本發(fā)明涉及微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及到一種新的豬肺炎支原體菌株以及利用這種菌株制作疫苗等多種用途。
背景技術(shù)：
：豬支原體肺炎又稱豬喘氣病，是由豬肺炎支原體引起的一種豬的接觸性慢性呼吸道疾病，呈世界普遍流行。據(jù)資料報(bào)道，世界各地分離的豬肺炎支原體均屬于同一血清型，但分離株之間抗原性有很大差異。1992年Frey首次證實(shí)了豬肺炎支原體分離株之間抗原性的差異；1996年，Artiushin和Minion進(jìn)一步證實(shí)了Frey的觀點(diǎn)；1999年，Kokotovic也同樣證實(shí)了這一結(jié)論。因此，分離出一株抗原性較好的豬肺炎支原體菌株進(jìn)行疫苗和診斷試劑盒應(yīng)用，對(duì)防治豬支原體肺炎至關(guān)重要，特別是分離出一株適合制備滅活疫苗的菌株，將填補(bǔ)國(guó)內(nèi)無自主研發(fā)豬喘氣病滅活疫苗的空白。豬肺炎支原體是豬支原體肺炎的病原體。豬支原體肺炎是豬的一種慢性消耗性呼吸道病，臨床感染率極高。該疾病導(dǎo)致持續(xù)幾周的持續(xù)性咳嗽、被毛失去光澤、生長(zhǎng)遲緩和外觀不壯實(shí)。豬群一旦感染豬肺炎支原體，便難以清除，不僅嚴(yán)重影響豬群的生長(zhǎng)發(fā)育，用藥量增加，而且容易繼發(fā)感染PRRSV(豬藍(lán)耳病病毒)、PCV(豬圓環(huán)病毒)等，從而導(dǎo)致多種疫苗接種失敗。豬肺炎支原體作為豬呼吸道病綜合征的重要病原之一，每年的經(jīng)濟(jì)損失估計(jì)在2億～2.5億美元之間。直接或間接對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，世界上預(yù)防和控制豬肺炎支原體感染的有效的手段是對(duì)豬群進(jìn)行疫苗免疫。大多數(shù)疫苗均為含有佐劑的全菌體滅活疫苗，通常情況下這些疫苗均能提供較好的保護(hù)作用，如改善臨床癥狀，減少肺損傷，減少因豬肺炎支原體感染用藥，提高生長(zhǎng)效率等。目前，廣泛應(yīng)用的疫苗是以豬肺炎支原體J株或P株作為抗原的滅活疫苗，使用J株或P株制備的疫苗在全球很多國(guó)家銷售和使用。然而，由于豬群中的流行株的變異，在臨床上仍能觀察到不同的豬群疫苗免疫后免疫效果方面存在差異，即存在一些免疫效果欠佳的群體。臨床上觀察到的這些差異原因是由于豬群中的流行株與疫苗株間存在抗原差異造成的(Villarreal等，BMCVeterinaryResearch2012，8:2)。有研究表明，目前豬群中流行的毒株在基因水平、蛋白水平以及毒力方面與疫苗使用的豬肺炎支原體J株或P株存在較大的差異(如文獻(xiàn)Stakenborg等，VetMicrobiol2005，109:29-36；Calus等，VetMicrobiol2007，120:284-91.；Vicca等VetMicrobiol2003，97:177-190.；Meyns等，PrevVetMed2004，66:265-275中所報(bào)道的內(nèi)容)。上述文獻(xiàn)資料表明，疫苗使用的豬肺炎支原體J株對(duì)豬支原體肺炎的臨床預(yù)防和治療效果欠佳。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一是提供一種新的豬肺炎支原體菌株，具有良好的免疫原性。為達(dá)上述目的，本發(fā)明的一個(gè)方案中提供了一種豬肺炎支原體菌株，菌株為豬肺炎支原體HP-G菌株MycoplasmahyopneumoniaeHP-Gstrain，該菌株的保藏編號(hào)為CCTCCNO：V2001661。