶上三分之一處劃痕,用干燥的無菌紗布包裹安瓿瓶,將安瓿瓶掰開;用吸管將營養肉湯培養基0.3mL注入被開啟的菌種安瓿瓶中并振蕩,使安瓿瓶中的凍干菌種溶解成菌懸液;

將安瓿瓶中菌懸液吸出,接種到營養瓊脂斜面上,接種3管斜面,將接種后的營養瓊脂斜面置于培養箱中進行培養,觀察菌苔生長情況,后加入甘油保存備用;

3)菌種擴大

稱取營養肉湯培養基,加入蒸餾水,121℃下滅菌15min,后接種2接種環,37℃培養24h備用;

4)蒽、芘降解試驗

a.分別稱取0.5g蒽、芘于兩個反應瓶中,然后加入活性炭,加入10.0mL環己烷溶液溶解振蕩,并常溫揮發,待揮發完后,加入菌種擴大懸液,塞上瓶塞,分多組試驗在一定溫度下恒溫震蕩培養,之后測定其脫氫酶活性;

b.分別稱取0.5g蒽、芘于兩個反應瓶中,然后加入活性炭,分多組試驗加入一定體積的2mol/L的NaCl溶液,并加入10.0mL環己烷溶液溶解振蕩,常溫揮發,待環己烷溶液揮發完后,加入菌種擴大懸液,塞上瓶塞,35℃溫度恒溫震蕩培養7天,之后測定其脫氫酶活性;

c.分多組稱取一定質量的蒽、芘,然后加入活性炭,并加入10.0mL環己烷溶液溶解振蕩,并常溫揮發,待環己烷溶液揮發完后,加入菌種擴大懸液,塞上瓶塞,35℃溫度恒溫震蕩培養7天,之后測定其脫氫酶活性。

2.如權利要求1所述的嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法,其特征在于,所述步驟1)a中采集土壤樣品為距離地面深10cm,選取五個點均勻采樣,每個點的樣品采集范圍為1m2,每個點采集土壤為100g,采集后將五個采集點的土壤混勻,按照四分法將混合土壤逐漸的減少,留取250g的混合土壤樣品于無菌袋中。

3.如權利要求1所述的嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法,其特征在于,所述步驟1)b中所述無機鹽培養基:NH4NO3 2g/L,K2HPO4 1.5g/L,KH2PO4 3g/L,MgSO4·7H2O 0.1g/L,FeSO4·7H2O 0.2g/L,CuSO4 0.1g/L,無水CaC12 0.01g/L,Na2EDTA·2H2O 0.01g/L;無機鹽固體培養基中加入2%瓊脂;

所述含蒽、芘無機鹽培養基:分別用正己烷配制5g/L的蒽、芘溶液,濾膜過濾除菌,取一定量該溶液置于滅菌的錐形瓶中,待正己烷溶液揮發完畢后加入滅菌的無機鹽培養基;

所述富集培養:營養肉湯培養基(g/l):蛋白胨10.0,牛肉浸出粉5.0,氯化鈉5.0,pH:7.3±0.1;

所述保藏培養:營養瓊脂培養基(g/l):蛋白胨10.0,牛肉浸出粉5.0,氯化鈉5.0,瓊脂12.0,pH:7.3±0.1。

4.如權利要求1所述的嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法,其特征在于,所述步驟1)c中所述菌懸液是將嗜堿性假單胞桿菌接入富集培養基中37℃振蕩培養1天后的培養液;所述保護劑為無菌1.5%NaCl溶液、115℃滅菌30min后的明膠和糖溶液、煮沸滅菌的脫脂乳、經0.22μm濾膜過濾后的維生素C溶液。

5.如權利要求1所述的嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法,其特征在于,所述步驟1)c中所述冷凍干燥過程分為兩步,第一步冷凍干燥程序真空度為0.100mbar,凍干18h;第二步冷凍干燥程序真空度為0.034mbar,凍干2h。

6.如權利要求1所述的嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法,其特征在于,所述步驟2)中接種后的營養瓊脂斜面于培養箱中的培養溫度為37℃,培養時間為72小時。

7.如權利要求1所述的嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法,其特征在于,所述步驟4)a、b、c中加入活性炭的質量均為5.0g,加入菌種擴大懸液的體積均為5.0mL。

8.如權利要求1所述的嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法,其特征在于,所述步驟4)a中多組試驗恒溫震蕩的溫度分別為25℃、30℃、35℃、40℃,培養時間為7天。

9.如權利要求1所述的嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法,其特征在于,所述步驟4)b中多組試驗加入NaCl溶液的體積分別為200μL、250μL、300μL、350μL、400μL。

10.如權利要求1所述的嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法,其特征在于,所述步驟4)c中稱取蒽、芘的質量分別為0.3g、0.5g、0.7g、1.0g。

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