本發明涉及一種高大環柄菇原生質體的制備方法。

背景技術：

高大環柄菇，又名高腳環柄菇、大環柄菇、高腳小傘，隸屬真菌門擔子菌亞門層菌綱傘菌目蘑菇科大環柄菇屬，是亞熱帶地區的一種大型腐生食用菌，在江西省有分布。其菌體大型，食味佳，含有蛋白質、氨基酸、維生素、礦物質等多種營養成分，尤以人體必需的8種氨基酸含量高而著稱，具有巨大的開發利用價值。東華理工大學食用菌研究中心馴化的高大環柄菇為出發菌株，對其原生質體的制備條件進行探索，以獲得其原生質體制備的最佳條件，為高大環柄菇優良新品種的細胞融合選育、誘變選育和高大環柄菇優良新品種細胞工程菌株的建構奠定基礎，從而促進高大環柄菇的大規模工廠化生產。

技術實現要素：

本發明提出一種高大環柄菇原生質體的制備方法。

一種高大環柄菇原生質體的制備方法，其特征在于包括以下步驟:

（1）稱量黃豆12．5g，在水中浸泡10-15h后用豆漿機將其磨成豆漿，過濾后加入葡萄糖20．0g，調節總容積為10130mL(pH自然)，混合均勻，分裝滅菌以備用；

（2）將固體斜面培養好的高大環柄菇菌種接種于已滅菌豆漿培養基中，在25-30℃，150-200r/min下搖床培養；

（3）待菌絲體長出來以后，取培養一定時間的菌絲培養液5mL于無菌離心管中，用滅菌的滲透壓穩滲荊洗滌，在800r/min離心，棄去上清液收集菌體，再加入1mL相應的酶解液，置一定溫度下恒溫培養，隔時搖動，并用無菌吸管猛吸多次，促使原生質體從殘余菌絲上釋放，間隔一定時間取樣在10x40倍的光學顯微鏡下用血球計數板計算原生質體產出量；

（4）在3000-3500r/min離心10min棄去酶液上清液，用滲透壓穩滲洗滌2次即獲得純化原生質體。

優選地，所述步驟（2）培養環境為28℃，180r/min。

優選地，所述步驟（4）在3200r/min離心。

本發明所述方法制備的高大環柄菇原生質體，原生質體產出量高，可充分發揮酶的效力，本發明工藝簡單，使用實用性強，可工業化生產。

具體實施方式

實施例1。

一種高大環柄菇原生質體的制備方法，其特征在于包括以下步驟:

（5）稱量黃豆12．5g，在水中浸泡10-15h后用豆漿機將其磨成豆漿，過濾后加入葡萄糖20．0g，調節總容積為10130mL(pH自然)，混合均勻，分裝滅菌以備用；

（6）將固體斜面培養好的高大環柄菇菌種接種于已滅菌豆漿培養基中，在25-30℃，150-200r/min下搖床培養；

（7）待菌絲體長出來以后，取培養一定時間的菌絲培養液5mL于無菌離心管中，用滅菌的滲透壓穩滲荊洗滌，在800r/min離心，棄去上清液收集菌體，再加入1mL相應的酶解液，置一定溫度下恒溫培養，隔時搖動，并用無菌吸管猛吸多次，促使原生質體從殘余菌絲上釋放，間隔一定時間取樣在10x40倍的光學顯微鏡下用血球計數板計算原生質體產出量；

（8）在3000-3500r/min離心10min棄去酶液上清液，用滲透壓穩滲洗滌2次即獲得純化原生質體。

優選地，所述步驟（2）培養環境為28℃，180r/min。

實施例2。

一種高大環柄菇原生質體的制備方法，其特征在于包括以下步驟:

（9）稱量黃豆12．5g，在水中浸泡10-15h后用豆漿機將其磨成豆漿，過濾后加入葡萄糖20．0g，調節總容積為10130mL(pH自然)，混合均勻，分裝滅菌以備用；

（10）將固體斜面培養好的高大環柄菇菌種接種于已滅菌豆漿培養基中，在25-30℃，150-200r/min下搖床培養；

（11）待菌絲體長出來以后，取培養一定時間的菌絲培養液5mL于無菌離心管中，用滅菌的滲透壓穩滲荊洗滌，在800r/min離心，棄去上清液收集菌體，再加入1mL相應的酶解液，置一定溫度下恒溫培養，隔時搖動，并用無菌吸管猛吸多次，促使原生質體從殘余菌絲上釋放，間隔一定時間取樣在10x40倍的光學顯微鏡下用血球計數板計算原生質體產出量；

（12）在3000-3500r/min離心10min棄去酶液上清液，用滲透壓穩滲洗滌2次即獲得純化原生質體；

（13）所述步驟（2）培養環境為28℃，180r/min；

所述步驟（4）在3200r/min離心。