上述豬肺炎支原體HP-G菌株的形態(tài)學(xué)描述如下：菌株接種瓊脂平板，平板上形成細(xì)小圓形、邊緣整齊、似露滴狀、中間致密稍隆起的小菌落；培養(yǎng)物涂片，經(jīng)過瑞氏染色可觀察到具有特征性的多形態(tài)菌體，有點(diǎn)狀、環(huán)狀、球狀和兩極狀。上述豬肺炎支原體HP-G菌株的基因序列如序列表SEQIDNO.1所示?；诒景l(fā)明的豬肺炎支原體HP-G菌株，本發(fā)明還公開了該菌株的多種用途。本發(fā)明的豬肺炎支原體HP-G菌株在制備豬肺炎支原體疫苗中的應(yīng)用。豬肺炎支原體HP-G菌株在制備免疫診斷用試劑盒中的應(yīng)用。豬肺炎支原體HP-G菌株在豬肺炎支原體疫苗效力檢驗(yàn)中的應(yīng)用。效力檢驗(yàn)的應(yīng)用包括將豬肺炎支原體HP-G菌株的培養(yǎng)物進(jìn)行攻毒的步驟。豬肺炎支原體HP-G菌株在制備豬肺炎支原體抗體或高免血清中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是利用豬肺炎支原體HP-G菌株制備成疫苗。對(duì)此，本發(fā)明的另一個(gè)方案是公開一種豬肺炎支原體疫苗，包括將豬肺炎支原體HP-G菌株處理制備成的抗原疫苗，并且在優(yōu)化的方案中，疫苗中還包括佐劑；佐劑可以選擇現(xiàn)有技術(shù)中任意一種或者多種試劑的組合物，佐劑的功能主要包括：增強(qiáng)疫苗抗原的免疫原性；促進(jìn)細(xì)胞免疫和體液免疫，優(yōu)化免疫應(yīng)答，促進(jìn)免疫能力較弱人群中的免疫應(yīng)答；增進(jìn)抗原與黏膜之間的傳遞以及免疫接觸；減少疫苗成分中抗原的需求量以及在實(shí)施過程中的免疫接種次數(shù)；優(yōu)化抗原結(jié)構(gòu)，維持抗原構(gòu)象等。佐劑的種類豐富，根據(jù)其功能，可分為運(yùn)載傳遞系統(tǒng)和免疫刺激性佐劑。佐劑包括運(yùn)載體即能與半抗原結(jié)合的一類具有免疫原性質(zhì)的物質(zhì)，還包括對(duì)整個(gè)疫苗系統(tǒng)起運(yùn)輸傳遞和襯托作用的一類物質(zhì)。根據(jù)佐劑的來源，佐劑可以為為細(xì)菌性、非細(xì)菌性、微生物性、細(xì)胞因子類以及合成體類等。根據(jù)理化性質(zhì)，佐劑可以為顆粒性、凝膠性、乳膠佐劑等。跟據(jù)其性能，佐劑可以為治療性佐劑、免疫刺激性佐劑、黏膜佐劑以及基因佐劑等。此外，本發(fā)明還公開了一種制備豬肺炎支原體疫苗的方法，包括將豬肺炎支原體HP-G菌株滅活處理的步驟。綜上所述，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的豬肺炎支原體HP-G菌株經(jīng)過測(cè)序和同源性分析，與已知的疫苗菌株同源性高達(dá)98.4％以上，相比現(xiàn)有的菌株具有更顯著的免疫原性，能夠使肺炎病變減少率顯著提高，增強(qiáng)豬自身的免疫能力，減少發(fā)病率。附圖說明圖1為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例HP-G株P(guān)CR鑒定擴(kuò)增結(jié)果；其中，1為MakerIII；2代表培養(yǎng)傳代培養(yǎng)物；3代表攻毒后再分離培養(yǎng)的培養(yǎng)物；4代表J株。圖2為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例同源性分析結(jié)果圖。具體實(shí)施方式1材料1.1、發(fā)病豬病料：在全國(guó)各地采集臨床癥狀與豬喘氣病相似，疑似為豬支原體肺炎感染的病豬，無菌采取具有典型的豬支原體肺炎病變的肺臟15個(gè)。