1.一種分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K2的方法,其特征在于,包括如下步驟:
(1)維生素K2萃取液的獲取
以納豆芽孢桿菌發酵液為維生素K2提取原液,離心獲取菌體,烘干后,采用第一有機溶劑進行萃取以獲取維生素K2萃取液;
(2)維生素K2上柱原液的獲取
將維生素K2萃取液通過膜分離設備除去不溶性雜質,將獲得的維生素K2濾液蒸干,然后以極性有機溶劑重溶,獲取維生素K2上柱原液;
(3)低純度的維生素K2濃縮液的獲取
將維生素K2上柱原液通過大孔吸附樹脂柱吸附,采用濕法或干法上柱,然后以第二有機溶劑清洗,最后用第三有機溶劑進行洗脫,收集相應洗脫液并對其進行濃縮,從而獲取低純度的維生素K2濃縮液;
(4)較高純度的維生素K2濃縮液的獲取
將低純度的維生素K2濃縮液經過分子量排阻層析柱純化,然后以第四有機溶劑進行洗脫,收集相應洗脫液并對其進行濃縮,從而獲取較高純度的維生素K2濃縮液;
(5)高純度的維生素K2的獲取
將較高純度的維生素K2濃縮液溶解于第五有機溶劑后,通過反相硅膠柱分離,然后用第六有機溶劑洗脫并分段收集,即可獲得高純度的維生素K2;
(6)維生素K2晶體的獲取
以第七有機溶劑將維生素K2高溫溶解,低溫結晶,并重結晶,即可獲得維生素K2晶體。
2.根據權利要求1所述的一種分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K2的方法,其特征在于,所述步驟(1)中萃取條件為:萃取方式為靜置萃取或者攪拌萃取,萃取時間20min-60min,萃取次數為1-3次,用于萃取的第一有機溶劑為乙醇、正丁醇、乙酸、二氯甲烷、異戊醇、正己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、四氯化碳、丙酮、乙醚、甲苯中的一種或多種的混合液。
3.根據權利要求1所述的一種分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K2的方法,其特征在于,所述步驟(2)中膜分離設備的膜孔徑≤0.45μm,所述極性有機溶劑為甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、丙酮、水中的一種或幾種的混合液。
4.根據權利要求1所述的一種分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K2的方法,其特征在于,所述步驟(3)中大孔吸附樹脂為非極性和/或弱極性大孔吸附樹脂,所述上柱條件為:高徑比為3-10:1,流速為0.025-0.110倍柱體積/min。
5.根據權利要求1所述的一種分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K2的方法,其特征在于,所述步驟(4)中分子量排阻層析填料所排阻的物質的分子量為400Da-1000Da;所述填料可分別做柱或分幾段裝于同一個分子量排阻層析柱中,層析液按照填料排阻極限由小到大或由大到小的順序依次經過柱填料;所述分子量排阻層析柱高徑比為10-25:1,流速為0.004-0.010倍柱體積/min,層析柱高度與維生素K2濃縮液上液高度比為35-50:1。
6.根據權利要求1所述的一種分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K2的方法,其特征在于,所述步驟(3)中第二有機溶劑為極性有機溶劑,用量為大孔吸附樹脂柱柱體積的1-3倍;所述第三有機溶劑為二氯甲烷、正丁醇、異丁醇、甲苯、庚烷、環戊烷、環己烷、正己烷、石油醚、正戊烷、異戊烷中的一種或幾種的混合液,用量為柱體積的1-4倍;所述步驟(4)中第四有機溶劑為苯、甲苯、四氯化碳、二甲基甲酰胺、酮類、二氯甲烷、二氯代苯、四氯乙烯、四氫呋喃和三氯代苯中的一種或幾種的混合液,其用量為分子量排阻層析柱柱體積的1-4倍。
7.根據權利要求1所述的一種分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K2的方法,其特征在于,所述步驟(5)中第五有機溶劑與第六有機溶劑為極性或弱極性有機溶劑,為甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、丙醇、乙酸丁酯、正丁醇、二氯甲烷、異丁醇中的一種或幾種的混合液;所述反相硅膠柱的硅膠粒徑為10-80μm,高徑比為5-25:1,流速為0.015-0.065倍柱體積/min,柱高與較高純度的維生素K2濃縮液上液高度比為7-30:1。
8.根據權利要求1所述的一種分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K2的方法,其特征在于,所述步驟(6)中第七有機溶劑為含有一定超純水的甲醇或者乙醇;所述超純水的含量為0-30%;所述的高溫溫度范圍為40-85℃,低溫溫度范圍為-40-0℃。
9.根據權利要求1所述的一種分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K2的方法,其特征在于,所述濃縮方法為減壓濃縮,減壓濃縮溫度為40-99℃,真空度小于-0.08MPa;所述蒸干方法為減壓蒸干。
10.根據權利要求1-9任一所述的一種分離純化納豆芽孢桿菌中維生素K2的方法,其特征在于,所述低純度的維生素K2濃縮液的純度為小于50%,較高純度的維生素K2濃縮液的純度為50-80%,高純度的維生素K2的純度為大于80%,維生素K2晶體的純度為大于或等于98.2%。