本發明涉及一種何首烏葉原生質體的制備方法。
背景技術：
何首烏為雙子葉蓼科多年生草本植物，分布在我國廣東、四川、湖南等省區，生長于灌木叢中、山腳陰處或石隙中。莖纏繞，基部中空，多分枝，基部木質化。葉心形，兩面光滑，有膜質短筒狀的托葉鞘，圓錐狀花序。瘦果橢圓形，光滑，黑色。塊莖供藥用，有滋補強壯作用，莖藤可治失眠癥。野生何首烏的塊莖生長緩慢，不能滿足人類對藥物的開發利用。
植物原生質體培育和融合是植物育種的重要技術之一。目前分離原生質體的方法有機械法和酶法，常用的方法是酶法。筆者用機械法制備何首烏葉片的原生質體，用PEG結合高pH誘導融合法來融合其原生質體，以期為何首烏多倍體植株的培育奠定基礎。
技術實現要素：
本發明提出一種何首烏葉原生質體的制備方法。
本發明所述方法制備的何首烏葉原生質體，活性強，融合效率高，可工業化生產，實用性強。
具體實施方式
實施例1。
一種何首烏葉原生質體的制備方法，包括以下步驟：
（1）何首烏葉片經過質壁分離后切成0．5厘米寬的長條，轉入到25％蔗糖溶液中放置8min，在35℃水浴鍋中處理何首烏葉片30win，過濾后得到原生質體溶液；
（2）原生質體經過27％蔗糖溶液洗滌一次，再用13％甘露醇CPW溶液懸浮；
（3）懸浮液原生質體可用牛氏記數板記數和細胞融合；
（4）原生質體得率=記數室大方格原生質體的平均個數×104個(Fw)；
（5）經過質壁分離法獲得的原生質體溶液，l500r／rain下離心8win，沉淀用少量13％甘露醇CPW溶液懸浮，為原生質體溶液；
（6）用吸管取原生質體懸浮液滴兩滴在載玻片上，靜置幾分鐘，使原生質體在載玻片上產生一薄層；
（7）取PEG融合液兩滴，緩慢滴加到載玻片上的原生質體溶液中，再靜置一定時間，觀察載玻片原生質體問的粘連；
（8）每隔5min，用吸管向原生質體液中滴兩滴高Ca2+高pH溶液，共3次；
（9）蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去多余的溶液即成臨時裝片后即可。
實施例2。
一種何首烏葉原生質體的制備方法，包括以下步驟：
（1）何首烏葉片經過質壁分離后切成0．5厘米寬的長條，轉入到25％蔗糖溶液中放置8min，在35℃水浴鍋中處理何首烏葉片30win，過濾后得到原生質體溶液；
（2）原生質體經過27％蔗糖溶液洗滌一次，再用13％甘露醇CPW溶液懸浮；
（3）懸浮液原生質體可用牛氏記數板記數和細胞融合；
（4）原生質體得率=記數室大方格原生質體的平均個數×104個(Fw)；
（5）經過質壁分離法獲得的原生質體溶液，l500r／rain下離心8win，沉淀用少量13％甘露醇CPW溶液懸浮，為原生質體溶液；
（6）用吸管取原生質體懸浮液滴兩滴在載玻片上，靜置幾分鐘，使原生質體在載玻片上產生一薄層；
（7）取PEG融合液兩滴，緩慢滴加到載玻片上的原生質體溶液中，再靜置一定時間，觀察載玻片原生質體問的粘連；
（8）每隔5min，用吸管向原生質體液中滴兩滴高Ca2+高pH溶液，共3次；
（9）蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去多余的溶液即成臨時裝片后即可；
（10）所述滲透劑為0．9mol／LNaCI、6％KN03和5％蔗糖溶液的混合液；
（11）原生質體質壁分離的蔗糖濃度為25％、30％、35％、40％、45％。
實施例3。
一種何首烏葉原生質體的制備方法，包括以下步驟：
（1）何首烏葉片經過質壁分離后切成0．5厘米寬的長條，轉入到25％蔗糖溶液中放置8min，在35℃水浴鍋中處理何首烏葉片30win，過濾后得到原生質體溶液；
（2）原生質體經過27％蔗糖溶液洗滌一次，再用13％甘露醇CPW溶液懸浮；
（3）懸浮液原生質體可用牛氏記數板記數和細胞融合；
（4）原生質體得率=記數室大方格原生質體的平均個數×104個(Fw)；
（5）經過質壁分離法獲得的原生質體溶液，l500r／rain下離心8win，沉淀用少量13％甘露醇CPW溶液懸浮，為原生質體溶液；
（6）用吸管取原生質體懸浮液滴兩滴在載玻片上，靜置幾分鐘，使原生質體在載玻片上產生一薄層；
（7）取PEG融合液兩滴，緩慢滴加到載玻片上的原生質體溶液中，再靜置一定時間，觀察載玻片原生質體問的粘連；
（8）每隔5min，用吸管向原生質體液中滴兩滴高Ca2+高pH溶液，共3次；
（9）蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去多余的溶液即成臨時裝片后即可；
（10）所述滲透劑為0．9mol／LNaCI、6％KN03和5％蔗糖溶液的混合液；
（11）原生質體質壁分離的蔗糖濃度為25％、30％、35％、40％、45％。