1.2、菌株來源標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照菌株：豬肺炎支原體濟(jì)南系強(qiáng)毒株CVCC354，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保存和供應(yīng)。實(shí)驗(yàn)株：豬肺炎支原體HP-G菌株，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，保藏日期:2016年12月6日，保藏號(hào)為CCTCCNO：V2001661。1.3、培養(yǎng)基：改良A26培養(yǎng)基由四川省華派生物制藥有限公司配制，培養(yǎng)基的處方以及配置方法如下：培養(yǎng)基制備方法：將上述成份混勻，于121℃，20分鐘高壓滅菌；待培養(yǎng)基溫度下降到37℃時(shí)，加入20％無特異性抗體豬血清(56℃滅活30分鐘)160ml，青霉素(250單位/ml)20萬，用NaOH調(diào)pH值至7.5～7.6。1.4、主要試劑：2×TaqPCRMasterMix、MakerIII，購自TIANGEN生物科技公司；豬肺炎支原體間接血凝檢測(cè)試劑，由四川省華派生物制藥有限公司制造；乳化劑28VG，購自seppic公司。豬肺炎支原體間接血凝檢測(cè)試劑：凍干的10％抗原致敏紅細(xì)胞，使用時(shí)用1/15mol/LPBS(pH值7.2)稀釋至2％抗原致敏紅細(xì)胞，供作IHA檢驗(yàn)用。1.5、試驗(yàn)豬：14～21日齡健康易感豬，由四川省華派生物制藥有限公司定點(diǎn)豬場(chǎng)提供，經(jīng)豬肺炎支原體間接血凝檢測(cè)豬肺炎支原體抗體為陰性(≤1:4)。1.6間接血凝的材料凍干的10％抗原致敏紅細(xì)胞，使用時(shí)用1/15mol/LPBS(pH值7.2)稀釋至2％抗原致敏紅細(xì)胞，供作IHA檢驗(yàn)用。陽性、陰性對(duì)照血清，2～8℃或凍結(jié)保存。微量反應(yīng)板：為96孔V型有機(jī)玻璃板或塑料板。稀釋劑：含1％健康兔血清(56℃，30分鐘滅活)的1/15mol/LPBS(pH值7.2)。1.7操作方法1.71待檢血清的處理：待檢血清經(jīng)56℃滅活30分鐘。1.72加PBS稀釋劑：反應(yīng)板每一孔中各加稀釋劑25μl。1.73稀釋血清：在第一列孔分別加待檢血清、陽性、陰性血清各25μl，然后倍比稀釋至第6孔，最后棄去25μl。1.74加抗原致敏紅細(xì)胞：每孔加2％抗原致敏紅細(xì)胞25μl；抗原對(duì)照25μl稀釋劑+25μl抗原致敏紅細(xì)胞。1.75反應(yīng)：加樣完畢，置微型振蕩器上振蕩15秒左右，室溫下靜置1～2小時(shí)判定結(jié)果。1.76判定：當(dāng)陽性血清效價(jià)≥1:64，陰性血清效價(jià)≤1:4，抗原致敏紅細(xì)胞對(duì)照孔無自凝時(shí)試驗(yàn)成立。以呈現(xiàn)(++)血凝反應(yīng)的血清最高稀釋度作為血清效價(jià)終點(diǎn)。當(dāng)待檢血清效價(jià)≥1:16時(shí)，判為陽性；血清效價(jià)≤1:8時(shí)，判為陰性。1.77判定標(biāo)準(zhǔn)：以呈現(xiàn)(++)血凝反應(yīng)的血清最高稀釋度作為血清效價(jià)終點(diǎn)。2實(shí)驗(yàn)株的分離：2.1、病料的處理使用無菌手術(shù)剪取試驗(yàn)豬發(fā)病部位的邊緣組織，將邊緣組織剪碎成芝麻粒大小，然后分別浸泡入15管改良A26培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)基顏色變黃時(shí)傳代，再進(jìn)行病料分離鑒定。2.2、病料的分離鑒定2.2.1培養(yǎng)特性的觀察：將2.1中培養(yǎng)的15管菌液，分別傳代至A26液體培養(yǎng)基和A26瓊脂平板，對(duì)各分離菌在兩種培養(yǎng)狀態(tài)下的培養(yǎng)特性進(jìn)行觀察。2.2.2染色鏡檢：取培養(yǎng)物進(jìn)行涂片，用革蘭氏染色液和瑞氏染色液進(jìn)行染色觀察。本發(fā)明的菌株在接種瓊脂平板后，能夠在平板上形成細(xì)小圓形、邊緣整齊、似露滴狀、中間致密稍隆起的小菌落；培養(yǎng)物涂片，經(jīng)過瑞氏染色可觀察到具有特征性的多形態(tài)菌體，有點(diǎn)狀、環(huán)狀、球狀和兩極狀。因此，在培養(yǎng)過程中具有上述形態(tài)的菌落為本發(fā)明的豬肺炎支原體HP-G菌株。2.3豬肺炎支原體純化菌株的鑒定將2.2中已選定的流行性豬肺炎支原體菌株，進(jìn)一步鑒定驗(yàn)證，方法如下：2.3.1PCR鑒定根據(jù)Genbank中公布的豬肺炎支原體P36基因組序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，并提交給Invitrogen合成，引物序列為：P1：5-TTACAGCGGGAAGACC-3’，P1：5’-CGGCGAGAAACTGGATA-3’。將選出經(jīng)培養(yǎng)傳代試驗(yàn)和染色鏡檢試驗(yàn)鑒定為豬肺炎支原體的培養(yǎng)物按文獻(xiàn)方法提取基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后取上述產(chǎn)物5ul在在1％瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。PCR鑒定結(jié)果：將初步證明為肺炎支原體的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果與豬肺炎支原體J株P(guān)CR的擴(kuò)增結(jié)果大小一致，并與預(yù)期片段427bp大小一致的菌株為肺炎支原體。2.3.2血清學(xué)鑒定2.3.2.1代謝抑制試驗(yàn)取不含血清的A26培養(yǎng)基，按20％比例加入兔抗豬肺炎支原體J株高免血清，按1:5培養(yǎng)基容量接種分離菌株培養(yǎng)物，分裝5支試管，2ml/支，同時(shí)設(shè)立加入20％健康兔血清和豬支原體肺炎陰性健康豬血清的A26培養(yǎng)基作為對(duì)照，分裝5支試管，37℃培養(yǎng)13d，進(jìn)行代謝抑制試驗(yàn)，觀察培養(yǎng)基顏色變化情況，鑒定分離菌株是否為豬肺炎支原體。代謝抑制試驗(yàn)結(jié)果：將經(jīng)過PCR鑒定的肺炎支原體的培養(yǎng)物加入兔抗豬肺炎支原體J株高免血清的培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)13d，能觀察到懸浮細(xì)小顆粒，油鏡檢查有少量具有支原體特征的菌體，培養(yǎng)液顏色和pH值均無變化。而經(jīng)過PCR鑒定的肺炎支原體的分離菌培養(yǎng)物加入20％健康兔血清和豬支原體肺炎陰性健康豬血清的A26培養(yǎng)基，觀察到培養(yǎng)液顏色由紅色變?yōu)辄S色，pH值由7.6～7.5下降到7.0以下，鏡檢有大量支原體菌體存在。2.3.2.2生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)用新制備的厚度不少于4mm的A26瓊脂平板3塊，使其揮發(fā)去多余水分。將對(duì)數(shù)期的支原體肉湯培養(yǎng)物稀釋100～1000倍，其濃度大約為1.0×106CCU/mL，取100μL接種于瓊脂平板上，涂布均勻，放置片刻。用滅菌鑷子將預(yù)先準(zhǔn)備好的抗血清濾紙片(直徑6mm，無菌濾紙片已吸附1滴抗豬肺炎支原體J株血清，干燥)貼附于接種后的平板上，紙片間距1.5～2.0cm，每塊平板放置3張抗血清的試驗(yàn)紙片，另設(shè)1張無血清空白紙片對(duì)照，培養(yǎng)7～10d。在低倍鏡下，測(cè)量抗血清紙片的抑菌圈直徑。判定標(biāo)準(zhǔn)為：直徑大于1.0mm為陽性；小于0.5mm為陰性；介于二者之間時(shí)，可降低培養(yǎng)基中血清或酵母浸液濃度重復(fù)1次。生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)結(jié)果：3組分離菌分別培養(yǎng)的A26的瓊脂平板上，各抗豬肺炎支原體J株血清紙片周圍，均可明顯觀察到抑菌圈，抑菌圈直徑2.3mm～2.8mm之間，而對(duì)照紙片周圍不能觀察到抑菌圈，結(jié)果見下表1。表1：3組分離菌株各生長(zhǎng)抑制圈大小實(shí)驗(yàn)菌株第一組第二組第三組對(duì)照紙片紙片1(mm)2.32.62.60紙片2(mm)2.22.52.60紙片3(mm)2.52.82.70抑菌圈直徑(mm)2.32.62.602.3.3分離菌株毒力檢測(cè)試驗(yàn)組組數(shù)由分離菌株鑒定出的豬肺炎支原體株數(shù)數(shù)定，A26培養(yǎng)基為對(duì)照組。每組5頭豬，試驗(yàn)組胸腔注射3ml，氣管注射2ml，共5ml的菌液稀釋液(1×107CCU/ml)，對(duì)照組以同樣的方式胸腔3ml、氣管2ml，共5ml的A26培養(yǎng)基，攻毒后隔離飼養(yǎng)，連續(xù)觀察25～30日后，對(duì)所有試驗(yàn)豬進(jìn)行剖殺，觀察肺部病理變化，參照Goodwin55分計(jì)分法對(duì)各試驗(yàn)豬的肺部喘氣病病變進(jìn)行評(píng)分。選3株分離毒株分別進(jìn)行毒力試驗(yàn)，將健康易感豬20頭，分為4組，每組5頭，其中對(duì)照組注射A26培養(yǎng)基，攻毒試驗(yàn)組3組，分別注射3組(第一組、第二組、第三組)分離株的新鮮培養(yǎng)物，攻毒試驗(yàn)豬攻毒后出現(xiàn)食欲不振，精神不佳，10～16日內(nèi)出現(xiàn)咳嗽、喘氣等臨床癥狀，個(gè)別攻毒試驗(yàn)豬有發(fā)熱的現(xiàn)象，而對(duì)照組豬均未表現(xiàn)出任何不良反應(yīng)。攻毒后25～30日剖檢攻毒豬，可見肺臟的尖葉、心葉、中間葉或膈葉前緣有不同程度的特征性的支原體肺炎病變，呈“胰樣變”或“肉樣變”，對(duì)各試驗(yàn)豬肺部病變按Goodwin55分計(jì)分法計(jì)分，病變?cè)u(píng)分見表2。從表2可以看出，3組攻毒豬均出現(xiàn)不同程度的肺部病變，與對(duì)照組肺部病變差異顯著，說明本發(fā)明的菌株毒力較好且相當(dāng)。表2試驗(yàn)豬肺炎病變?cè)u(píng)分2.3.4攻毒豬病變肺中支原體的再分離同2.1的方法從攻毒豬病變肺中進(jìn)行豬肺炎支原體的再分離和鑒定。結(jié)果：將攻毒病變豬肺按2.1的方法再分離。傳代培養(yǎng)后顯示pH值下降；涂片染色鏡檢具有特征性的多形態(tài)菌體，有點(diǎn)狀、環(huán)狀、球狀和兩極狀，無雜菌污染；PCR擴(kuò)增，結(jié)果與豬肺炎支原體J株P(guān)CR的擴(kuò)增結(jié)果大小一致，并與攻毒前片段427bp大小一致。2.3.5各分離菌株免疫原性測(cè)定將分離鑒定出的菌株純培養(yǎng)物進(jìn)行滅活乳化配制。每株分別取14～21日齡健康易感豬(豬肺炎支原體血清抗體陰性)，每個(gè)分離菌株免疫5頭，各頸部肌肉注射疫苗1.0ml，接種后14日按相同劑量和方式加強(qiáng)接種1次，另外5頭不接種作為對(duì)照，同條件下飼養(yǎng)。首次接種后55～60日，連同對(duì)照組5頭，各氣管注射100MID的豬肺炎支原體濟(jì)南系強(qiáng)毒CVCC354凍干肺組織毒，觀察25～30日，剖殺全部試驗(yàn)豬。按Goodwin55分計(jì)分法對(duì)各試驗(yàn)豬的肺炎病變進(jìn)行評(píng)分，并計(jì)算肺部病變平均分及肺部病變減少率。實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果：將免疫組試驗(yàn)豬分為3組，每組5頭，分別免疫由3株(J株、AV747株、HP-G)分離菌株分別配制的疫苗，按2.3.5方法免疫，免疫注射后，未發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)豬有任何不良反應(yīng)，采食和精神狀態(tài)均良好，首免55～60日后對(duì)所有試驗(yàn)豬進(jìn)行攻毒，連續(xù)觀察25～30日，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組試驗(yàn)豬攻毒后出現(xiàn)食欲不振，精神不佳，7～14日內(nèi)出現(xiàn)咳嗽、喘氣等臨床癥狀，免疫組中AV747株試驗(yàn)組有3頭豬出現(xiàn)咳嗽等呼吸道癥狀，只有2/5保護(hù)，而J株試驗(yàn)組有2頭豬出現(xiàn)咳嗽等呼吸道癥狀，呈3/5保護(hù)，HP-G試驗(yàn)組所有免疫豬未見任何不良反應(yīng)，采食和精神狀態(tài)均良好，5/5保護(hù)。攻毒28日后，對(duì)所有豬進(jìn)行剖殺，觀察肺部病變，按Goodwin55分計(jì)分法對(duì)肺部病變計(jì)分，并計(jì)算肺炎病變減少率，結(jié)果見表3。從表3中可以看出免疫AV747株的試驗(yàn)組中，試驗(yàn)豬肺部病變最嚴(yán)重，其次為J株，而HP-G株試驗(yàn)豬肺部病變幾乎不明顯，其病變較少率更是高達(dá)84.2％，具有很好的免疫原性。表3試驗(yàn)豬肺炎病變減少情況通過以上試驗(yàn)得知，我們從15株全國(guó)疑似豬肺炎支原體的病料中，最終分離鑒定出HP-G株豬肺炎支原體菌株，HP-G株的免疫原性都較現(xiàn)有技術(shù)中其他兩株好，所以可以選定HP-G為支原體肺炎疫苗研制的疫苗株。2.4疫苗株序列分析通過2.3試驗(yàn)，將HP-G株做為疫苗株，將該疫苗株的培養(yǎng)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并與GenBank中的4個(gè)國(guó)際主要代表疫苗株相應(yīng)的序列進(jìn)行序列分析和同源性分析。用于比較的參考毒株名稱及其在GenBank中的登陸號(hào)為：J(NCO07295)、168(NC017509)、232(NC006360)、7448(NC007332)。將基本選定支原體肺炎疫苗研制疫苗株的HP-G進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見圖1，并送Invitrogen公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI-Blast和DNAStar比對(duì)分析，豬肺炎支原體HP-G菌株的基因序列如序列表SEQIDNO.1所示。HP-G的序列分別J株、168株、232株、7448株相比，個(gè)別堿基有差別，與J株序列(基因號(hào)：NC007295)比對(duì)發(fā)現(xiàn)在第8個(gè)堿基出多一個(gè)G堿基，第134、224、341個(gè)堿基處不一致；與168株序列(基因號(hào)：NC017509)反向互補(bǔ)，并在第8個(gè)堿基出多一個(gè)G堿基，第134、224、341、382個(gè)堿基處不一致；與232株序列(基因號(hào)：NC006360)，并在第8個(gè)堿基出多一個(gè)G堿基，在第27、134、171、224、341、350個(gè)堿基處不一致；與7448株序列(基因號(hào)：NC007332)比對(duì)，在第8個(gè)堿基出多一個(gè)G堿基，在第134、224、341、381個(gè)堿基處不一致。2.5同源性分析將本發(fā)明的支原體肺炎疫苗研制疫苗株的HP-G與NCBI基因庫選出4株國(guó)內(nèi)外參考菌株的基因進(jìn)行同源性比對(duì)，比對(duì)結(jié)果如圖2。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI-Blast和DNAStar比對(duì)分析，目的序列與J株序列(基因號(hào)：NC007295)同源性為99.1％；與168株序列(基因號(hào)：NC017509)的同源性為98.8％；與232株序列(基因號(hào)：NC006360)的同源性為98.4％；與7448株序列(基因號(hào)：NC007332)的同源性為98.8％。序列分析及同源性分析結(jié)果表明，基本選定的HP-G株與國(guó)內(nèi)外支原體肺炎參考疫苗株同源性在99％以上，故可以將選定的HP-G作為支原體肺炎疫苗研制的疫苗株。本發(fā)明還公開了將HP-G菌株用于制備成抗原疫苗以及該疫苗的制備方法，疫苗的制備方法中包括了將HP-G株滅活的步驟，也包括添加佐劑的步驟。此外，本發(fā)明得疫苗滅活方法和疫苗的制備方法可以選擇現(xiàn)有技術(shù)中任意一種方法，也可選擇任意一種其他方法?；诒景l(fā)明的豬肺炎支原體HP-G菌株，本發(fā)明還公開了該菌株的多種用途。例如本發(fā)明的豬肺炎支原體HP-G菌株在制備豬肺炎支原體疫苗中的應(yīng)用；豬肺炎支原體HP-G菌株在制備免疫診斷用試劑盒中的應(yīng)用；豬肺炎支原體HP-G菌株在豬肺炎支原體疫苗效力檢驗(yàn)中的應(yīng)用；效力檢驗(yàn)的應(yīng)用包括將豬肺炎支原體HP-G菌株的培養(yǎng)物進(jìn)行攻毒的步驟；豬肺炎支原體HP-G菌株在制備豬肺炎支原體抗體或高免血清中的應(yīng)用。這些應(yīng)用不局限于本發(fā)明所指的具體形式，這些應(yīng)用的具體實(shí)施方式可以采用現(xiàn)有的任意一種使用、檢驗(yàn)或者鑒定、制備方式。SEQUENCELISTING<110>四川省華派生物制藥有限公司<120>一種豬肺炎支原體菌株、疫苗及其應(yīng)用<130>無<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>428<212>DNA<213>豬肺炎支原體（M.hyopneumoniae）<400>1ttacagcggggaagaccacaaaaaccgggtgaaactcggcttgaattagtagctgataac60atccgaattatccgggaaattgcactaaaagtcaaagaaagtggctttagtggaataagt120attattgttgctagtcctgttgatataattacaagggcttaccgggatgcatctggattt180tccgatcaaaaagttatcggtagtggaactgttttagatacagtaaggcttcaatttgca240atcgcaaaaagagcaaaagtatcgcctaattcggttcaggcctacgtgatgggtgaacat300ggtgattcatcttttgttgcttattcaaatattaaaattggcggtgaatgtttctgtgct360tattctaaactaaccggaattgatagctcaaattacgaaaaagaacttgaatatccagtt420tctcgccg428當(dāng)前第1頁1 2 3